Summary
Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.
Abstract
De prevalentie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), is in de laatste decennia gegroeid. Deze leeftijd-geassocieerde aandoeningen worden gekenmerkt door het verschijnen van eiwit-aggregaten met fibrillary structuur in de hersenen van deze patiënten. Precies de reden waarom normaal oplosbare eiwitten ondergaan blijft een aggregatie proces slecht begrepen. De ontdekking dat de aggregatie van eiwitten niet beperkt tot ziekteprocessen is en deel van het normale verouderingsproces schakelt alleen de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, regelen zonder het gebruik van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten. Hier beschrijven we methoden te onderzoeken die inherent zijn aan eiwit aggregatie in Caenorhabditis elegans door complementaire benaderingen. Ten eerste, we onderzoeken hoe om te groeien van grote aantallen van leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans om leeftijd dieren en presenteren we de biochemische procedures voor het isoleren van hoogst-onoplosbare-grote aggregaten. In combinatie met een gerichte genetische knockdown, is het mogelijk om te ontleden de rol van een gen van belang in de bevordering van of voorkomen van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie met behulp van een uitgebreide analyse met kwantitatieve massaspectrometrie of een kandidaat-gebaseerde analyse met antilichamen. Deze bevindingen worden vervolgens bevestigd door in vivo analyse met transgene dieren uiting van TL-gelabeld aggregatie-naar voren gebogen eiwitten. Deze methoden moeten helpen uitleggen waarom bepaalde eiwitten zijn gevoelig voor aggregaat met de leeftijd en uiteindelijk hoe deze eiwitten volledig functioneel te houden.
Introduction
Eiwit misfolding en aggregatie worden herkend als een stempel van verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals AD, PD, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Frontotemporale dementie (FTD) en vele anderen. Bijvoorbeeld, α-synuclein assemblages in amyloïde fibrillen die zich ophopen als Lewy organen met name in de substantia nigra van PD-patiënten, terwijl in ALS patiënten TDP-43 of FUS misfold naar formulier cytoplasmatische aggregaten in degenererende motorische neuronen. In elk van deze neurodegeneratieve aandoeningen mislukken mechanismen onderhoud eiwit homeostase of proteostasis om te voorkomen dat de accumulatie van misfolded eiwitten, daarom leiden tot ziekte.
Proteostasis is van cruciaal belang om ervoor te zorgen de cellulaire functies en onder normale omstandigheden deze regulerende mechanismen strak controle over het tempo van de eiwitsynthese, vouwen en afbraak. Verschillende studies tonen aan dat met de vergrijzing, de mogelijkheid van vele cellen en organen voor het behoud van eiwit homeostase geleidelijk in het gedrang komt en de fysiologische verslechtering van de netwerken van de proteostasis met de leeftijd is een belangrijke verzwarende factor voor neurodegeneratieve ziekten (herzien in verwijzingen1,2,3). Het feit dat de controle van de kwaliteit van het eiwit en de cellulaire reactie op stress ongevouwen eiwitten in gevaar met de leeftijd komen suggereert dat eiwit misfolding en aggregatie zou een algemene gevolg van veroudering. Inderdaad, wij en anderen hebben aangetoond dat eiwitten aggregatie beperkt zich niet tot ziekte en in plaats daarvan deel van het proteoom zeer wasmiddel-onoplosbaar in leeftijd dieren4,5,6,7 wordt ,8,9,10. Rekentijd en in vivo onderzoek bleek dat deze fysiologische leeftijdsgebonden aggregaten lijken op ziekte aggregaten in verschillende aspecten5. De ontdekking van endogene, leeftijd-afhankelijke eiwitten aggregatie geeft ons de mogelijkheid om te ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, zonder gebruik te maken van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten reguleren. Op dit moment bestaat slechts beperkte informatie over de regulering van de wijdverbreide eiwit oplosbaarheid en over de gevolgen van deze disregulatie voor de gezondheid van het organisme.
De nematode C. elegans is een van de meest uitgebreid bestudeerde modelorganismen in onderzoek veroudering en deze dieren hebben een relatief korte levensduur vele karakteristieke veroudering eigenschappen waargenomen in hogere organismen tonen. De effecten van veroudering op de oplosbaarheid van eiwitten zijn bestudeerd in C. elegans door sequentiële biochemische fractionering gebaseerd op differentiële oplosbaarheid, die veel gebruikt wordt om uit te pakken van ziekte aggregaten op het gebied van neurodegeneratie onderzoek11 . Door kwantitatieve massaspectrometrie, werden verscheidene honderden eiwitten tot aggregatie-naar voren gebogen in C. elegans in de afwezigheid van ziekte5getoond. Hier beschrijven we in detail het protocol om te groeien van grote aantallen wormen in vloeibare cultuur en de sequentiële winning isoleren geaggregeerde eiwitten voor kwantificering massaspectrometrie en analyse door westelijke vlek. Omdat misfolded en aggregatie-naar voren gebogen eiwitten zich in leeftijd ophopen C. elegans gonaden en maskers veranderingen in andere somatische weefsels5,12,13, gebruiken we een mutant gonaden-minder te richten de analyse op eiwit oplosbaarheid in niet-reproductieve weefsels. De methode gepresenteerd maakt de analyse van zeer onoplosbare, grote aggregaten die onoplosbaar in 0,5% SDS en Ingehuld door relatief lage centrifugaal snelheid. U kunt ook een minder strenge extractie-protocol verzamelen ook kleinere en meer oplosbare aggregaten is gepubliceerd elders10. Daarnaast beschrijven we de methode gebruikt om te beoordelen aggregatie in vivo in C. elegans.
Over het algemeen kunnen deze methoden in combinatie met RNA-interferentie (RNAi) de rol van een gen van belang bij het moduleren van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie evalueren. Hiervoor beschrijven we de analyse van de fragmenten van jonge en oude wormen met en zonder knockdown van een specifieke proteïne van belang met behulp van RNAi. Deze methoden moeten een krachtig hulpmiddel om te bepalen welke onderdelen van het netwerk proteostasis reguleren eiwit oplosbaarheid. Verschillende interventies zoals verminderd insuline/insuline-achtige groei factor (IGF) 1 signalering (IIS) is gebleken dat C. elegans veroudering14dramatisch te vertragen. Levensduur trajecten veroorzaken vaak eiwit-kwaliteit controlemechanismen en dus deze trajecten kunnen worden actief beïnvloeden het tarief van aggregatie van eiwitten. Als voorbeeld tonen we verminderde inherente eiwit aggregatie in langlevende dieren op remming van het traject van IIS7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Voor een beter begrip van de procedure, een schematische voorstelling van de werkstroom (Figuur 1) is gehecht.
1. de groei van de grote getallen voor jong en ouder C. elegans onderworpen aan het RNAi richten een gen van belang
Opmerking: Gebruik C. elegans temperatuur-geïnduceerde steriele gon-2(q388) mutanten (CF2253) te verkrijgen van grote populaties van de leeftijd-gesynchroniseerd. Tijdens alle stappen is het belangrijk om te werken onder semi-steriele omstandigheden met een open vlam en om te controleren dat er geen verontreinigingen (bijvoorbeeld met schimmels of bacteriën) aanwezig zijn. Voer de stappen (ook centrifugations) bij kamertemperatuur, indien de temperatuur wordt niet beschreven.
