Summary
מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.
Abstract
בעשרות השנים האחרונות, השכיחות של הפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), גדל. הפרעות הקשורות לגיל אלה מאופיינים במראה של אגרגטים חלבון עם מבנה fibrillary במוחם של חולים אלו. בדיוק הסיבה חלבונים מסיסים בדרך כלל עוברים תהליך צבירת נשאר ממעטים להבין. גילוי חלבונים צבירת אינה מוגבלת תהליכי מחלה וזה במקום חלק מתהליך הזדקנות נורמלית מאפשר חקר המנגנונים המולקולריים הסלולר המסדירים מצבור חלבון, ללא שימוש ectopically הביע אנושי חלבונים הקשורים למחלה. כאן נתאר מתודולוגיות לבחון צבירת חלבון הגלום ב Caenorhabditis elegans דרך גישות משלימות. ראשית, נבחן כיצד לגדל מספר גדול של גיל-מסונכרנות C. elegans לקבל חיות בגילאי, אנו מציגים את ההליכים ביוכימי כדי לבודד אגרגטים מאוד לא מסיס-גדול. בשילוב עם נוקאאוט גנטי יישוב, זה אפשרי לנתח את התפקיד של גנים של עניין לקדם או למנוע צבירת חלבונים תלויי-גיל באמצעות ספקטרומטר מסה כמותיים או ניתוח מקיף. ניתוח המבוסס על המועמד עם נוגדנים. ממצאים אלה ואז מאושרות על-ידי ניתוח ויוו עם חיות הטרנסגניים המבטאים חלבונים צבירת נוטה מתויג פלורסנט. שיטות אלה צריך לעזור להבהיר מדוע חלבונים מסוימים נוטים צבירה עם הגיל, ובסופו של דבר איך לשמור חלבונים אלה תקינים.
Introduction
חלבון misfolding, צבירת מזוהים בתור סימן היכר של מספר מחלות ניווניות כגון נוירודגנרטיביות (ALS) לספירה, PD, ומובהקת (חדרתי), ועוד רבים אחרים. למשל, הרכבות α-synuclein לתוך הסיבים עמילואיד זה לצבור כמו גופיפי בפרט הסובסטנציה ניגרה של החולים במחלה, ואילו ב- ALS חולים misfold TDP-43 או FUS כדי אגרגטים cytoplasmic טופס המתנוונת מוטורי לגלוקוז. בכל אחד של הפרעות ניווניות אלה, מנגנוני שמירה על הומאוסטזיס חלבון או פרוטוסטאזיס להיכשל כדי למנוע ההצטברות של חלבונים misfolded, וכתוצאה מכך מוביל למחלות.
פרוטוסטאזיס היא קריטית כדי להבטיח תאיים ושליטה בתנאים רגילים מנגנונים רגולטוריים אלה בחוזקה הקצב של סינתזת חלבונים, קיפול, והשפלה. מספר מחקרים מדגימים כי עם ההזדקנות, היכולת של תאים ואיברים רבים, כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון נפרצת בהדרגה, ההידרדרות פיזיולוגיים של הרשתות פרוטוסטאזיס עם הגיל הוא פקטור חשוב מחמירות עבור מחלות ניווניות (נבדקה הפניות1,2,3). העובדה כי את בקרת האיכות של חלבון וגם התגובה התאית פרש חלבון מתח נחשפים עם גיל מציע כי חלבון misfolding, צבירת יכול להיות תוצאה כללית של הזדקנות. אכן, אנחנו ואחרים הראו כי צבירת חלבון אינה מוגבלת למחלות והופך להיות במקום חלק פרוטאום מאוד דטרגנט-לא מסיס חיות בגילאי4,5,6,7 ,8,9,10. ניתוח חישובית, ויוו גילה כי אלה אגרגטים הפיזיולוגיות הקשורות לגיל דומים המחלה אגרגטים היבטים מספר5. הגילוי של צבירת חלבון אנדוגני, תלויי-הגיל נותן לנו את ההזדמנות כדי לנתח את המנגנונים הסלולר המולקולריים המסדירים מצבור חלבון, ללא שימוש ectopically ביטוי חלבונים הקשורים למחלות אנושיות. כיום, קיים מידע מוגבל על התקנון של חלבון נפוץ insolubility ועל ההשפעות של זה dysregulation על הבריאות של האורגניזם.
