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Biology

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Published: November 26, 2017 doi: 10.3791/56464
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1
1Protein Aggregation and Aging, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Graduate School of Cellular and Molecular Neuroscience, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

Summary

Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.

Abstract

In den letzten Jahrzehnten ist die Prävalenz von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD), gewachsen. Diese altersassoziierter Erkrankungen zeichnen sich durch das Auftreten von Protein-Aggregate mit fibrillary Struktur in den Gehirnen von Patienten. Genau warum normalerweise löslichen Proteine zu unterziehen, bleibt ein Aggregationsprozess schlecht verstanden. Die Entdeckung, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheitsprozesse und stattdessen Teil des normalen Alterungsprozesses die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Proteinaggregation, zu regulieren ermöglicht, ohne Verwendung von ectopically zum Ausdruck menschlicher Krankheit-assoziierte Proteine. Hier beschreiben wir Methoden um inhärente Proteinaggregation in Caenorhabditis Elegans durch komplementäre Ansätze zu untersuchen. Zunächst untersuchen wir wie zahlreicher Alter synchronisiert C. Elegans wachsen im Alter von Tieren zu erhalten und wir präsentieren die biochemische Verfahren um hoch-unlöslich-große Aggregate zu isolieren. In Kombination mit einer gezielten genetischen Knockdown, ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse an der Förderung oder altersabhängig Proteinaggregation zu verhindern, indem Sie entweder eine umfassende Analyse mit quantitativen Massenspektrometrie sezieren oder eine Kandidaten-basierte Analyse mit Antikörpern. Diese Erkenntnisse werden dann mit transgenen Tieren ausdrücken Leuchtstoff-Tags Aggregation neigen Proteine durch in-Vivo -Analyse bestätigt. Diese Methoden sollen erklären, warum bestimmte Proteine sind anfällig für Aggregat mit zunehmendem Alter und letztlich wie diese Proteine voll funktionsfähig zu halten.

Introduction

Protein misfolding und Aggregation sind ein Markenzeichen von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie AD, PD, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und viele andere anerkannte. Α-Synuclein Baugruppen zu Amyloid-Fibrillen anzusammeln, die beispielsweise als Lewy-Körper vor allem in der Substantia Nigra von Parkinson-Patienten, während bei ALS-Patienten TDP-43 oder FUS Misfold Form zytoplasmatischen Aggregaten in degenerierenden Motoneuronen. In jedem dieser neurodegenerativen Erkrankungen nicht Mechanismen, die Aufrechterhaltung der Homöostase Protein oder Proteostase verhindern die Ansammlung von fehlgefaltete Proteine, folglich zu Krankheit führt.

Proteostase ist entscheidend für die Zellfunktionen zu gewährleisten und unter normalen Bedingungen diese Regulationsmechanismen genau steuern die Rate der Proteinsynthese, Faltung und Abbau. Mehrere Studien zeigen, dass mit der Alterung, allmählich die Fähigkeit vieler Zellen und Organe, Protein Homöostase zu bewahren gefährdet ist und die physiologische Verschlechterung der Proteostase Netze mit zunehmendem Alter ein wichtiger erschwerender Faktor für ist Neurodegenerative Erkrankungen (rezensiert in Referenzen1,2,3). Die Tatsache, dass mit zunehmendem Alter der Protein-Qualitätskontrolle und die zelluläre Reaktion auf unfolded Protein Stress beeinträchtigt werden legt nahe, dass Protein misfolding und Aggregation eine allgemeine Folge des Alterns sein könnte. In der Tat haben wir und andere gezeigt, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheit und stattdessen Teil des Proteoms hoch Waschmittel-unlöslich in Alter Tiere4,5,6,7 wird ,8,9,10. Informatik und in Vivo Analyse ergab, dass diese physiologischen altersbedingte Aggregate Krankheit Aggregate in mehreren Aspekten5ähneln. Die Entdeckung der endogenen, altersabhängigen Proteinaggregation gibt uns die Möglichkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen zu zergliedern, die Proteinaggregation, ohne Verwendung von ectopically ausgedrückt menschliche Krankheit-assoziierte Proteine regulieren. Derzeit gibt es nur begrenzte Informationen über die Regelung der weit verbreitete Protein Unlöslichkeit und über die Auswirkungen dieser Störungen auf die Gesundheit des Organismus.

Der Fadenwurm C. Elegans gehört zu den am häufigsten untersuchten Modellorganismen in der Alternsforschung, wie diese Tiere eine relativ kurze Lebensdauer haben und viele charakteristische Alterung Funktionen in höheren Organismen beobachtet zeigen. Die Auswirkungen des Alterns auf Protein Unlöslichkeit sind untersucht worden, in C. Elegans durch sequentielle biochemische Fraktionierung basierend auf unterschiedliche Löslichkeit, die weit verbreitet ist, extrahieren Sie Krankheit Aggregate im Bereich der Neurodegeneration Research11 . Durch quantitative Massenspektrometrie wurden mehrere hundert Proteine Aggregation-anfällig in C. Elegans in der Abwesenheit von Krankheit5gezeigt. Hier beschreiben wir ausführlich das Protokoll um große Anzahl von Würmern in Flüssigkultur und die sequentielle Extraktion aggregierte Proteine für die Quantifizierung von Massenspektrometrie und Analyse von Western-Blot isolieren zu wachsen. Denn fehlgefaltete und Aggregation neigen Proteine im Alter ansammeln C. Elegans Gonaden und Masken Veränderungen in anderen somatischen Gewebe5,12,13, verwenden wir eine Mutante Gonade-weniger Protein die Analyse darauf Unlöslichkeit in nicht-reproduktiven Geweben. Die vorgestellte Methode ermöglicht die Analyse von hoch-unlösliche, große Aggregate, die unlöslich in 0,5 % SDS und gebeizte durch relativ niedrige zentrifugale Geschwindigkeit. Alternativ wurde eine weniger strenge Extraktion-Protokoll auch kleiner und besser löslichen Aggregate sammeln10an anderer Stelle veröffentlicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Methode zur Aggregation in Vivo in C. Eleganszu beurteilen.

Alles in allem können diese Methoden in Kombination mit RNA-Interferenz (RNAi) die Rolle eines Gens von Interesse an der Modulation der altersabhängigen Proteinaggregation auswerten. Dafür beschreiben wir die Analyse von Auszügen aus jungen und alten Würmer mit und ohne Zuschlag eines spezifischen Proteins des Interesses mit RNAi. Diese Methoden sollte ein leistungsstarkes Tool zum bestimmen, welche Komponenten des Netzwerks Proteostase Protein Unlöslichkeit regulieren. Mehrere Eingriffe reduziert wie Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) 1 Signalisierung (IIS) haben gezeigt, dass C. Elegans Altern14erheblich verzögern. Langlebigkeit-Wege induzieren oft Protein-Qualitätskontrolle-Mechanismen und damit diese Wege könnten aktiv beeinflussen die Rate der Proteinaggregation. Als Beispiel zeigen wir Ihnen reduzierte inhärenten Proteinaggregation in langlebigen Tiere auf Hemmung der IIS-Pfad-7.

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Protocol

Hinweis: Zum besseren Verständnis des Verfahrens, ist eine schematische Darstellung des Workflows (Abbildung 1) befestigt.

1. Wachstum von großen Zahlen von Jugendlichen und im Alter von C. Elegans unterzogen um RNAi gezielt ein Gen von Interesse

Hinweis: Verwendung C. Elegans temperaturbedingte sterile gon-2(q388) Mutanten (CF2253), große Alter synchronisiert Populationen zu erhalten. Bei allen Arbeitsschritten ist es wichtig, unter semi-sterilen Bedingungen mit einer offenen Flamme zu arbeiten und zu prüfen, dass keine Verunreinigungen (z. B. mit Pilzen oder Bakterien) vorhanden sind. Führen Sie die Schritte (auch Centrifugations) bei Raumtemperatur, wenn die Temperatur nicht beschrieben wird.