- Bereiding van C. elegans gon-2(-) mutanten te verkrijgen gonaden-minder dieren
Opmerking: Voor het verkrijgen van steriele dieren gonaden ontbreekt, de verlies-of-function mutatie moet worden geïnduceerd in de moederdieren door verschuift deze bij de laatste larvale stadium (L4) tot 25 ° C om te voorkomen dat de bijdrage van de moeders.- Eerste uitbreiding van de gon-2(-) dieren te verzamelen van ouderlijke generatie voor temperatuur verschuiving
- Streak Escherichia coli OP50 stam op een bord lysogenie Bouillon (LB) en het 's nachts Incubeer bij 37 ° C.
- De volgende dag beënten 200 mL LB medium met een kloon van de OP50 en het 's nachts Incubeer bij 37 ° C.
- De volgende dag zaad 15 hoge groei (HG) middellange platen (diameter 9 cm) met 0,5 mL OP50 en OP50 te verspreiden met een spatel. Houd de platen bij kamertemperatuur voor twee dagen.
- Gon-2(-) dieren (niet uitgehongerd voor de laatste twee generaties) stuk op middellange borden 15 HG bezaaid met OP50 en handhaven bij 20 ° C tot de platen confluente met volwassenen worden en sommige OP50 nog steeds beschikbaar is.
- In de tussentijd zaad 60 HG middellange platen met OP50 zoals beschreven in stap 1.1.1.3 en houden de platen bij kamertemperatuur. Voorzichtig: Geplaatste platen moeten niet worden gehouden voor meer dan een week als de agar bij kamertemperatuur kraken zullen.
- De confluente platen bleekmiddel zodra de meeste volwassenen starten om eieren te leggen als eerder beschreven15. Verzamelen van eieren in twee 15 mL-buizen en plaats op een nutating mixer's nachts bij 20 ° C.
- De volgende dag wassen uitgebroed L1s met M9 buffer (85 mM NaCl, 42 mM nb2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): centrifuge op 3000 x g voor 30 s, negeren het supernatant en vul tot de maatstreep aan 15 mL met M9. Centrifugeer, verwijder het supernatant en herhaal de stap 1.1.1.6. Vul de buizen met de resulterende worm pellets tot de maatstreep aan 15 mL met M9.
- Het totale aantal L1s met een dissectie Microscoop evalueren door het tellen van de L1s aanwezig in 2 µL druppels op niet-geplaatste agar platen geplaatst. Het gemiddelde van de getallen verkregen ten minste negen druppels.
- Het toevoegen van 6.500 L1s per geplaatste HG plaat en laat die de wormen groeien bij 20 ° C tot L4 fase.
- Tweede uitbreiding van gon-2(-) dieren te verkrijgen gonaden-minder dieren voor experiment
- L4 stadium, verschuiving van de wormen uit stap 1.1.1.9 tot 25 ° C tot ze beginnen om eieren te leggen en L1s zijn broedeieren.
- Verzameling van eieren en L1s door sedimentatie
Opmerking: Na de verschuiving van de temperatuur tot 25 ° C is het beter gebruiken van sedimentatie als een zachte techniek om te scheiden van de kwetsbare eieren en L1s van de volwassenen.- De platen met M9 wassen met behulp van 5 mL M9 per vijf platen. Breng de wormen in 50 mL tubes.
- Vul alle buizen tot de maatstreep aan 45 mL met M9, laat het sediment volwassenen voor ongeveer 10 min, verzamelen van elke bovendrijvende substantie in een tube van 50 mL en herhaal deze stap met de pellet. Centrifugeer het supernatant waarin eieren en L1s bij 3000 x g gedurende 1 minuut, laat het sediment L1s gedurende ongeveer 10 minuten en verwijder het supernatant tot 15 mL zitten.
Opmerking: Dit is een cruciale stap. Verwijder de bovendrijvende substantie te vroeg, niet voor het verzamelen van zo veel L1s mogelijk. - Plaatsen van de buizen met eieren en L1s op een nutating mixer's nachts bij 25 ° C.
- Eerste uitbreiding van de gon-2(-) dieren te verzamelen van ouderlijke generatie voor temperatuur verschuiving
- Vloeibare cultuur van gonaden-minder dieren te verzamelen van jonge en oude dieren onderworpen aan RNAi gericht op een gen van belang
Opmerking: De reactie van sommige genen op RNAi kunnen temperatuur afhankelijk als eerder beschreven16. Als alternatief voor RNAi, kan een gemuteerde gen in de achtergrond gon-2(-) worden opgenomen.- Voorbereiding van bacteriën van vloeibaar cultuur
- OP50 en RNAi bacteriën (bacteriën produceren van de gewenste dsRNA en bacteriën met de lege vector als besturingselement) voor te bereiden door het enten van 4 L LB medium met 12 mL van de respectieve bacteriecultuur (Voeg een eindconcentratie van 50 µg Mo/mL carbenicillin en 1 mM IPTG aan de RNAi bacteriële culturen) en hen Incubeer bij 37 ° C's nachts bij 180 t/min.
- De volgende dag oogst de culturen bij 6.700 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 60 mL ijskoud S basale media (100 mM NaCl, 50 mM kalium fosfaat pH 6, gehouden op ijs). Houden van de drie geresuspendeerde pellets (OP50, controle van RNAi bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang) bij 4 ° C tot stap 1.2.2 of 1.2.3.
Opmerking: Wormen kunnen worden gekweekt op RNAi vanaf L1 stadium (zie stap 1.2.3) of om te voorkomen dat ontwikkelings defecten van de laatste larvale stadium L4 (zie stap 1.2.2).
- Vloeibare cultuur voor behandeling met RNAi beginnen eindelijk larvale stadium L4
- Voeg 200 mL S basale media in een maatkolf van Fernbach cultuur (capaciteit 2800 mL). Voor een definitieve cultuur volume van 300 mL (zie 1.2.2.4), voeg van 10 mM kaliumcitraat, pH 6, 3 mL Trace metalen oplossing (5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 2.5 mM FeSO4,2MnCl 1 mM, 1 mM ZnSO4, 0.1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL carbendazim en 5 µg Mn/mL cholesterol). Sluit de kolf of fles met een schroefdop membraan. Zie tabel 1 voor recepten van buffers.
- De L1s uit de 25 ° C (stap 1.1.2.2.3) nemen en deze overbrengen naar 15 mL tubes. Centrifugeer bij 1.900 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en tellen de L1s per 2 µL zoals in stap 1.1.1.8. Voeg 500.000 L1s in de Fernbach cultuur kolf bereid in de vorige stap.
- OP50 (uit stap 1.2.1) evenredig aan het aantal wormen toevoegen. Bijvoorbeeld voor 500.000 wormen Voeg 60 mL OP50.