נמטודות C. elegans הוא אחד האורגניזמים דגם באופן מקיף ביותר למד ב הזדקנות מחקר כמו החיות האלה יש אורך חיים קצר יחסית ולהראות תכונות האופייניות הזדקנות רבות הנהוגות עילאיים. השפעות ההזדקנות על חלבון insolubility נחקרו C . elegans מאת רציפים fractionation הביוכימי בהתבסס על מסיסות דיפרנציאלית, אשר נמצא בשימוש נפוץ להוציא אגרגטים המחלה בתחום של מחקרים הקשורים ניוון מוחיים11 . באמצעות ספקטרומטר מסה כמותית, הוצגו מספר חלבונים מאות להפוך צבירת נוטה C . elegans בהיעדר מחלת5. כאן נתאר בפירוט פרוטוקול לגדול מספרים גדולים של תולעים החילוץ רציפים כדי לבודד חלבונים צבורים על כימות באמצעות ספקטרומטר מסה וניתוח מאת תספיג ותרבות נוזלי. כי חלבונים misfolded של צבירת נוטה להצטבר יישון C. elegans גונדות ומסכות שינויים אחרים רקמות סומאטית5,12,13, נשתמש מוטציה בלוטת המין-פחות להתמקד בניתוח חלבון insolubility ברקמות שאינן-הרבייה. השיטה המובאת המאפשרת הניתוח של אגרגטים גדולים, מאוד לא מסיס מסיסים ב- 0.5% מרחביות, מגורען על ידי מהירות צנטריפוגלי נמוכה יחסית. לחלופין, היה נוהל חילוץ מחמירים פחות לאסוף גם אגרגטים מסיס יותר ויותר שפורסם במקומות אחרים10. בנוסף, אנו מתארים את שיטת להערכת צבירת ויוו C. elegans.
בסך הכל, שיטות אלה בשילוב עם התערבות ב RNA (RNAi) ניתן להעריך את התפקיד של גנים של עניין להתכוונן צבירת חלבונים תלויי-גיל. בשביל זה אנו מתארים את הניתוח של תמציות של תולעים, בגיל צעיר עם ובלי נוקאאוט של חלבון ספציפי עניין באמצעות RNAi. שיטות אלה צריך להיות כלי רב עוצמה כדי לקבוע אילו רכיבים של הרשת פרוטוסטאזיס לווסת את החלבון insolubility. מספר התערבויות מופחתת כמו פקטורי גדילה דמויי אינסולין/אינסולין (IGF) 1 איתות (IIS) הוכחו באופן דרמטי לעיכוב הזדקנות C. elegans 14. אריכות ימים מסלולים לעיתים קרובות לגרום מנגנוני בקרת איכות חלבון, ולכן המסלולים הללו יכול להיות פעיל השפעה על קצב צבירת חלבון. לדוגמה, נדגים צבירת מופחתת חלבון הטמון בבעלי חיים ארוכים על עיכוב של מסלול IIS7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עבור הבנה טובה יותר של ההליך, שרטוט של זרימת העבודה (איור 1) מחובר.
1. הצמיחה של מספרים גדולים של צעירים בגילאי C. elegans לאמירה RNAi מיקוד ג'ין עניין
הערה: השימוש C. elegans טמפרטורה-induced סטרילי gon-2(q388) מוטציות (CF2253) כדי לקבל אוכלוסיות גדולות בגילאי-מסונכרנות. במהלך כל השלבים, זה חשוב לעבוד בתנאים סטריליים למחצה עם להבה פתוחה וכדי לבדוק כי אין מציג (לדוגמה, עם פטריות או חיידקים) הם נוכחים. בצע את השלבים (גם centrifugations) בטמפרטורת החדר, אם הטמפרטורה לא מתואר.