  1. Vorbereitung von C. Elegans gon-2(-) Mutanten Gonade-weniger Tiere zu erhalten
    Hinweis: Um sterile Tiere fehlen der Gonaden zu erhalten, muss die Verlustfunktion-Mutation in der Elterntiere induziert werden durch die Verlagerung dieser bei der letzten Larvenstadium (L4) bis 25 ° C mütterliche Beitrag zur Vermeidung.
    1. Erste Erweiterung von gon-2(-) Tieren, elterliche Generierung für Temperaturverschiebung zu sammeln
      1. Streak Escherichia coli OP50 Stamm auf einen Teller Lysogeny Brühe (LB) und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 ° C.
      2. Am nächsten Tag 200 mL LB-Medium mit einem OP50 Klon zu impfen und es über Nacht bei 37 ° c inkubieren
      3. Der nächste Tag Samen 15 hohen Wachstum (HG) mittlere Platten (Durchmesser 9 cm) mit 0,5 mL OP50 und OP50 mit einem Spatel verteilen. Die Platten für zwei Tage bei Zimmertemperatur aufbewahren.
      4. Brocken Sie gon-2(-) Tiere (nicht ausgehungert nach den letzten beiden Generationen) auf 15 HG mittlere Teller mit OP50 ausgesät und pflegen sie bei 20 ° C, bis die Platten konfluierende mit Erwachsenen sind und einige OP50 noch vorhanden ist.
      5. In der Zwischenzeit Samen 60 HG mittleren Platten mit OP50 wie unter Schritt 1.1.1.3 und die Platten bei Zimmertemperatur aufbewahren. Achtung: Ausgesät Platten sollte nicht mehr als eine Woche aufbewahrt werden, wie Agar bei Raumtemperatur knackt.
      6. Bleichen Sie konfluierende Platten, sobald die meisten Erwachsenen anfangen, wie zuvor beschrieben15Eier zu legen. Sammeln von Eiern in zwei 15 mL-Tuben und legen Sie auf ein Nutating-Mixer über Nacht bei 20 ° C.
      7. Die nächste Tag Wäsche geschlüpft L1s mit M9 Puffer (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): Zentrifuge bei 3.000 x g für 30 s, verwerfen der Überstand und Füllung bis zu 15 mL-Markierung mit M9. Zentrifugieren, überstand verwerfen, und wiederholen Sie den Schritt 1.1.1.6. Füllen Sie die Rohre mit den daraus resultierenden Wurm Pellets bis zu 15 mL-Markierung mit M9.
      8. Bewerten Sie die Gesamtzahl der L1s mit einem Mikroskop Dissektion durch zählen der L1s vorhanden in 2 µL Tropfen auf nicht ausgesät Agarplatten gelegt. Durchschnitt der Zahlen von mindestens neun Tropfen.
      9. Fügen Sie 6.500 L1s pro ausgesät HG Platte und lassen Sie die Würmer wachsen bei 20 ° C bis L4-Stadium.
    2. Zweite Erweiterung der gon-2(-) Tiere, Gonade-weniger Tiere für Experiment zu erhalten
      1. Verschieben Sie in L4-Stadium die Würmer von Schritt 1.1.1.9 um 25 ° C, bis sie beginnen, Eier zu legen und L1s schlüpfen.
      2. Sammlung von Eiern und L1s durch sedimentation
        Hinweis: Nachdem die Temperaturverschiebung bis 25 ° C ist es vorzuziehen, Sedimentation als sanfte Technik verwenden, um die fragile Eiern und L1s von den Erwachsenen zu trennen.
        1. Waschen Sie die Platten mit M9 mit 5 mL M9 auf fünf Platten. Übertragen Sie die Würmer in 50 mL Röhrchen.
        2. Füllen Sie alle Röhren mit M9 45 mL auffuellen, lassen Sie die Erwachsenen Sediment für ca. 10 min sammeln Sie jeden Überstand in ein 50 mL-Tube und wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Pellet. Zentrifugieren Sie den Überstand, der Eiern und L1s 3.000 x g für 1 min enthält und entfernen Sie den Überstand zu, bis 15 mL übrig lassen Sie L1s Sediment für ca. 10 min.
          Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt. Entfernen Sie nicht des Überstands zu früh, um möglichst viele L1s wie möglich zu sammeln.
        3. Legen Sie die Röhrchen mit Eiern und L1s auf einem Nutating Mixer über Nacht bei 25 ° C.
  2. Flüssigkultur Gonade-weniger Tiere, junge und alte Tiere ausgesetzt RNAi gezielt ein Gen des Interesses zu sammeln
    Hinweis: Die Beantwortung einiger Gene RNAi kann temperaturabhängig als zuvor beschriebenen16sein. Als Alternative zu RNAi könnte ein mutiertes Gen in den gon-2(-) Hintergrund aufgenommen werden.
    1. Vorbereitung der Bakterien für die Flüssigkultur
      1. Bereiten Sie OP50 und RNAi Bakterien (Bakterien produzieren die gewünschten DsRNA und Bakterien mit der leeren Vektor als Steuerelement) durch impfen 4 L LB-Medium mit 12 mL die jeweilige Bakterienkultur (die RNAi eine Endkonzentration von 50 µg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG hinzufügen Bakterienkulturen) und inkubieren sie bei 37 ° C über Nacht bei 180 Umdrehungen pro Minute.
      2. Ernten Sie am nächsten Tag die Kulturen bei 6.700 x g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie die Überstände und Aufschwemmen Sie jedes Pellet in 60 mL eiskaltes S basale Medien (100 mM NaCl, 50 mM Kalium Phosphat pH 6, gehalten auf dem Eis). Die drei resuspendierte Pellets (OP50, Steuern, RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses) bei 4 ° C bis Schritt 1.2.2 und 1.2.3.
        Hinweis: Würmer können auf RNAi von L1 Bühne angebaut werden (siehe Punkt 1.2.3) oder zur Vermeidung von Entwicklungsschäden aus dem letzten Larvenstadium L4 (siehe Punkt 1.2.2).
    2. Flüssigkultur für die Behandlung mit RNAi beginnend am letzten Larvenstadium L4
      1. Fügen Sie 200 mL S basale Medien in einem Fernbach Kultur Kolben (Kapazität 2.800 mL). Für eine endgültige Kulturvolumen von 300 mL (siehe 1.2.2.4), fügen Sie 10 mM Kalium Citrat, pH 6, 3 mL Spur Metalle Lösung (5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 2,5 mM FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL Carbendazim und 5 µg/mL Cholesterin). Schließen Sie die Flasche mit einem Membran-Schraubverschluss. Siehe Tabelle 1 für Rezepte von Puffern.
      2. Nehmen Sie die L1s aus 25 ° C (Schritt 1.1.2.2.3) und übertragen Sie sie auf 15 mL-Tuben. 1.900 x g für 3 min Zentrifugieren Sie, entfernen Sie überstand zu und zählen Sie die L1s pro 2 µL wie in Schritt 1.1.1.8. Fügen Sie 500.000 L1s in den Fernbach Kultur Kolben im vorherigen Schritt vorbereitet.
      3. Fügen Sie OP50 (aus Schritt 1.2.1) proportional zur Anzahl der Würmer. Fügen Sie z. B. für 500.000 Würmer 60 mL OP50.
      4. Komplette Wurm Kultur mit S basale bringen das Gesamtvolumen auf 300 mL. Inkubieren Sie die Wurm-Kultur bis L4-Stadium bei 25 ° C in einem schütteln Inkubator mit 150 u/min.
      5. Am nächsten Tag sollte die Würmer die Größe der Wildtyp L4s. Zum Ändern von OP50 RNAi Bakterien sammeln Tiere in sechs 50 mL-Tuben, lassen Sediment und Entfernen des Überstands. Waschen Sie die L4s mit M9, passives OP50 Bakterien zu entfernen: 1900 X g für 3 min Zentrifugieren, überstand zu entfernen und alle L4s in einem 50 mL-Tube übertragen. Zählen Sie die L4s pro 5 µL (mindestens neun Mal). Zwei Mal 50.000 L4s sind notwendig für die junge Wurm-Sammlung und zwei mal 100.000 L4s sind für die Sammlung alter Wurm benötigt.