- Volledige worm cultuur met S basale toe zodat het totale volume 300 mL. Incubeer de worm cultuur tot L4 fase bij 25 ° C in een schudden incubator met 150 t/min.
- De volgende dag, moet de wormen de grootte van de wild-type L4s. U kunt overschakelen OP50 naar RNAi bacteriën, verzamelen van dieren in zes 50 mL-buizen, laten sediment en verwijder het supernatant. Wassen van de L4s met M9 te verwijderen van de resterende OP50 bacteriën: Centrifugeer bij 1900 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en breng alle L4s in een 50 mL-buis. Tellen de L4s per 5 µL (ten minste negen keer). Twee keer 50.000 L4s zijn nodig voor de jonge worm collectie en twee keer 100.000 L4s nodig zijn voor de leeftijd worm-collectie.
- Bereiden vier Fernbach cultuur kolven zoals beschreven in 1.2.2.1. Ook een eindconcentratie van 50 µg/mL Carbenicillin en 1 mM IPTG Voeg aan elke maatkolf toe.
- Besturingselement RNAi toevoegen bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang (uit stap 1.2.1) proportioneel met het aantal wormen: Voeg 7 mL van de respectieve bacteriën per kolf voor jonge wormen en 14 mL per kolf gedurende de leeftijd wormen.
- 50.000 wormen per kolf gedurende de jonge worm collectie en 100.000 wormen per kolf gedurende de leeftijd worm-collectie toevoegen en vult u de culturen met S basale te vullen tot 300 mL. Incubeer de worm culturen (vier in totaal) bij 25 ° C en 150 rpm.
- Vloeibare cultuur voor behandeling met RNAi basisgewicht van L1 fase
- Bereiden van vier Fernbach cultuur kolven zoals beschreven in 1.2.2.1 en voeg een eindconcentratie van 50 µg Mo/mL carbenicillin en 1 mM IPTG.
- Doorgaan met de voorbereiding van de L1s zoals beschreven in 1.2.2.2. In totaal zijn 300.000 wormen nodig om ze opsplitsen in vier kolven.
- Besturingselement RNAi toevoegen bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang (uit stap 1.2.1) evenredig aan het aantal wormen zoals beschreven in stap 1.2.2.7 en houd ook rekening met de groeifase tussen de fase L1 en L4: Voeg 13 mL van de respectieve bacteriën per kolf voor jonge w ORMULIEREN en 26 mL per kolf gedurende de leeftijd wormen.
- Ga verder als beschreven in stap 1.2.2.8.
- Onderhoud van C. elegans vloeibare culturen
- Regelmatig verzamelen een aliquoot gedeelte van elke vloeibare cultuur en plaats op een glasplaatje (u kunt ook op een agarplaat) om te controleren of er geen verontreinigingen. De sterkte van het bacteriële voedsel in de cultuur met behulp van een Microscoop dissectie, controleren met name tijdens de groeifase. Bereiden 2 L culturen van besturingselement RNAi bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang zoals beschreven in stap 1.2.1. Voeg deze aan C. elegans vloeibare culturen indien nodig en houden de rest bij 4 ° C.
- Periodiek controleren dat de dieren steriel zijn. De meeste dieren zullen een gonaden niet hebben. Afhankelijk van de doordringendheid van de gon-2 mutatie, sommige kunnen hebben afgebroken gonadale structuren maar geen dieren met eieren moeten worden geobserveerd.
- Voorbereiding van bacteriën van vloeibaar cultuur
- Collectie van jonge en oude wormen onderworpen aan RNAi in vloeibare cultuur
Opmerking: Alle van de volgende stappen uit voor een vloeibare cultuur kolf maar beide culturen van leeftijdgenoten met controle en RNAi bacteriën voor het gen van belang samen moeten worden verwerkt.- Jonge wormen op dag 2, dag 3 basale niveaus van proteïne oplosbaarheid of verzamelen. Leeftijd wormen moeten worden verzameld (uiterlijk) wanneer de helft van de bevolking is overleden. Om te bepalen dit, worden dood en levend wormen meegeteld in enkele druppels vloeibare cultuur geplaatst op een agarplaat. Ratio's zijn met gemiddeld ten minste negen druppels.
- Voorbereiding van de volgende reagentia: 1 L M9, 1 L M9 met 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9), en 40 mL 60 gewichtspercenten sacharose in ddH2O. houden de reagentia op ijs.
- Giet de wormen uit één kolf in een scheitrechter en laat het sediment wormen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Open de afsluiter en de wormen in een tube van 50 mL te druppelen.
- De worm pellet gesplitst in twee 15 mL-buizen samen en centrifugeer bij 1.900 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de wormen, verwijder het supernatant en vullen tot 15 mL met M9. Herhaal het centrifugeren. Tot slot de wormen overbrengen in twee 50 mL tubes en vullen opwaarts naar de totaal volume 20 mL met ijskoude M9.
- Voor het verwijderen van bacteriën en dode wormen, voegen de twee 20 mL verdund worm pellets twee 50 mL-buizen gevuld met 20 mL ijskoud 60 gewichtspercenten sacharose. Snel centrifugeren bij 2700 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, 9 versnelling en vertraging 7. Verwijder voorzichtig de bovenste worm laag met een grote pipet (25 mL). Neem maximaal 15 mL (maar minder als er zijn natuurlijk een heleboel dode wormen). Dit direct in 37 mL M9 + Octoxynol-9 zetten (3 buizen per sacharose buis) voorbereid op het ijs. Centrifugeer bij 2700 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, versnelling 9 en vertraging 7.
Opmerking: Beide moeten ijskoude; de scheiding zal anders niet werken. Meng geen! Omdat sucrose giftig voor de wormen is is het belangrijk snel voor de volgende stap. - Verdeel de pellet in vier 15 mL-buizen en spoel tweemaal met ijskoude M9 + Octoxynol-9: Centrifugeer bij 1.900 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verwijder de bovendrijvende substantie, opvullen tot 15 mL maatstreep met ijskoude M9 + Octoxynol-9 en herhaal de procedure.
- Een keer wassen met ijskoude M9 en combineren de vier buizen twee buizen. Opvullen met M9 bij kamertemperatuur tot een totaal volume van 4 mL in de 15 mL-buizen en draaien op een nutating mixer bij 25 ° C gedurende 40 minuten.
Opmerking: Dit helpt de wormen te verteren alle resterende bacteriën in de darm. Controleer de wormen onder de Microscoop om te zien dat er geen doden ones. - Wassen de wormen tweemaal met ijskoude M9 + Octoxynol-9, zoals beschreven in 1.3.5. Spoel tweemaal met de M9 en de wormen overbrengen in een buis.
- De wormen keer wassen in de buffer van de hoge-zout winning Reassembly (RAB) zonder remmers (0,1 M 4-morpholineethanesulfonic zuur (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic zuur (EGTA), 0.1 mM EDTA, 0.5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl, 0,02 M Natriumfluoride (NaF)) voor de collectie. Verwijder het supernatant zolang er geen geen vloeistof op de top van de worm-pellet.