- הכנה של מוטציות gon-2(-) C. elegans להשיג בלוטת המין-פחות חיות
הערה: כדי לקבל חיות סטרילי חסר גונדות, המוטציה אובדן-של-פונקציה חייב להיגרם את החיות האב על ידי הסטה אלה בשלב הזחל האחרון (L4) עד 25 ° C כדי להימנע התרומה אימהי.- הרחבה הראשונה של בעלי חיים gon-2(-) כדי לאסוף את דור ההורים למשמרת טמפרטורה
- פס Escherichia coli OP50 זן על צלחת מרק Lysogeny (LB), דגירה אותו בן לילה ב 37 º C.
- למחרת לחסן 200 מ ל LB בינוני עם אחד OP50 שיבוט, דגירה אותו בן לילה ב 37 º C.
- הבא יום זרע 15 צמיחה גבוהה (HG) בינוני הלוחות (קוטר 9 ס מ) עם 0.5 mL OP50 ולהפיץ OP50 עם מרית. שמור את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
- צ'אנק gon-2(-) בעלי חיים (לא ברעב עבור שני הדורות האחרונים) על גבי צלחות בינוניות 15 HG עם OP50 ולתחזק אותם ב- 20 ° C עד שהגלופות נמצאות confluent עם מבוגרים, כמה OP50 זמינה עדיין.
- בינתיים, זרע 60 HG לוחות בינוני עם OP50 כפי שמתואר צעד 1.1.1.3 ולשמור את הצלחות בטמפרטורת החדר. זהירות: צלחות הזריעה לא צריך להישמר במשך יותר משבוע כפי אגר יהיה לפצח בטמפרטורת החדר.
- מלבין את הצלחות confluent ברגע שרוב המבוגרים מתחילים להטיל ביצים כמו שתואר לעיל15. לאסוף את הביצים שני 15 מ"ל-צינורות ומניחים על מיקסר nutating בין לילה ב 20 º C.
- לשטוף את היום הבא בקעו L1s עם מאגר M9 (85 מ מ NaCl, 42 מ"מ נה2HPO4·7H2O,2PO 22 מ מ ח'4): צנטריפוגה ב 3,000 x g s 30, להשליך תגובת שיקוע של מילוי עד כדי לסמן 15 מ"ל עם M9. צנטריפוגה למחוק את תגובת שיקוע, חזור על השלב 1.1.1.6. למלא את הצינורות עם כדורי התולעת שנוצר עד כדי לסמן 15 מ"ל עם M9.
- להעריך את המספר הכולל של L1s עם מיקרוסקופ לנתיחה על ידי ספירת את L1s נוכח 2 טיפות µL דגש על פלטות אגר שאינם נזרע. ממוצע המספרים המתקבלים לפחות 9 טיפות.
- הוסף 6,500 L1s לכל הזריעה HG צלחת ולתת שהתולעים לגדול ב- 20 ° C עד שלב L4.
- הרחבה השנייה של חיות gon-2(-) להשיג בלוטת המין-פחות חיות לניסויים
- בשלב L4, משמרת את התולעים מהשלב 1.1.1.9 עד 25 ° C עד שהם מתחילים להטיל ביצים, L1s מתחילות לבקוע.
- אוסף של ביצים ו- L1s על-ידי שיקוע
הערה: אחרי המשמרת טמפרטורה עד 25 ° C, עדיף להשתמש שקיעת טכניקה עדינה כדי להפריד ביצים שברירית עם L1s המבוגרים.- לשטוף הצלחות עם M9 באמצעות 5 מ"ל M9 לכל חמש צלחות. להעביר את התולעים לתוך צינורות 50 מ.