      6. Bereiten Sie vier Fernbach Kulturflaschen wie 1.2.2.1 beschrieben. Fügen Sie auch eine Endkonzentration von 50 µg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG zu jedem Kolben.
      7. Fügen Sie Steuerelement RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses (aus Schritt 1.2.1) proportional zu der Anzahl der Würmer: 7 mL der jeweiligen Bakterien pro Flasche für junge Würmer und 14 mL pro Flasche für die gealterte Würmer hinzufügen.
      8. Fügen Sie 50.000 Würmer pro Flasche für die junge Wurm-Sammlung und 100.000 Würmer pro Flasche für die Sammlung alter Wurm und vervollständigen Sie die Kulturen mit basalen S, bis zu 300 mL zu füllen. Inkubieren Sie die Wurm-Kulturen (vier insgesamt) bei 25 ° C und 150 u/min.
    3. Flüssigkultur für die Behandlung mit RNAi L1 Stadium ab
      1. Bereiten Sie vier Fernbach Kulturflaschen wie 1.2.2.1 unter und fügen Sie eine Endkonzentration von 50 µg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG.
      2. Fahren Sie mit der Vorbereitung der L1s wie in 1.2.2.2 beschrieben. Insgesamt sind 300.000 Würmer musste sie in vier Fläschchen zu unterteilen.
      3. Fügen Sie Steuerelement RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses (aus Schritt 1.2.1) proportional zu der Anzahl von Würmern wie unter Schritt 1.2.2.7 und berücksichtigen auch die Wachstumsphase zwischen L1 und L4-Stadium: Hinzufügen der jeweiligen Bakterien pro Flasche für junge w 13 mL ORMs und 26 mL pro Flasche für die gealterte Würmer.
      4. Weiter wie in Schritt 1.2.2.8 beschrieben.
    4. Wartung von C. Elegans flüssige Kulturen
      1. Ein Aliquot von jedem Flüssigkultur und Ort regelmäßig zu sammeln, auf einen Objektträger (alternativ auf einer Nährbodenplatte) um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen gibt. Prüfen Sie eine Dissektion Mikroskop, die bakterielle Essen in der Kultur vor allem während der Wachstumsphase. Bereiten Sie im Voraus 2 L Kulturen des Steuerelements RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für das gen des Interesses wie unter Punkt 1.2.1 beschrieben. Fügen Sie diese in C. Elegans flüssige Kulturen bei Bedarf und halten Sie den Rest bei 4 ° C.
      2. In regelmäßigen Abständen zu überprüfen, dass die Tiere steril sind. Die meisten Tiere haben keine Gonade. Je nach die Penetranz der Mutation Gon-2 einige möglicherweise Gonaden Strukturen abgebrochen haben, aber keine Tiere mit Eiern sollten beachtet werden.
  3. Sammlung von jungen und alten Würmer RNAi in Flüssigkultur ausgesetzt
    Hinweis: Die folgenden Schritte sind für eine Flüssigkultur Kolben aber beide Kulturen im gleichen Alter mit Steuerung und RNAi Bakterien für das gen des Interesses sollten zusammen verarbeitet werden.
    1. Sammeln Sie junge Würmer am Tag 2 oder Tag 3 basalen Niveau des Proteins Unlöslichkeit messen. Im Alter von Würmern sollte (spätestens) genommen werden, wenn die Hälfte der Bevölkerung ist gestorben. Um dies festzustellen, sind tot und lebendig Würmer in einige Tropfen flüssigen Kultur auf einer Nährbodenplatte platziert gezählt. Kennzahlen werden über mindestens neun Tropfen gemittelt.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten: 1 L M9, 1 L M9 mit 0,01 % Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) und 40 mL 60 % Saccharose in DdH2O. halten die Reagenzien auf Eis.
    3. Gießen Sie die Würmer aus einer Flasche in einen Trichter, Trennung und lassen Sie die Würmer Sediment für 10 min bei Raumtemperatur. Öffnen Sie den Absperrhahn und tropft die Würmer in einem 50 mL-Tube.
    4. Der Wurm Pellet in zwei 15 mL-Tuben aufgeteilt und Zentrifugieren bei 1.900 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Um die Würmer zu waschen, entfernen Sie den Überstand und füllen Sie bis zu 15 mL mit M9. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Schließlich die Würmer auf zwei 50 mL Röhrchen übertragen und auf 20 mL Gesamtvolumen mit eiskalten M9 auffüllen.
    5. Entfernen Bakterien und toten Würmer, fügen Sie die beiden 20 mL verdünnt Wurm Pellets, zwei 50-mL-Röhrchen gefüllt mit 20 mL eiskaltes 60 % Saccharose. Zentrifugieren Sie schnell bei 2.700 x g für 5 min bei Raumtemperatur, 9 Beschleunigung und Abbremsung 7. Entfernen Sie vorsichtig die obere Wurm-Schicht mit einem großen Pipettieren (25 mL). Nehmen Sie bis zu 15 mL (aber weniger, wenn es gibt offensichtlich eine Menge Tote Würmer). Setzen Sie diese direkt in 37 mL M9 + Octoxynol-9 (3 Tuben pro Saccharose Rohr) auf Eis zubereitet. Zentrifugieren Sie bei 2.700 x g für 3 min bei Raumtemperatur, Beschleunigung, 9 und 7 Verzögerung.
      Hinweis: Beide müssen eiskalt sein; Ansonsten funktioniert die Trennung nicht. Nicht mischen! Da Saccharose giftig für die Würmer ist ist es wichtig, schnell für den folgenden Schritt zu sein.
    6. Teilen Sie das Pellet in vier 15 mL-Tuben und waschen zweimal mit eiskalten M9 + Octoxynol-9: Zentrifuge bei 1.900 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überstand, füllen Sie bis 15 mL-Markierung mit eiskalten M9 + Octoxynol-9 und Prozedur wiederholen.
    7. Einmal waschen mit eiskalten M9 und kombinieren die vier Röhren, zwei Röhren. Mit M9 bei Raumtemperatur zu einem Gesamtvolumen von 4 mL in 15 mL-Tuben füllen und auf dem Nutating bei 25 ° C für 40 min. drehen.
      Hinweis: Dadurch werden die Würmer, alle verbleibenden Bakterien im Darm zu verdauen. Überprüfen Sie die Würmer unter dem Mikroskop zu sehen, dass es keine Toten.
    8. Waschen Sie die Würmer zweimal mit eiskalten M9 + Octoxynol-9, wie in 1.3.5 beschrieben. Waschen Sie zweimal mit M9 und übertragen Sie die Würmer auf einem Rohr.
    9. Waschen Sie die Würmer einmal in dem Zusammenbau (RAB) hohem Salzgehalt Extraktionspuffer ohne Inhibitoren (0,1 M 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES), 1 mM Ethyleneglycoltetraacetic Säure (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl 0,02 M Natriumfluorid (NaF)) vor der Abholung. Entfernen Sie den Überstand erst gibt es keine Flüssigkeit auf den Wurm Pellet.
      Hinweis: Dieser Schritt und die nächste sollte schnell getan werden, um Artefakte in den Würmern verursacht durch die hohe Salzkonzentration im Puffer zu vermeiden.
    10. Schätzen Sie das Volumen der Wurm Pellet und fügen Sie eine identische Volumen von RAB mit Inhibitoren (2 x Protease-Inhibitor-Cocktail). Mit einer Pasteurpipette, zeichnen sich die Würmer und tropft langsam in ein 50 mL-Tube, die Hälfte mit flüssigem Stickstoff in Trockeneis gelegt gefüllt. Lassen Sie den flüssigen Stickstoff verdampft und die gefrorenen Würmer bei-80 ° C bis zur Weiterverarbeitung zu lagern.
      Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur; angemessenen Schutz zu tragen.