Opmerking: Deze stap en de volgende moeten gebeuren snel om te voorkomen dat artefacten in de wormen die veroorzaakt door de hoge zoutconcentratie in de buffer. - Schatten van de omvang van de worm pellet en voeg een gelijk volume van RAB met remmers (2 x Protease Inhibitor Cocktail). Met behulp van een pipet van Pasteur, stellen de wormen en langzaam druppelen in een tube van 50 mL, die de helft gevuld met vloeibare stikstof geplaatst in droog ijs. Laat de vloeibare stikstof verdampen en de bevroren wormen bij-80 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt.
Let op: Vloeibare stikstof is bij een zeer lage temperatuur; Draag passende bescherming.
2. onoplosbare eiwit extractie met jonge en oude dieren onderworpen aan RNAi gericht op een gen van belang
-
Verstoring van dieren verzameld in stap 1.3
Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat eventuele ontdooien van de monsters van de worm. De mortel met vloeibare stikstof afkoelen en het uitvoeren van de volledige procedure op droog ijs.
Let op: Vloeibare stikstof is bij een zeer lage temperatuur; Draag passende bescherming.- De bevroren wormen overbrengen in het vooraf gekoelde cement en grind voor 2,5 min.
Opmerking: Wees voorzichtig tijdens het slijpen: aan het begin, de bevroren wormen zijn in kleine opsommingstekens en het is gemakkelijk om ze te verliezen. - Vloeibare stikstof (ongeveer 100 mL) toevoegen aan het poeder te koelen het opnieuw en slijpen voor een ander 2.5 min. Check met de Microscoop dat de worm lichamen gebroken zijn. Breng het poeder in 2 mL buizen en bewaar ze bij-80 ° C.
- De bevroren wormen overbrengen in het vooraf gekoelde cement en grind voor 2,5 min.
-
Snelle onoplosbaar eiwit extractie voor westelijke vlekkenanalyse
Opmerking: Gebruik deze methode om het vergelijken van het totale eiwitniveaus voor inhoud en onoplosbare eiwitten tussen de verschillende dagen met en zonder RNAi gericht op het gen van belang. Voer alle stappen uit tot stap 2.2.3 op ijs!- Solubilize 50 mg grond wormen uit stap 2.1 met 150 µL Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 0,5% natrium deoxycholate (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 x Protease Inhibitor Cocktail). Meng de schorsing met behulp van een injectiespuit 1 mL met grijze naald (27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm); opstellen van de opschorting 10 keer.
- Centrifugeer bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof te verzamelen.
- Resuspendeer de pellet in 100 µL RIPA buffer en centrifuge bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, spin kort, en wees voorzichtig te verwijderen van overgebleven bezinken.
- Als u wilt solubilize de zeer slecht oplosbaar eiwitten, resuspendeer de pellet in 75 µL ureum/SDS buffer (8 M ureum, 2% SDS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voor het analyseren van het totale eiwitgehalte, door de eerste RIPA supernatant uit stap 2.2.2 en het ureum/SDS pellet resuspensie te combineren. Om te verklaren welke volumes zijn opgebruikt voor de winning, moet de totale breuk bevatten tweederde van RIPA supernatant en eenderde van ureum/SDS pellet breuk. Op een kleine 4-12% helling gel, de sterkte van onoplosbare eiwitten door het laden van 9 µL van het ureum/SDS breuk en 4 µL totale gecombineerde eiwit te controleren. Uitvoeren van een totale proteïne vlek kleuring voor het controleren van eiwitniveaus. Door Western blotting met behulp van specifieke antilichamen, controleren of wijzigingen in oplosbaarheid voor afzonderlijke proteïnen gekwantificeerd door massaspectrometrie (zie paragraaf 3).
-
Onoplosbaar eiwit extractie te isoleren van SDS onoplosbare eiwitten voor massaspectrometrie
Opmerking: Alle stappen op het ijs.- Weeg er twee keer op droog ijs 350 mg grond wormen per tijdstip en per RNAi bacteriën (jonge en oude wormen, controle RNAi bacteriën en RNAi bacteriën voor gen van belang) in 2 mL buizen.
- Toevoegen als u wilt verwijderen de oplosbare eiwitten van hoge-zout, twee volumes van RAB per gewicht (700 µL) met remmers, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNase ik, 100 µg/mL RNase A aan elk buis en solubilize van het poeder op het ijs. Opstellen van de schorsing in een spuit van 1 mL (grijze naald, 27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm) 15 keer en het uit te broeden op ijs voor 10 min. Centrifuge bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Ga via de vetlaag en verzamelen van het supernatans dat hoge-zout oplosbare eiwitten bevattende diervoeders in een tube van 2 mL per voorwaarde (vier buizen in totaal). Verwijder het vet en verwerpen. Aliquot high-zout oplosbare eiwitten te bevriezen bij-80 ° C.
- Als u wilt negeren lipiden, solubilize de pellet met 700 µL RAB met remmers met 1 M sacharose (zonder DNase ik en RNase A). Opstellen van de schorsing in een injectiespuit 10 keer en het uit te broeden op ijs voor 5 min. Centrifuge bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Wees voorzichtig te verwijderen alle supernatant en lipiden en zich ontdoen van hen.
- Als u wilt verwijderen van SDS-oplosbare eiwitten, solubilize de pellet met 700 µL RIPA buffer. Opstellen van de schorsing in een injectiespuit 10 keer en Incubeer het 10 min op ijs. Centrifugeer bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamelen van de bovendrijvende substantie met SDS-oplosbare eiwitten en aliquot voor bevriezing bij-80 ° C.
- Zwembad twee monsters van elke voorwaarde samen na elke pellet met 500 µL RIPA buffer solubilizing. Opstellen van de schorsing in een injectiespuit 10 keer. Centrifugeer bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Wees voorzichtig om alle bovendrijvende vloeistof verwijderen en verwijderen.
Opmerking: Het doel van de extractie is te scheiden van de oplosbare eiwitten van de onoplosbare eiwitten. Daarom is het belangrijk om te verwijderen van alle resterende RIPA supernatant alvorens toe te voegen mierenzuur in de volgende stap. - Solubilize van de laatste pellet die zeer slecht oplosbaar eiwitten bevatten met 400 µL 70% mierenzuur en stelt de schorsing in een injectiespuit 20 keer. Incubeer gedurende 20 min op ijs. Centrifugeer bij 50.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C, 3 versnelling en vertraging 5, te verwijderen van de worm cuticula puin. Verzamelen van de bovendrijvende substantie die zeer slecht oplosbaar eiwitten bevat en bevriezen bij-80 ° C.
- Dialyse van onoplosbare eiwitfracties voor massaspectrometrie
Opmerking: Dialyze bij 4 ° C.- Bereiden van 8 L dialyse buffer (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, pH 7.5) en verdeel het om acht 1 L bekers. Plaats van drie membranen (membraanfilters = 0,025 µM) op het oppervlak van de buffer voor elk bekerglas van 1 L.
- Per membraan, zorgvuldig laden 65 µL van onoplosbare eiwitten ontbindend in mierenzuur in stap 2.3.6 verkregen. Elke voorwaarde bestaat op zes membranen.