(2) unlöslichen Protein Extraktion mit jungen und alten Tieren ausgesetzt RNAi gezielt ein Gen des Interesses

  1. Störung der Tiere, die in Schritt 1.3 gesammelt
    Hinweis: Es ist wichtig, zu vermeiden alle Auftauen der Wurm Proben. Der Mörtel mit flüssigem Stickstoff abgekühlt und führen die komplette Prozedur auf Trockeneis.
    Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur; angemessenen Schutz zu tragen.
    1. Die gefrorenen Würmer auf den vorgekühlten Mörtel übertragen und für 2,5 min. mahlen.
      Hinweis: Achten Sie beim Schleifen: zu Beginn, die gefrorenen Würmer sind in kleine Kugeln und es ist leicht, sie zu verlieren.
    2. Flüssiger Stickstoff (ca. 100 mL) hinzu kommt das Pulver wieder abkühlen und Schleifen für eine weitere 2,5 min. Check mit dem Mikroskop, dass der Wurm Körper gebrochen sind. Übertragen Sie das Pulver in 2 mL-Tuben und bei-80 ° c aufbewahren
  2. Schnelle unlöslichen Protein Extraktion für Western-Blot Analyse
    Hinweis: Verwenden Sie diese Methode, um die Gesamt-Protein Inhalt und unlöslichen Protein Ebenen zwischen den verschiedenen Tagen mit und ohne RNAi gezielt das gen des Interesses zu vergleichen. Führen Sie alle Schritte bis zum Schritt 2.2.3 auf Eis!
    1. Solubilisieren 50 mg geschliffene Schnecken aus Schritt 2.1 mit 150 µL Tests (RIPA) Testpuffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS), 0,5 % Natrium Deoxycholate (SDO), 1 % Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF), 1 x Protease-Inhibitor-Cocktail). Homogenisieren der Suspension mit einer 1 mL Spritze mit grauen Nadel (27 x ½", 0,4 mm x 13 mm); Aufstellen der Suspension 10 Mal.
    2. Zentrifuge bei 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand zu sammeln.
    3. Aufschwemmen Sie das Pellet in 100 µL RIPA Puffer und Zentrifuge 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand, drehen Sie kurz und achten Sie darauf, um übrig gebliebene überstand zu entfernen.
    4. Um die sehr unlösliche Proteine zu solubilisieren, Aufschwemmen Sie das Pellet in 75 µL Harnstoff/SDS Puffers (8 M Harnstoff, 2 % SDS, 50 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Um den Gesamtproteingehalt zu analysieren, kombinieren Sie die ersten RIPA aus Schritt 2.2.2 überstand und der Harnstoff/SDS Pellet Wiederfreisetzung. Um für die Volumes verwendet für die Extraktion zu berücksichtigen, sollte die gesamte Fraktion RIPA überstand zwei Drittel und ein Drittel der Harnstoff/SDS Pellet Bruchteil enthalten. Überprüfen Sie auf einem kleinen 4-12 % Steigung Gel das Niveau der unlöslichen Protein durch Laden 9 µL der Harnstoff/SDS-Fraktion und 4 µL kombinierte Gesamtprotein. Führen Sie eine Gesamt-Protein Fleck Färbung um die Protein-Ebene zu überwachen. Durch Western Blot mit spezifischen Antikörpern, Änderungen in Unlöslichkeit für einzelne Proteine durch Massenspektrometrie quantifiziert überprüfen (siehe Abschnitt 3).
  3. Unlösliche Proteingewinnung SDS-unlösliche Proteine für die Massenspektrometrie isolieren
    Hinweis: Führen Sie alle Schritte auf dem Eis.
    1. Auf Trockeneis Mal wiegen zwei 350 mg geschliffene Schnecken pro Zeitpunkt und RNAi Bakterien (junger und Alter Würmer kontrollieren RNAi Bakterien und RNAi Bakterien für gen von Interesse) in 2 mL Röhrchen.
    2. Um die hohem Salzgehalt lösliche Proteine zu entfernen, fügen Sie zwei Bände von RAB pro Gewicht (700 µL) mit Inhibitoren, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNase I und 100 µg/mL RNase A zu jedem tube und lösen das Pulver auf dem Eis. Erarbeiten der Suspension in eine 1 mL Spritze (graue Nadel, 27 x ½", 0,4 mm x 13 mm) 15 Mal und auf Eis für 10 min. Zentrifuge 18.400 x g für 20 min bei 4 ° c inkubieren Gehen Sie durch die Fettschicht und sammeln Sie den Überstand mit hohem Salzgehalt lösliche Proteine in einer 2 mL-Tube pro Zustand (insgesamt vier Röhren). Das Fett zu entfernen und entsorgen. Aliquoten hohem Salzgehalt lösliche Proteine zu frieren bei-80 ° C.
    3. Um Lipide zu verwerfen, anderweitig das Pellet mit 700 µL RAB mit Inhibitoren mit 1 M Saccharose (ohne DNase I und RNase A). Erarbeiten der Suspension in eine Spritze 10 Mal und auf Eis für 5 min. Zentrifuge 18.400 x g für 20 min bei 4 ° c inkubieren Achten Sie darauf, alle überstand und Lipide entfernen und entsorgen.
    4. Um SDS-lösliche Proteine zu entfernen, lösen Sie das Pellet mit 700 µL RIPA Puffer. Erarbeiten der Suspension in eine Spritze 10 Mal und inkubieren Sie es für 10 min auf Eis. Zentrifuge bei 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Sammeln des Überstands mit SDS-lösliche Proteine und Aliquot für das Einfrieren bei-80 ° C.
    5. Bündeln Sie zwei Proben von jedem Zustand zusammen nach jedes Pellet mit 500 µL RIPA Puffer Gefäss-. Aufstellen der Suspension in eine Spritze 10-Mal. Zentrifuge bei 18.400 x g für 20 min bei 4 ° C. Achten Sie darauf, alle überstand entfernen und entsorgen es.
      Hinweis: Das Ziel der Extraktion ist die unlösliche Proteine die löslichen Proteine getrennt. Daher ist es wichtig, alle restlichen RIPA überstand vor dem Hinzufügen von Ameisensäure im nächsten Schritt zu entfernen.
    6. Solubilisieren Sie die endgültige Pellet mit sehr unlösliche Proteine mit 400 µL 70 % Ameisensäure und erarbeiten Sie die Aussetzung in eine Spritze 20 Mal. Inkubieren Sie für 20 min auf Eis. Zentrifugieren Sie bei 50.000 x g für 20 min bei 4 ° C, 3 Beschleunigung und Verzögerung 5, Wurm Kutikula Ablagerungen zu entfernen. Sammeln des Überstands, der sehr unlösliche Proteine enthält und bei-80 ° c eingefroren
    7. Dialyse von unlöslichen Proteinfraktionen für die Massenspektrometrie
      Hinweis: Dialyse bei 4 ° C.
      1. 8 L-Dialyse-Puffer (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7,5) vorzubereiten und zu acht 1 L Becher dividiert. Platzieren Sie drei Membranen (Membranfilter = 0,025 µM) auf der Oberfläche der Puffer für jede 1 L Becher.
      2. Pro Membran laden Sie sorgfältig 65 µL des unlöslichen Proteins in Ameisensäure in Schritt 2.3.6 erhaltenen solubilisiert. Jede Bedingung gliedert sich in sechs Membranen.
      3. Überprüfen Sie den pH-Wert einer Probe von 5 µL entfernen und fügen ihn auf einen pH-Streifen. Wenn der pH-Wert zwischen 7 und 8 (nach ca. 2 h), sammeln der Probenmaterials durch Pipettieren sanft rauf und runter. Schließlich verwenden Sie 10 µL-Dialyse-Puffer, um den Niederschlag aus jede Membran zu waschen. Einfrieren der Proben bei-80 ° C.