- Controleer de pH van een steekproef door het verwijderen van 5 µL en het op een pH-strip toe te voegen. Als de pH-waarde tussen 7 en 8 (ongeveer na 2 h), het monster verzameld door pipetteren zachtjes op en neer. Gebruik ten slotte 10 µL dialyse buffer te wassen van de neerslag uit elk membraan. Bevriezen van de monsters bij-80 ° C.
3. uitgebreide identificatie en kwantificering van veranderingen in de eiwitten oplosbaarheid met leeftijd geïnduceerd door RNAi gericht op een gen van belang
-
Voorbereiding voor massaspectrometrie analyse
- Evalueren de hoeveelheid onoplosbare eiwitten in de dialyzed monsters door het laden van een aliquoot gedeelte op een 4-12% helling gel samen met een referentiemonster van bekende concentratie. Het uitvoeren van een totale proteïne gel kleuring en kwantificeren van het bedrag van de eiwitten met de software van de analyse van een afbeelding. Deze stap is noodzakelijk om te schatten hoeveel trypsine nodig voor de vertering (stap 3.1.4).
- Concentreer je de monsters met behulp van een centrifugale verdamper en solubilize de onoplosbare eiwitten in een eindconcentratie van 8 M ureum.
- Alkylatie en vermindering
- Toevoegen Tris(2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride (TCEP) om een eindconcentratie van 4 mM tot de monsters. Incubeer gedurende 1 uur bij 57 ° C met 300 rpm. Zet de monsters tot op kamertemperatuur.
- Iodoacetamide toevoegen aan een eindconcentratie van 8.4 mM. Incubeer het 45 min (kan worden ge¨ uncubeerd 2 h) in het donker bij kamertemperatuur.
- Verdun de monsters in 150 mM Ammoniumbicarbonaat te verkrijgen van een eindconcentratie van de 2 M-ureum.
- Digest eiwitten met 5% w/w bewerkt trypsine 's nachts bij 37 ° C en 400 rpm.
- Laden van een steekproef van de verteerd eiwitten op een 12% SDS gel en het uitvoeren van een totale proteïne gel vlekken om te analyseren als de spijsvertering gewerkt. Als er nog steeds sommige bands aanwezig, herhaal stap 3.1.4 en 3.1.5.
- Peptiden vanaf jonge leeftijd controle en en RNAi behandeld C. elegans worden aangeduid met isobaar tags voor relatieve en absolute kwantificatie na instructies van de fabrikant.
Opmerking: U kunt ook andere methoden voor het labelen van de peptiden of eiwitten kon worden gebruikt voor kwantificering zoals tandem massa codes.
Opmerking: Massa spectrometrie analyse: Verklein monster complexiteit en peptiden moeten worden gescheiden door sterke cation exchange chromatografie in verschillende fracties voor spectrometrische analyse5. Verschillende massaspectrometers kunnen analyseren isobaar tags voor relatieve en absolute kwantificatie zoals elders beschreven17. De verkregen gegevens moeten worden verwerkt met de juiste software. Over het algemeen kan deze analyse de identificatie van zeer slecht oplosbaar eiwitten en hun wijzigingen op leeftijd en op proteostasis modulatie.
4. in Vivo evaluatie van de invloed van een gen van belang op de aggregatie-patroon tijdens veroudering
- Uit de analyse van de Spectrometrie van de massa in sectie 3, selecteer een leeftijd-afhankelijke aggregatie-naar voren gebogen eiwit dat zich in verschillende mate in de dieren onderworpen aan RNAi ophoopt. Genereren van transgene C. elegans lijnen uiting van dit eiwit tagged met een fluorescente proteïne en onder de controle van de respectieve promotor of een weefsel-specifieke promotor (Zie bespreking bij de keuze van een geschikte promotor). Het handhaven van de spanning bij 15 ° C door standaardtechnieken op Nematode groei (NG) platen met OP50 agarvoedingsbodem. Bijvoorbeeld, kozen we voor een worm stam uiting van polyadenylate-bindend-proteïne (PAB-1) gesmolten in de N-terminus aan tagRFP onder de controle van de promotor faryngaal spier pmyo-2.
-
In vivo beoordeling van wijzigingen in de samenvoeging met de leeftijd op remming van het gen van belang
- Één tot twee dagen van tevoren, voorbereiding NG/carbenicillin (Carb) / IPTG platen met een besturingselement (lege RNAi vector L4440) bacteriën en RNAi bacteriën voor de remming van het gen van belang. (Zie voor een gedetailleerde protocol over RNAi in C. elegans JoVE Science Education Database. Essentials van biologie 1: gist, Drosophila en C. elegans. RNAi in C. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
- Voor de behandeling van RNAi van L1 scheiden plaats ei leggen wormen op verscheidene kleine NG/Carb/IPTG (6 cm diameter) platen bezaaid met besturingselement RNAi of RNAi bacteriën voor het gen van belang bij 20 ° C. Verwijderen van de volwassenen na 2U, houden de nakomelingen bij 20 ° C. Voorkom developmental gebreken, mag RNAi behandelingen na het larvale stadium van L4 worden begonnen.
- Zodra de nakomelingen het larvale stadium van L4 bereikt, breng deze L4s op nieuwe NG/Carb/IPTG platen bezaaid met besturingselement RNAi of RNAi bacteriën voor het gen van belang. Negen platen met 15 transgenics voor beide voorwaarden instellen en houd ze bij 20 ° C. De veroudering wormen moeten worden overgebracht uit de buurt van hun nakomelingen aan nieuwe platen elke tweede dag tot het einde van hun reproductieve periode te kunnen om ze te onderscheiden van hun nakomelingen.
- Evalueren van veranderingen in de verdeling van de aggregatie-naar voren gebogen proteïne aangeduid met een fluorescerende tag onder een fluorescente stereomicroscoop met 24 x vergroting tijdens volwassenheid, om de andere dag.
Opmerking: De accumulatie van de leeftijd-afhankelijk van de aggregatie-naar voren gebogen proteïne in heldere puncta wordt gebruikt als een uitlezing voor aggregatie. Deze puncta moet zeer immobiele structuren worden gekarakteriseerd als aggregaten. Dit moet worden bepaald door het herstel van de fluorescentie na photobleaching (FRAP) met behulp van de confocal microscopie. Voor geaggregeerde eiwit, moet geen herstel worden nageleefd in de gebleekte regio na ten minste 4 min5,18. Om te kwantificeren van de veranderingen met de leeftijd, we de distributiepatronen scoorde in de leeftijd-gesynchroniseerde wormen PAB-1 overexpressing op dag 7 van volwassenheid als de volgende dag 2 en dag 5: lage niveaus van aggregatie (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta in achterste faryngaal lamp), middellange aggregatie niveaus (meer dan 10 puncta in de achterste faryngaal bol), en hoge aggregatie niveaus (meer dan 10 puncta in de voorste faryngaal bol).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten de methoden die hier gepresenteerd om te evalueren hoe langlevende dieren met een verminderde IIS moduleren leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie. Door Western blot (zie stap 2.2, snel onoplosbaar eiwit extractie voor westelijke vlekkenanalyse), we geanalyseerd het totaal en het onoplosbare eiwitgehalte van jonge (dag 3 van volwassenheid) en leeftijd (dag 18 van volwassenheid) wormen op controle RNAi en op RNAi gericht op de insuline / IGF-1-like receptor- daf-2. Geen grote veranderingen in de totale eiwitniveaus met leeftijd of tussen controle en daf-2 waargenomen RNAi voorwaarden(Figuur 2). Zoals verwacht, we een sterke stijging van de leeftijdsgebonden gedetecteerd in niveaus van zeer onoplosbare eiwitten in controledieren (Figuur 2B). Ter vergelijking in de langlevende dieren op daf-2 RNAi, was de aggregatie neiging sterk verminderd. Hele eiwit kleuring van de onoplosbare extracten bleek een minder complexe eiwit band patroon in extracten van 18 dagen oude wormen op daf-2 RNAi ten opzichte van leeftijd-matched controles. Spectrometrie van de massa van de kwantitatieve analyse aangetoond dat langlevende dieren met verminderde IIS algemene minder leeftijd-geassocieerde proteïne aggregatie hebben en bovenal daf-2 remming volledig de oplosbaarheid van de leeftijd afhankelijk van ingetrokken een specifieke deelverzameling van eiwitten7. Voor het opvolgen van deze bevindingen, we gericht op een van deze aggregatie-naar voren gebogen proteïnen, PAB-1. PAB-1 is een RNA-bindende eiwit met een voorspelde "prion-achtige" domein. Antilichaam kleuring bevestigd dat langlevende dieren PAB-1 oplosbaar met de leeftijd (Figuur 2C onderhouden).
Voor in vivo analyse van PAB-1 aggregatie geproduceerd we transgene dieren uiting van tagRFP::PAB-1 in de faryngaal spieren. Bij jonge dieren, tagRFP::PAB-1 was voornamelijk diffuus verspreid over de keelholte (Figuur 3A, niveau van de "lage" aggregatie) maar met de leeftijd, we een geleidelijke accumulatie waargenomen in heldere puncta starten in de achterste faryngaal bol ( Figuur 3A, 'tussenliggende' aggregatie niveau). Bij het ouder waargenomen wij ook aggregatie in de voorste faryngaal bol (Figuur 3A, "hoog" aggregatie niveau) in een toenemend aantal dieren. Door groeperen dieren in deze verschillende categorieën scoorde we het tempo van de PAB-1 aggregatie in een populatie. Op dag 2 van volwassenheid allermeest naar de wormen (88%) had geen of zeer weinig puncta en geen dieren met hoge aggregatie niveaus geconstateerd. Al op dag 5, 19% van de bevolking bleek intermediaire en hoge aggregatie van de 16%-niveaus, terwijl op dag 7 meer dan 70% van de wormen gepresenteerd aggregatie van intermediaire en hoge niveaus. Te analyseren het effect van de levensduur van de berekening van de leeftijd afhankelijk van tagRFP:PAB-1, we genereerden transgene tagRFP::PAB-1 wormen met een daf-2 -mutatie. Deze dieren bleek sterk gereduceerde tagRFP:PAB-1 puncta formatie met ouder worden, met minder dan 15% van de bevolking exposeren aggregatie van intermediaire en hoge niveaus zelfs op dag 7 (Figuur 3B).
Met behulp van de verschillende benaderingen beschreven hier, wij geopenbaard dat verminderde IIS leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie verschillende mate voorkomt en langlevende dieren bijzonder efficiënt zijn in het herstellen van de dynamiek van PAB-17.
Figuur 1 : Schematische van de werkstroom te bestuderen van de veranderingen in de inherente eiwit aggregatie met de leeftijd in C. elegans. Belangrijkste stappen worden vet weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Eiwit oplosbaarheid toeneemt met de leeftijd in controledieren, maar niet in dieren met verminderde daf-2 signalering. (A) totaal eiwit kleuring van totale breuk vanaf dag 3 en dag 18 gon-2(-) mutanten onderworpen aan de controle- en daf-2 RNAi (gegroeid bij 25 ° C). (B) totale eiwit kleuring van SDS onoplosbare breuk vanaf dag 3 en dag 18 gon-2(-) mutanten onderworpen aan de controle- en daf-2 RNAi (gegroeid bij 25 ° C). Deelvenster gepubliceerd van referentie7. (C) Immunoblot opsporen van PAB-1 in SDS-onoplosbare breuk, relevante eiwit banden aangegeven met rode pijl. Deelvenster gepubliceerd van referentie7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: De accumulatie van tagRFP::PAB-1 puncta met de leeftijd verminderde daf-2 signalering voorkomt. (A) representatieve foto's van wormen met tagRFP::PAB-1 overexpressie in de faryngaal spieren (hoge vergroting Microscoop, tagRFP detectie-instellingen: excitatie 558 nm, emissie 583 nm). Dieren met een lage (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta in achterste faryngaal bol), intermediate (meer dan 10 puncta in de achterste faryngaal bol), of hoge aggregatie niveaus (meer dan 10 puncta in de voorste faryngaal bol) worden weergegeven. Schaal bar = 20 µm. (B) kwantificering van verschillende tagRFP::PAB-1 aggregatie niveaus met de leeftijd in wildtype en daf-2 mutant achtergrond blijkt sterk vertraagde tagRFP::PAB-1-aggregatie met leeftijd in langlevende dieren. Dag 2, dag 5 en dag 7 daf-2(-) versus wildtype achtergrond, laag in vergelijking met intermediaire en hoge aggregatie niveaus: Fisher's exacte test, ***p < 0,0001. Deelvenster gepubliceerd van referentie7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stockoplossing | Bedrag | Eindconcentratie | Opmerkingen en beschrijvingen |
| Vloeibare cultuur, totaal volume 300 mL | |||