3. umfassende Identifizierung und Quantifizierung der Änderungen im Protein Unlöslichkeit mit zunehmendem Alter induziert durch RNAi gezielt ein Gen des Interesses

  1. Vorbereitung auf Mass Spectrometry Analyse
    1. Bewerten Sie die Menge an unlöslichen Proteine in den dialysierten Proben durch das Laden einer Aliquoten auf ein 4-12 % Steigung Gel zusammen mit einer Referenzprobe bekannter Konzentration. Führen Sie eine Gesamt-Protein Gel Färbung und quantifizieren Sie die Protein-Menge mit einer Bildanalyse-Software. Dieser Schritt ist notwendig, die Menge von Trypsin benötigt für die Verdauung (Schritt 3.1.4) zu schätzen.
    2. Konzentrieren Sie die Proben unter Verwendung eines Kreiselpumpen Verdampfers zu und solubilisieren Sie die unlösliche Proteine in einer Endkonzentration von 8 M Harnstoff.
    3. Alkylierung und Reduzierung
      1. Fügen Sie Tris(2-carboxyethyl) Phosphin-Hydrochlorid (DÄMMUND), eine Endkonzentration von 4 mM auf die Proben. 1 h bei 57 ° C mit 300 u/min inkubieren. Setzen Sie die Proben auf Raumtemperatur.
      2. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 8,4 mM Iodoacetamide. Inkubieren sie 45 min (2 h inkubiert werden) im Dunkeln bei Raumtemperatur.
      3. Verdünnen Sie die Proben in 150 mM Ammonium Bicarbonat, eine Endkonzentration 2 M Harnstoff zu erhalten.
    4. Digest-Proteine mit 5 % w/w verändert Trypsin über Nacht bei 37 ° C und 400 u/min.
    5. Laden Sie eine Probe der verdaute Proteine auf einem 12 % SDS-Gel und führen Sie eine Gesamt-Protein Gel Färbung zu analysieren, ob die Verdauung funktioniert. Noch gibt es einige Bands anwesend, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4 und 3.1.5.
    6. Peptide aus jungen und alten Kontroll- und RNAi behandelt C. Elegans sind mit Isobaren Tags für relative und absolute Quantifizierung nach den Anweisungen des Herstellers gekennzeichnet.
      Hinweis: Alternativ könnte andere Methoden zur Kennzeichnung der Peptide oder Proteine zur Quantifizierung z. B. Tandem mass Tags verwendet werden.
      Hinweis: Mass Spectrometry Analyse: zum Beispiel Komplexität zu reduzieren, sollten Peptide in verschiedene Fraktionen für Massenspektrometrie Analyse5durch starke Kationenaustausch-Chromatographie getrennt werden. Einige Massenspektrometer sind in der Lage analysieren isobare Tags für relative und absolute Quantifizierung wie17an anderer Stelle beschrieben. Die gewonnenen Daten sollten mit der entsprechenden Software verarbeitet werden. Alles in allem ermöglicht diese Analyse die Identifikation von hoch unlösliche Proteine und deren Veränderungen nach Alter und nach Proteostase Modulation.

4. in Vivo Evaluierung des Einflusses eines Gens von Interesse auf die Aggregation Muster während der Alterung

  1. Wählen Sie aus der Massenspektrometrie Analyse in Abschnitt 3 eine altersabhängige Aggregation neigende Protein, die in unterschiedlichem Ausmaß in die Tiere ausgesetzt RNAi ansammelt. Generieren von transgenen C. Elegans Linien mit dem Ausdruck dieses Proteins markiert mit einem fluoreszierenden Protein und unter der Kontrolle der jeweiligen Veranstalter oder einen gewebespezifischen Promoter (siehe Diskussion für die Wahl einer geeigneten Förderer). Halten Sie die Dehnung bei 15 ° C mittels standardisierter Techniken auf Nematoden Wachstum (NG) Platten mit OP50 ausgesät. Zum Beispiel wählten wir einen Wurm-Stamm mit dem Ausdruck Polyadenylate-bindendes Protein (PAB-1) verschmolzen am N-Terminus, TagRFP unter der Kontrolle der pharyngealen Muskulatur Promotor Pmyo-2.
  2. In Vivo Bewertung der Veränderungen beim Aggregation mit dem Alter nach Hemmung des Gens von Interesse
    1. Ein bis zwei Tage im Voraus vorbereiten NG/Carbenicillin (Carb) / IPTG Platten mit einer Steuerung (leerer RNAi Vektor L4440) Bakterien und RNAi Bakterien, das gen des Interesses zu hemmen. (Für ein detailliertes Protokoll über RNAi in C. Elegans siehe Jupiter Science Education Database. Grundlagen der Biologie 1: Hefe, Drosophila und C. Elegans. RNAi in C. Elegans. Jupiter, Cambridge, MA, Doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. Ort eierlegende Würmer auf mehrere separate für RNAi Behandlung von L1 Nutsteine NG/Carb/IPTG (6 cm Durchmesser) mit RNAi oder RNAi Bakterien für das gen des Interesses bei 20 ° c ausgesät Entfernen Sie die Erwachsenen nach 2 h, halten die Nachkommen bei 20 ° C. Zur Vermeidung von Entwicklungsschäden können RNAi-Behandlungen nach dem Larvenstadium L4 gestartet werden.
    3. Sobald die Nachkommen der L4 Larvenstadium erreicht, übertragen Sie diese L4s auf neue NG/Carb/IPTG Teller ausgesät mit RNAi oder RNAi Bakterien für das gen des Interesses. Neun Platten mit 15 transgene für beide Bedingungen richten Sie ein und halten sie bei 20 ° C. Die Alterung Würmer Weg von ihren Nachkommen zu neuen Platten jeden zweiten Tag bis zum Ende ihrer reproduktiven Periode übertragen werden müssen um sie von ihren Nachkommen unterscheiden zu können.
    4. Bewerten Sie Veränderungen in der Verteilung der Aggregation neigende Protein mit einer fluoreszierenden Tag unter einem fluoreszierenden Stereo-Mikroskop mit 24 X Vergrößerung im Erwachsenenalter, jeden zweiten Tag markiert.
      Hinweis: Die altersabhängigen Ansammlung Aggregation neigende Proteins in hellen Puncta dient als einen Ausdruck für die Aggregation. Diese Puncta sollte sehr unbeweglich Strukturen als Zuschlagstoffe charakterisiert werden. Dies sollte durch Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie bestimmt werden. Für aggregierte Protein sollte keine Erholung nach mindestens 4 min5,18in der gebleichten Region beobachtet werden. Um die Veränderungen mit dem Alter zu quantifizieren, erzielten wir die Verteilungsmuster der Alter synchronisiert Worms überexprimierenden PAB-1 am Tag 2, Tag 5 und 7. Tag des Erwachsenenalters wie folgt: niedrige Aggregationsebenen (0-10 tagRFP::PAB-1 Puncta im hinteren Rachenraum Birne), mittlere Aggregationsebenen (mehr als 10 Puncta in den hinteren Rachenraum Birne) und hohen Aggregationsniveaus (mehr als 10 Puncta in der vorderen pharyngealen Birne).

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Representative Results

Wir verwendet um wie langlebigen Tiere mit bewerten hier vorgestellten Methoden reduzierte IIS modulieren altersabhängigen Proteinaggregation. Durch Western blot (siehe Punkt 2.2, schnell unlöslichen Protein Extraktion für Western-Blot Analyse), analysiert die Summe und die unlösliche Eiweißgehalt von Young (Tag 3 des Erwachsenenalters) und im Alter von (18. Tag des Erwachsenenalters) Würmer auf Kontrolle RNAi und RNAi gezielt das Insulin / IGF-1-Like-Rezeptor Daf-2. Wir beobachteten keine großen Änderungen im gesamten Protein-Ebene mit dem Alter oder zwischen Kontrolle und Daf-2 RNAi Bedingungen (Abb. 2A). Wie erwartet, erkannt wir eine starke altersbedingte Zunahme in Ebenen hoch-unlösliche Proteine in Kontrolltieren (Abbildung 2B). Im Vergleich dazu bei den langlebigen Tieren auf Daf-2 RNAi war Aggregation Neigung stark reduziert. Ganze Protein Färbung der unlöslichen Auszüge offenbart eine weniger komplexe Band Proteinmuster in Auszügen aus 18 Tage alten Worms auf Daf-2 RNAi im Vergleich zu Kontrollen Alter abgestimmt. Quantitative Massenspektrometrie Analyse ergab, dass langlebige Tiere mit reduzierten IIS insgesamt weniger altersassoziierter Proteinaggregation haben und wichtiger ist, Daf-2 Hemmung völlig die altersabhängigen Unlöslichkeit von aufgehoben einem bestimmte Teilmenge von Proteinen7. Follow-up auf diesen Erkenntnissen konzentrierten wir uns auf eines dieser Aggregation neigen Proteine, PAB-1. PAB-1 ist ein RNA-bindende Protein mit einer prognostizierten "Prion-Like"-Domain. Antikörper Färbung bestätigt, dass langlebige Tiere PAB-1 mit dem Alter (Abbildung 2C) löslich gepflegt.

Für in Vivo Analyse der PAB-1 Aggregation produzierten wir transgene Tiere mit dem Ausdruck tagRFP::PAB-1 in der pharyngealen Muskulatur. Bei Jungtieren tagRFP::PAB-1 befand sich hauptsächlich diffus in den Pharynx (Abb. 3A, "niedrig" Aggregationsebene) aber mit zunehmendem Alter, wir beobachteten eine progressive Akkumulation in hellen Puncta, beginnend in der hinteren Rachenraum Zwiebel ( Abbildung 3A, "intermediate" Aggregationsebene). Während des Alterns beobachteten wir auch Aggregation in der vorderen pharyngealen Birne (Abb. 3A, "hoch" Aggregationsebene) in einer zunehmenden Zahl von Tieren. Durch Gruppierung Tiere in diese Kategorien erzielte wir die Rate der PAB-1 Aggregation in einer Population. Am 2. Tag des Erwachsenenalters die meisten Würmer (88 %) hatten keine oder sehr wenige Puncta und keine Tiere mit hohen Aggregationsniveaus erkannt wurden. 19 % der Bevölkerung zeigte zwischen- und 16 % hohen Aggregationsniveaus, während am 7.Tag mehr als 70 % der Würmer präsentiert schon am Tag 5 mittleren und hohen Aggregationsniveaus. Um die Wirkung der Langlebigkeit auf der altersabhängigen Aggregation von TagRFP:PAB zu analysieren-1, wir generierten transgenen tagRFP::PAB-1-Würmer mit einer Daf-2 Mutation. Diese Tiere zeigten deutlich reduzierten TagRFP:PAB-1 Puncta Bildung mit dem Altern, mit weniger als 15 % der Bevölkerung, die mittleren und hohen Aggregationsniveaus sogar auf Tag 7 (Abbildung 3B) ausstellen.

Durch die Verwendung der verschiedenen Ansätze beschrieben hier, ergab wir, dass reduzierte IIS altersabhängigen Proteinaggregation in unterschiedlichem Maße verhindert und langlebigen Tiere besonders effizient sind bei der Wiederherstellung der Dynamik von PAB-17.

Figure 1
Abbildung 1 : Schaltplan des Workflows, Veränderungen im inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in studieren C. Elegans.  Hauptschritte sind fett gedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Protein Unlöslichkeit steigt mit dem Alter in Kontrolltieren, aber nicht bei Tieren mit Signalisierung reduzierte Daf-2 . (A) Gesamt-Protein Färbung des gesamten Bruchteil von Tag 3 und Tag 18 gon-2(-) -Mutanten, die Kontrolle und Daf-2 RNAi (gewachsen bei 25 ° C) ausgesetzt. (B) Gesamt-Protein Färbung des SDS-unlösliche Fraktion aus Tag 3 und Tag 18 gon-2(-) -Mutanten, die Kontrolle und Daf-2 RNAi (gewachsen bei 25 ° C) ausgesetzt. Panel von Referenz7neu aufgelegt. (C) Immunoblot Erkennung von PAB-1 in SDS-unlösliche Bruchteil relevanten Protein Bands mit roten Pfeil angezeigt. Panel von Referenz7neu aufgelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Reduzierte Daf-2 Signalisierung verhindert die Ansammlung von tagRFP::PAB-1 Puncta mit zunehmendem Alter. (A) repräsentative Bilder von Worms mit tagRFP::PAB-1-Überexpression in der pharyngealen Muskulatur (hoher Vergrößerung Mikroskop, TagRFP Erkennung Einstellungen: Erregung 558 nm, Emission 583 nm). Tiere mit niedrig (0-10 tagRFP::PAB-1 Puncta im hinteren Rachenraum Birne), Mittelstufe (mehr als 10 Puncta in den hinteren Rachenraum Birne) oder hohen Aggregationsniveaus (mehr als 10 Puncta in der vorderen pharyngealen Birne) werden angezeigt. Maßstabsleiste = 20 µm. (B) Quantifizierung der verschiedenen tagRFP::PAB-1-Aggregation Ebenen mit dem Alter in Wildtyp und Daf-2 Mutanten Hintergrund zeigt stark verzögerten tagRFP::PAB-1-Aggregation mit Alter bei langlebigen Tieren. Tag2, Tag 5 und 7. Tag daf-2(-) im Vergleich zu Wildtyp-Hintergrund, niedrig im Vergleich zu den mittleren und hohen Aggregationsniveaus: Fishers exakter Test, ***p < 0,0001. Panel von Referenz7neu aufgelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Stammlösung Betrag Endkonzentration Kommentare/Beschreibung
Flüssigkultur, Gesamtvolumen 300 mL
S (für 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Kalium Phosphat pH 6) basale 200 mL 1 M Kalium Phosphat pH 6: für 1 L: 129 g KH2PO4 monobasic, 52 g K2HPO4 Diabas-wasserfrei
1 M Kalium Citrat pH 6 (für 400 mL: 13,1 g Zitronensäure Monohydrat, 134,4 g Tri-Kalium-Citrat-Monohydrat) 3 mL 10 mM
Spur Metalle Lösung (für 1 L: 1,86 g Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O) 3 mL Shop-Stammlösung im Dunkeln bei 4 ° C
1 M MgSO4 (für 500 mL: 123,3 g) 900 ΜL 3 mM
1 M CaCl2 (für 500 mL: 73,5 g) 900 ΜL 3 mM
200 µg/mL Carbendazim (für 50 mL: 10 mg in Methanol) 150 ΜL 100 ng/mL
5 mg/mL Cholesterin (für 100 mL: 0,5 g Ethanol) 300 ΜL 5 µg/mL
Zusammenbau (RAB) hohem Salzgehalt Extraktionspuffer, 30 mL
1 M 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES) 3 mL 100 mM RAB-Lager Puffer-Komponente
0,5 M Ethyleneglycoltetraacetic Säure (EGTA) 60 ΜL 1 mM RAB-Lager Puffer-Komponente
0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) 6 ΜL 0,1 mM RAB-Lager Puffer-Komponente
1 M MgSO4 15 ΜL 0,5 mM RAB-Lager Puffer-Komponente
5 M NaCl 4,5 mL 750 mM RAB-Lager Puffer-Komponente
1 M Natriumfluorid (NaF) 600 ΜL 20 mM RAB-Lager Puffer-Komponente
Bis 30 mL insgesamt mit DdH2O komplett
50 x Protease-Inhibitor-Cocktail * 2 x * Fügen Sie Reagenzien nach unter der Menge an RAB Lager Puffer, die benötigt wird (für die Extraktion für Massenspektrometrie 6 mL).
100 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) in Isopropanol,-20 ° C * 1 mM
10 U/µL DNaseI * 200 U/mL
4 mg/mL RNaseA * 100 µg/mL
RAB mit 1 M Saccharose, 30 mL
2 M Saccharose (für 50 mL: 34,2 g) 15 mL 1 M Fügen Sie die RAB Puffer Reagenzien neben DNaseI und RNaseA
Tests (RIPA) Testpuffer, 30 mL
1 M Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) pH 8 1,5 mL 50 mM RIPA Lager Puffer Komponente
5 M NaCl 0,9 mL 150 mM RIPA Lager Puffer Komponente
0,5 M EDTA 0,3 mL 5 mM RIPA Lager Puffer Komponente
10 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) 1,5 mL 0,50 % RIPA Lager Puffer Komponente
10 % Natrium Deoxycholate (SDO) 1,5 mL 0,50 % RIPA Lager Puffer Komponente
Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) 0,3 mL 1 % RIPA Lager Puffer Komponente
Bis 30 mL insgesamt mit DdH2O komplett
100 mM PMSF * 1 mM * Fügen Sie Reagenzien nach unter der Menge an RIPA Lager Puffer, die benötigt wird (für die Extraktion für Massenspektrometrie 10 mL).
50 x Protease-Inhibitor-Cocktail * 1 x
Harnstoff/SDS Puffers, 10 mL
Harnstoff 4,8 g 8 M
10 % SDS 2 mL 2 %
Dithiothreitol (DTT) 77 mg 50 mM
1 M Tris pH 8 0,5 mL 50 mM
Füllen Sie 10 ml insgesamt mit DdH2O
Dialyse-Puffer, 1 L
Tris 6 g 50 mM
DVB-T 154 mg 1 mM
100 mM PMSF 1 mL 0,1 mM
Passen Sie auf pH 7,5 und komplett auf insgesamt 1 L mit DdH2O