| S basale (voor 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M kalium fosfaat pH 6) | 200 mL | 1 M kalium fosfaat pH 6: voor 1 L: 129 g KH2PO4 monobasisch, 52 g K2HPO4 dibasische watervrij | |
| 1 M kalium citraat pH 6 (voor 400 mL: 13.1 g zuiver citroenzuurmonohydraat, 134.4 g tri-kalium citraat monohydraat) | 3 mL | 10 mM | |
| Trace metalen oplossing (voor 1 L: 1,86 g ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O) | 3 mL | Stockoplossing van het archief in het donker bij 4 ° C | |
| 1 M MgSO4 (voor 500 mL: 123.3 g) | 900 ΜL | 3 mM | |
| 1 M CaCl2 (voor 500 mL: 73,5 g) | 900 ΜL | 3 mM | |
| 200 µg/mL Carbendazim (voor 50 mL: 10 mg in Methanol) | 150 ΜL | 100 ng/mL | |
| 5 mg/mL Cholesterol (voor 100 mL: 0,5 g in Ethanol) | 300 ΜL | 5 µg Mo/mL | |
| Herbouw (RAB) hoge-zout winning buffer, 30 mL | |||
| 1 M 4-Morpholineethanesulfonic zuur (MES) | 3 mL | 100 mM | RAB voorraad buffer component |
| 0,5 M Ethyleneglycoltetraacetic zuur (EGTA) | 60 ΜL | 1 mM | RAB voorraad buffer component |
| 0,5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) | 6 ΜL | 0.1 mM | RAB voorraad buffer component |
| 1 M MgSO4 | 15 ΜL | 0.5 mM | RAB voorraad buffer component |
| 5 M NaCl | 4.5 mL | 750 mM | RAB voorraad buffer component |
| 1 M Natriumfluoride (NaF) | 600 ΜL | 20 mM | RAB voorraad buffer component |
| Voltooien tot 30 mL totaal met ddH2O | |||
| 50 x Protease Inhibitor Cocktail | * | 2 x | * Het toevoegen van reagentia na nemen van de hoeveelheid RAB voorraad buffer dat nodig is (voor de extractie voor massaspectrometrie 6 mL). |
| 100 mM Phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF) in isopropanol,-20 ° C | * | 1 mM | |
| 10 U/µL DNaseI | * | 200 U/mL | |
| 4 mg/mL RNaseA | * | 100 µg/mL | |
| RAB met 1 M sacharose, 30 mL | |||
| 2 M sacharose (voor 50 mL: 34,2 g) | 15 mL | 1 M | Toevoegen van de RAB buffer reagentia naast DNaseI en RNaseA |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer, 30 mL | |||
| 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 8 | 1,5 mL | 50 mM | RIPA buffer voorraad component |
| 5 M NaCl | 0,9 mL | 150 mM | RIPA buffer voorraad component |
| 0.5 EDTA M | 0.3 mL | 5 mM | RIPA buffer voorraad component |
| 10% natrium dodecyl sulfaat (SDS) | 1,5 mL | 0,50% | RIPA buffer voorraad component |
| 10% natrium deoxycholate (SDO) | 1,5 mL | 0,50% | RIPA buffer voorraad component |
| Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) | 0.3 mL | 1% | RIPA buffer voorraad component |
| Voltooien tot 30 mL totaal met ddH2O | |||
| 100 mM PMSF | * | 1 mM | * Het toevoegen van reagentia na nemen van de hoeveelheid voorraad buffer RIPA dat nodig is (voor de extractie voor massaspectrometrie 10 mL). |
| 50 x Protease Inhibitor Cocktail | * | 1 x | |
| Ureum/SDS buffer, 10 mL | |||
| Ureum | 4,8 g | 8 M | |
| 10% SDS | 2 mL | 2% | |
| Dithiothreitol (DTT) | 77 mg | 50 mM | |
| 1 M Tris pH 8 | 0,5 mL | 50 mM | |
| Voltooien tot 10 mL totaal met ddH2O | |||
| Dialyse buffer, 1 L | |||
| Tris | 6 g | 50 mM | |
| DTT | 154 mg | 1 mM | |
| 100 mM PMSF | 1 mL | 0.1 mM | |
| Aanpassen aan pH 7.5 en tot 1 L totale voorzien van ddH2O | |||
Tabel 1: Buffers voor vloeibare cultuur, onoplosbaar eiwit extractie en dialyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij rapporteren hier een methodologie te isoleren van hoogst-onoplosbaar eiwit-aggregaten van veroudering C. elegans onderworpen aan RNAi voor analyse van de Spectrometrie van de massa en het westelijke bevlekken. We laten zien dat verbetering van de proteostasis doordat IIS sterk leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie voorkomt. Door het selecteren van specifieke aggregatie-naar voren gebogen eiwitten aan overexpress in C. elegans, is het mogelijk om te ontleden verder de mechanismen modulerende inherente eiwit aggregatie.
Inherente leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie Versus ziekte-geassocieerde proteïne aggregatie
Dit huidige werk is gebaseerd op de eerdere bevindingen dat aggregatie van eiwitten is niet beperkt tot specifieke proteïnen aggregeren in het kader van een ziekte. Door te focussen op de endogene aggregatie-naar voren gebogen eiwitten in plaats van ectopically uitgesproken ziekte-geassocieerde eiwitten, is de verwachting om het nieuwe inzicht geven in de fysiologische regelmechanismen van het proces van samenvoeging. Leeftijd-afhankelijke eiwit-aggregaten zijn gevonden in verschillende cellulaire locaties5, moet hun studie ook inzicht geven in compartiment specifieke mechanismen voor kwaliteitscontrole. Over het geheel genomen zou de mechanismen waarmee die inherent zijn aan eiwit aggregatie ook betrokken zijn bij het voorkomen van ziekte eiwit aggregatie. Van de nota, hoewel leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie in verschillende aspecten ziekte eiwit aggregatie lijkt, onduidelijk het nog steeds of deze aggregaten amyloïde fibrillen, een kenmerk van veel ziekte aggregaten bevatten.
Keuze van C. Elegans Model: voordelen en beperkingen
Vergeleken met een zoogdieren model, is een van de grootste voordelen van het gebruik van C. elegans om te bestuderen van een karakteristiek veroudering-gerelateerde zijn zeer korte levensduur. Verscheidene honderden eiwitten consequent uitgegroeid tot zeer-aggregatie-naar voren gebogen tijdens veroudering en deze grote toename van de oplosbaarheid is gemakkelijk aantoonbaar zelfs met een vereenvoudigde biochemische extractie. Een belangrijke beperking van het gebruik van C. elegans voor het bestuderen van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie is echter de noodzaak om te isoleren van grote aantallen leeftijd dieren. Zoals C. elegans zijn hermafrodieten en produceren van ongeveer 220 of meer nakomelingen tijdens hun reproductieve fase19, is het essentieel te voorkomen reproductie of elimineren nageslacht om de leeftijd van een bevolking. Verschillende opties zijn beschikbaar voor het opwekken van steriliteit: ã‰ã © n optie is het gebruik van de chemische fluorodeoxyuridine (FUdR), een inhibitor van de omwenteling van de DNA synthese. FUdR leidt echter tot talrijke bijwerkingen met inbegrip van wijzigingen in proteostasis en verlaagd eiwit aggregatie20,21,22. Nog belangrijker is, induceert FUdR genotype-specifiek antwoorden23. Een andere optie is het gebruik van temperatuurgevoelige steriele mutanten. Bijvoorbeeld, zijn spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), en gon-2(q388) gebruikt eerder voor spectrometrische analyse van de leeftijd afhankelijke aggregeren Proteoom5, 8.