Tabelle 1: Puffer für Flüssigkultur, unlöslichen Protein Extraktion und Dialyse.

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Discussion

Hier berichten wir über eine Methodik zu isolieren, hoch-unlösliche Aggregate aus Altern C. Elegans RNAi durch Massenspektrometrie und Western blotting für Analyse unterzogen. Wir zeigen, dass Verbesserung Proteostase durch Reduzierung der IIS stark altersabhängig Proteinaggregation verhindert. Wenn Sie spezifische Aggregation neigen Proteine, in C. Elegansoverexpress auswählen, ist es möglich, weitere Mechanismen, die Modulation der inhärenten Proteinaggregation sezieren.

Inhärente altersabhängigen Proteinaggregation Versus krankheitsassoziierten Proteinaggregation
Dieses aktuelle Werk basiert auf bisherigen Erkenntnissen, die Proteinaggregation nicht auf spezifische Proteine aggregieren im Zusammenhang mit einer Krankheit beschränkt. Durch die Fokussierung auf endogene Aggregation neigen Proteine statt ectopically ausgedrückt krankheitsassoziierten Proteine, ist die Erwartung, neuartige Einblicke in physiologischen Regulierung der Aggregation-Prozess bieten. Sobald altersabhängig Proteinaggregaten in verschiedenen zellulären Orten5gefunden werden, sollten ihre Studie auch Fach spezifische Qualitätssicherungsmechanismen Einblick in. Insgesamt konnte die Mechanismen, die inhärenten Proteinaggregation steuern auch bei der Verhinderung von Krankheit Proteinaggregation relevant sein. Der Hinweis Obwohl altersabhängigen Proteinaggregation in mehreren Aspekten Krankheit Proteinaggregation, ähnelt bleibt noch unklar ob diese Aggregate Amyloide-Fibrillen, charakteristisch für viele Krankheiten Aggregate enthalten.

Wahl der C. Elegans Modell: Vorzüge und Grenzen
Im Vergleich zu Säugetieren Modell, ist einer der größten Vorteile der Verwendung von C. Elegans , um eine altersbedingte Merkmal zu studieren seine sehr kurze Lebensdauer. Mehrere hundert Proteine werden konsequent während der Alterung sehr-Aggregation-anfällig und dieser große Anstieg der Unlöslichkeit ist auch mit einem vereinfachten biochemische Gewinnung leicht nachweisbar. Eine große Einschränkung der Verwendung von C. Elegans für das Studium der altersabhängigen Proteinaggregation ist jedoch die Notwendigkeit, große Zahl von alten Tieren zu isolieren. Wie C. Elegans sind Hermaphroditen und produzieren ca. 220 oder mehr Nachkommen während ihrer reproduktiven19 Phase, gilt es zu verhindern Reproduktion oder Nachkommen zu beseitigen, um eine Bevölkerung Altern. Es gibt verschiedene Möglichkeiten um Sterilität zu induzieren: eine Möglichkeit ist, die chemischen Fluorodeoxyuridine (FUdR), ein Inhibitor der DNA-Synthese zu verwenden. FUdR führt jedoch zu zahlreichen Nebenwirkungen, einschließlich Änderungen in der Proteostase und reduziert Protein Aggregation20,21,22. Wichtig ist, induziert FUdR Genotyp-spezifische Reaktionen23. Eine weitere Option ist, temperaturempfindliche sterile Mutanten zu verwenden. Z. B. haben spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), und gon-2(q388) bisher für Massenspektrometrie analysiert der altersabhängigen Aggregation Proteom5verwendet worden, 8.

Dennoch gibt es einige Einschränkungen bei der Verwendung dieser Mutanten. Erstens, da die Sterilität temperaturabhängig ist, ist es notwendig, die Tiere bei 25 ° C wachsen die bildet einer milden Stress und beschleunigt Alterung sowie Proteinaggregation. Umgekehrt haben wir beobachtet, dass Gon-2, Glp-1 und Fem-1 Mutanten langlebiger sind im Vergleich zu Wildtyp-wenn bei 25 ° C (Daten nicht gezeigt) gepflegt. Zweitens gibt es bestimmte Einschränkungen verbunden mit jeder Art von reproduktiven defekt. Ein Nachteil der Verwendung von Sperma-defekt durch Mutation entstehende Variationen ist die Produktion von unbefruchteten Eizellen (auch im Alter Wildtyp Zwitter produziert). Die Qualität dieser Eizellen stark mit dem Alter abnimmt und sie sammeln sich in der Gonade24,25. Quantitative Massenspektrometrie Analyse beweist, dass Spermien-defekt durch Mutation entstehende Variationen mehrere fach höhere unlösliche Proteine, die mit dem Alter im Vergleich zu Gonade-weniger oder Keimbahn-defizienten Mutanten ansammeln. Dies bedeutet Protein misfolding und Aggregation befindet sich in der Gonade5, in Übereinstimmung mit früheren Studien12,13 und in Vivo Experimente aufschlussreiche aggregierte Proteine befindet sich in der abnormen Eizelle Cluster5. Daher würde übermäßige Proteinaggregation in der Gonade mehr subtilen Veränderungen in Proteinaggregation in den somatischen Geweben maskieren. Dies sollte berücksichtigt werden, beim Vergleich von Interventionen, die in unterschiedlichem Maße auf reproduktive und somatischen Gewebe Proteostase handeln. Daher nur somatische Proteinaggregation bewerten, bevorzugen wir mit Gonade-weniger Gon-2 Mutanten. Eine Alternative wäre, Keimbahn-defizienten Glp-1 -Mutanten zu verwenden. Wir beachten Sie jedoch, dass diese Tiere weniger inhärente Proteinaggregation mit zunehmendem Alter im Vergleich zu Gon-2 Mutanten5. Dies ist wahrscheinlich eine Folge der verbesserten Proteostase in somatischen Geweben durch Signalisierung von der Keimbahn-defekt Gonade26,27,28. Eine weitere Alternative ist die Wildtyp Tiere und entfernen Nachkommen jeden Tag durch Sedimentation. Dies ist jedoch problematisch wegen der Schwierigkeit, alle Nachkommen vollständig zu entfernen.