Toch zijn er verscheidene beperkingen in verband met het gebruik van deze mutanten. Eerste, zoals de steriliteit afhankelijk van de temperatuur is, is het nodig om te groeien de dieren bij 25 ° C, die vormt een milde stress en versnelt de veroudering, alsmede de aggregatie van eiwitten. Daarentegen hebben we kunnen vaststellen dat gon-2, glp-1 en fem-1 mutanten langduriger worden vergeleken met wild-type wanneer onderhouden bij 25 ° C (gegevens niet worden weergegeven). Ten tweede, zijn er bepaalde beperkingen die zijn gekoppeld aan elk type van reproductieve defect. Een nadeel van het gebruik van sperma-defecte mutanten is de productie van onbevruchte eicellen (ook geproduceerd in leeftijd wild-type hermafrodieten). De kwaliteit van deze eicellen sterk afneemt met de leeftijd en ze accumuleren in de gonaden24,25. Spectrometrie van de massa van de kwantitatieve analyse blijkt dat sperma-defecte mutanten hebben verschillende vouw hogere niveaus van onoplosbare eiwitten opgebouwd met de leeftijd in vergelijking met de gonaden-minder of germline-deficiënte mutanten. Dit geeft aan eiwit misfolding en aggregatie gelegen in de gonaden5, in overeenstemming met eerdere studies12,13 en in vivo experimenten onthullende geaggregeerde eiwitten, gelegen in de abnormale oöcyt clusters5. Buitensporige eiwit aggregatie in de gonaden zou daarom meer subtiele veranderingen in de aggregatie van eiwitten in de somatische weefsels maskeren. Dit moet ook worden overwogen bij het vergelijken van interventies die in verschillende mate op reproductieve en somatische weefsel proteostasis handelen. Daarom, om te beoordelen alleen somatische eiwit aggregatie, gunst wij met behulp van de gonaden-minder gon-2 mutanten. Een alternatief zou zijn te gebruiken germline-deficiënte glp-1 mutanten. Wij constateren echter dat deze dieren minder inherente eiwit aggregatie met leeftijd ten opzichte van gon-2 mutanten5 hebben. Dit is waarschijnlijk een gevolg van de verbeterde proteostasis in somatische weefsels toe te schrijven aan de signalering van de germline-defecte gonaden26,27,28. Een ander alternatief is het gebruik van wild-type dieren en verwijderen van nakomelingen elke dag door sedimentatie. Dit is echter problematisch vanwege de moeilijkheid van het volledig verwijderen van alle nakomelingen.
Een andere algemene beperking van het gebruik van C. elegans is zijn kleine formaat waardoor specifieke weefsel extracties uitdagend. Als dergelijke geheel dierlijke extracties geen relevante informatie met betrekking tot hoe verschillende omstandigheden bieden moduleren eiwit aggregatie in specifieke weefsels. Van de nota, kan dit probleem mogelijk worden omzeild met behulp van een onlangs ontwikkelde methode op basis van de fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren te isoleren van de specifieke cellen C. elegans€29. Toch blijft het te bepalen of deze methode geschikt voldoende materiaal voor onoplosbaar eiwit extractie aan te schaffen zijn en zou of het zou toepassing op dieren ouder. U kunt ook kunnen weefsel specifieke proteïne aggregatie en de verordening worden onderzocht door extra in vivo experimenten. Als transgene dieren uiting van een fluorescently-geëtiketteerden aggregatie-naar voren gebogen proteïne van keuze kan snel gegenereerd worden en als de dieren transparant zijn, het is relatief eenvoudig te onderzoeken eiwit aggregatie in situ.
Globaal, is het essentieel om de follow-up van de resultaten van proteomic met in vivo experimenten in een wild-type achtergrond. De combinatie van een biochemische en microscopie gebaseerde karakterisering maakt een uitgebreide studie van aggregatie van eiwitten en een beoordeling van de rol van genen van belang. De laatste wordt vergemakkelijkt in C. elegans door RNAi gemedieerd door middel van voeding en de beschikbaarheid van hele genoom RNAi bibliotheken. Daarnaast bestaat een groot aantal gekarakteriseerd mutanten resultaten verkregen door RNAi te bevestigen of om te gebruiken in plaats van RNAi.
Vloeibare cultuur en biochemische extractie: voordelen en beperkingen
Zoals zeer-geaggregeerde eiwitten slechts een klein deel van de totale eiwitten maken, is het noodzakelijk om te beginnen met de winning met een groot aantal dieren. Met een grote hoeveelheid onoplosbare eiwitten is het dan haalbaar is voor het uitvoeren van uitgebreide peptide fractionering om te monster complexiteit voor massaspectrometrie te verminderen en daarmee verbetering van de identificatie van lagere overvloedige eiwitten. Als slechts kleine hoeveelheden van onoplosbare eiwitten nodig zijn, is een alternatief om te groeien van wormen op platen en meng ze met keramische kralen. Een van de nadelen van vloeibare cultuur is dat in het geval van een besmetting, de hele cultuur wordt beïnvloed en moet worden verwijderd. In het algemeen, C. elegans veroudering is sterk beïnvloed door de temperatuur en deze parameter moet streng worden gecontroleerd in de vloeibare cultuur om te voorkomen dat verschillen in leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie. Temperatuurregeling is ook noodzakelijk dat er een homogene populatie van gonaden-minder dieren bij het gebruik van de gon-2(-) -mutanten.
Afhankelijk van het doel van de studie is het belangrijk om te overwegen verschillende extractiemethoden. De biochemische winning hier gepresenteerd werd aanvankelijk aangepast vanuit protocollen bij het isoleren van ziekte-geassocieerde aggregaten11,30,31. Wij hebben gekozen voor relatief hoge concentraties van detergentia zoals 0,5% SDS te isoleren van de meer onoplosbare aggregaten. Ook door de 0,5% SDS onoplosbare aggregaten met lage centrifugaal snelheden pillering, zou dit protocol alleen isoleren de grotere aggregaten. U kunt ook was een minder strenge protocol onlangs gepubliceerde10. In deze studie werden ook meer oplosbaar en kleinere aggregaten gehaald door het weglaten van SDS en met behulp van zeer hoge centrifugaal snelheden op 500.000 x g. Een vergelijking van de verschillende protocollen blijkt een algemene stijging in het aantal eiwitten in de aggregatie Proteoom met behulp van de minder strenge protocol7. Wij stellen vast dat langlevende dieren met verminderde daf-2 signalering efficiënt de accumulatie van zowel SDS-oplosbare en onoplosbare SDS aggregaten in gonaden-minder dieren7 voorkomen.
In Vivo Analyse van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie
Wanneer het construeren van transgene modellen voor volgende leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie, is het relevant om te overwegen in welke weefsel te overexpress de aggregatie-naar voren gebogen proteïne van belang en op welke niveaus van expressie. We gunst expressie in weefsels gelegen in de hoofd regio om storing te voorkomen met autofluorescence, die is prominent aanwezig in de darm van de veroudering. Om te visualiseren TL-geëtiketteerden aggregaten met lage-vergroting, moet de aggregatie-naar voren gebogen eiwit worden uitgedrukt op een relatief hoog niveau. Aan de andere kant, te hoog expressie zal leiden tot de aggregatie-naar voren gebogen eiwitten aan formulier aggregaten al bij jonge dieren.
Samen genomen, zal deze methoden ons helpen te begrijpen waarom deel van het proteoom aggregaten met de leeftijd en uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van strategieën ter bevordering van gezonde veroudering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de DZNE en een Marie Curie internationale reïntegratietoelage (322120 naar D.C.D.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