Eine weitere allgemeine Einschränkung der Verwendung von C. Elegans ist seine geringe Größe macht bestimmte Gewebe Extraktionen herausfordernd. Wie diese ganze Tieren Extraktionen keine relevanten Informationen in Bezug auf wie verschiedene Bedingungen vorsehen modulieren Sie Proteinaggregation in bestimmten Geweben. Der Hinweis könnte dieses Problem möglicherweise umgangen werden, indem mit einer neu entwickelten Methode basierend auf Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, um bestimmte Zellen von C. Elegans29zu isolieren. Dennoch bleibt es, festgestellt werden, ob diese Methode geeignet wäre, um genügend Material für die unlöslichen Protein Extraktion zu erhalten und ob es auf anwendbar wäre im Alter von Tieren. Alternativ können Gewebe spezifische Proteinaggregation und ihrer Regulierung durch zusätzliche in-Vivo Experimenten untersucht werden. Als transgene Tiere mit dem Ausdruck ein Eindringmittel beschriftet Aggregation neigende Protein der Wahl schnell generiert werden und wie die Tiere transparent sind, es ist relativ einfach, Protein Aggregation in Situzu untersuchen.

Insgesamt ist es wichtig, follow-up der Proteomik-Ergebnisse mit in Vivo Experimente in einem Wildtyp Hintergrund. Die Kombination von biochemischen und Mikroskopie-basierte Charakterisierung ermöglicht eine umfassende Studie der Proteinaggregation und eine Bewertung der Rolle der Gene von Interesse. Letzteres wird in C. Elegans durch RNAi vermittelte durch Fütterung und die Verfügbarkeit des gesamten Genoms RNAi Bibliotheken erleichtert. Darüber hinaus gibt es eine große Anzahl von zeichnet sich durch Mutation entstehende Variationen von RNAi erzielten Ergebnisse bestätigen oder anstelle von RNAi verwenden.

Flüssigkultur und biochemischen Abbau: Vorteile und Grenzen
Wie hoch aggregierte Proteine nur einen Bruchteil der gesamten Proteine bilden, ist es notwendig, die Extraktion mit einer großen Anzahl von Tieren zu beginnen. Mit großen Mengen von unlöslichen Proteine ist es dann möglich, umfangreiche Peptid Fraktionierung zur Reduzierung der Komplexität der Probe für die Massenspektrometrie und damit Identifikation der unteren reichlich Proteine führen. Wenn nur geringe Mengen an unlösliche Proteine erforderlich sind, ist eine Alternative zu wachsen Würmer auf Tellern anrichten und mit keramischen Perlen zu homogenisieren. Einer der Nachteile der Flüssigkultur ist, dass im Falle einer Kontamination, die ganze Kultur betroffen ist und verworfen werden muss. In der Regel C. Elegans Alterung wird stark beeinflusst durch Temperatur und dieser Parameter muss streng kontrolliert werden, in der flüssigen Kultur, Variationen in altersabhängige Proteinaggregation zu vermeiden. Temperaturregelung ist auch wichtig, eine homogene Bevölkerung von Gonade-weniger Tiere zu erhalten, wenn die gon-2(-) -Mutanten mit.

Je nach Ziel der Studie ist es wichtig, verschiedene Extraktionsmethoden zu berücksichtigen. Die biochemische Gewinnung hier vorgestellten wurde zunächst von Protokollen krankheitsassoziierten Aggregate11,30,31isolieren angepasst. Wir entschieden uns für relativ hohe Konzentrationen von Reinigungsmitteln wie 0,5 % SDS, die mehr unlösliche Aggregate zu isolieren. Auch würde die 0,5 % SDS unlösliche Aggregate mit niedrigen Drehzahlen zentrifugale Pelletierung, dieses Protokoll nur die größeren Aggregaten isolieren. Alternativ wurde eine weniger strenge Protokoll kürzlich veröffentlichten10. In dieser Studie wurden die löslichen und kleinere Aggregate auch durch Weglassen von SDS und die Verwendung sehr hoher Zentrifugalkraft Geschwindigkeiten bei 500.000 x g extrahiert. Ein Vergleich der verschiedenen Protokolle zeigt eine allgemeine Zunahme in der Anzahl der Proteine in der Aggregation Proteomforschung mit weniger strengen Protokoll Nr.7. Wir stellen fest, dass langlebige Tiere mit reduzierter Daf-2 Signalisierung effizient die Ansammlung von SDS-löslich und SDS-unlösliche Aggregate in Gonade-weniger Tiere7 verhindert.

In Vivo Analyse der altersabhängigen Proteinaggregation
Bei der Konstruktion von transgenen Modellen für folgende altersabhängige Proteinaggregation ist es relevant, in welches Gewebe um die Aggregation neigende Protein des Interesses und auf welchen Ebenen Ausdruck overexpress zu betrachten. Wir favorisieren Ausdruck im Gewebe befindet sich im Kopfbereich zu vermeiden mit Autofluoreszenz, die ist prominent in den Darm Alterung. Um Leuchtstofflampen beschriftet Aggregate mit geringer Vergrößerung sichtbar zu machen, sollte die Aggregation neigende Protein auf relativ hohem Niveau ausgedrückt werden. Auf der anderen Seite verursacht zu hoch Ausdruck der Aggregation neigende Protein Form Aggregate bereits bei jungen Tieren.

Zusammen genommen, helfen diese Methoden uns zu verstehen, warum Teil des Proteoms mit zunehmendem Alter aggregiert und letztlich zur Entwicklung von Strategien, die Förderung des gesunden Alterns führen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von DZNE und ein Marie-Curie-International Wiedereingliederungsbeihilfe (322120, D.C.D.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fernbach culture flask  Corning 4425-2XL Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap  Schott 1088655 GL45
Nutating Mixer VWR 444-0148
Separatory funnel Nalgene 4300-1000 Capacity 1,000 ml
1 ml syringe  BD Plastipak 300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm BD Microlance 3 300635
Membrane filters 0.025 µM Millipore VSWP04700
pH strip Machery-Nagel 92110 pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693132001 Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9  Applichem A1388 Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol Applichem A1694 Nonidet P40 (NP40)
DNaseI Roche 04716728001 recombinant, RNase free
RNaseA Promega A7973 solution
Total protein blot staining Thermofisher S11791 Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining Thermofisher S12001 Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) Serva 36970
Iodoacetamide Serva 26710
Ammoniumbicarbonate Sigma-Aldrich 09830
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation Sciex 4352135 iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP Beckmann Coulter 393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP Beckmann Coulter 393315
Centrifuge 5424R Eppendorf 5404000413
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702000329
Centrifuge Megafuge 40R Thermo Scientific 75004518
Concentrator Plus Eppendorf 5305000304 Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC  Leica With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope Leica  Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 Zeiss With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software ImageJ
Analysis of mass spectrometry data Protein Prospector http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50 CGC
RNAi bacteria
L4440 Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253 CGC, strain name: EJ1158  Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochemie Ausgabe 129 Alterung Protein Unlöslichkeit Proteinaggregation Protein misfolding Proteostase C. Elegans Neurodegenerative Erkrankungen Biochemie
Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Groh, N., Gallotta, I., Lechler, M. C., Huang, C., Jung, R., David, D. C. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (129), e56464, doi:10.3791/56464 (2017).

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