- למלא את כל צינורות לסימן 45 מ עם M9, אתן המשקע מבוגרים כ 10 דקות, לאסוף את כל תגובת שיקוע בשפופרת 50 מ ל, חזור על שלב זה עם בגדר. Centrifuge את תגובת שיקוע המכילה ביצים של L1s ב x 3000 g עבור 1 דקות, אתן המשקע L1s כ 10 דקות, להסיר את תגובת שיקוע עד 15 מ"ל הם עזבו.
הערה: זהו צעד קריטי. אל תסיר את תגובת שיקוע מוקדם מדי, כדי לאסוף L1s רבים ככל האפשר. - מקום הצינורות המכילים ביצים, L1s על מיקסר nutating בין לילה ב 25 º C.
- הרחבה הראשונה של בעלי חיים gon-2(-) כדי לאסוף את דור ההורים למשמרת טמפרטורה
- תרבית נוזלית של בלוטת המין-פחות חיות כדי לאסוף חיות, בגיל צעיר נתון RNAi מיקוד הגן עניין
הערה: התגובה של כמה גנים RNAi ניתן טמפרטורה התלויים כפי שתואר לעיל16. כחלופה RNAi, הגן המוטנטי יכול לשלב את הרקע gon-2(-) .- הכנה של חיידקים תרבית נוזלית
- להכין חיידקים OP50 RNAi (חיידקים בהפקת dsRNA הרצוי, חיידקים עם הווקטור ריק כפקד) על-ידי מזריקים 4 L בינוני ליברות עם 12 מ של התרבות חיידקי בהתאמה (להוסיף ריכוז סופי של 50 carbenicillin µg/mL ו 1 מ"מ IPTG RNAi תרביות חיידקים) דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב 180 סל ד.
- למחרת לקצור את התרבויות ב 6,700 g x 10 דקות ב 4 º C. הסר את supernatants, resuspend כל גלולה בתקשורת 60 מ ל קרה כקרח S הבזליים (100 מ מ NaCl, 50 מ מ אשלגן פוספט pH 6, שמרה על הקרח). לשמור על שלושה כדורי resuspended (OP50, לשלוט RNAi חיידקים ובקטריות RNAi עבור הגן עניין) ב 4 ° C עד שלב 1.2.2 או 1.2.3.
הערה: תולעים ניתן לגדל על RNAi משלב L1 (ראה שלב 1.2.3) או להימנע ליקויים התפתחותיים של הזחל האחרון L4 (ראה שלב 1.2.2).
- תרבית נוזלית לטיפול עם RNAi מתחיל סוף סוף הפרפרים והעשים L4
- הוסף מדיה הבזליים 200 מ ל S בבקבוקון תרבות Fernbach (קיבולת 2,800 מ ל). עבור אמצעי אחסון תרבות הסופי של 300 מ ל (ראה 1.2.2.4), להוסיף 10 מ מ פוטסיום ציטראט, ה-pH 6, 3 מ ל פתרון של מתכות מעקב (5 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 2.5 מ מ מכל4, 1 מ MnCl2, ZnSO 1 מ4, 0.1 מ מ CuSO4), 3 מ מ MgSO4 , 3 מ מ CaCl2, 100 ננוגרם למ"ל carbendazim ו 5 כולסטרול µg/mL). לסגור את הבקבוק עם כובע בורג ממברנה. עיין טבלה 1 לקבלת מתכונים של מאגרים.
- . קח את L1s מתוך 25 ° C (שלב 1.1.2.2.3) ומעבירים אותם אל צינורות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב g x 1,900 למשך 3 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, ולספור את L1s לכל µL 2 כמו שלב 1.1.1.8. להוסיף 500,000 L1s לתוך הבקבוק תרבות Fernbach מוכן בשלב הקודם.
- להוסיף OP50 (מתוך שלב 1.2.1) באופן פרופורציונלי למספר של תולעים. לדוגמה, עבור תולעים 500,000 להוסיף 60 מ ל OP50.
- להשלים את התולעת תרבות עם S הבסיס כדי להביא את הנפח הכולל 300 מ. דגירה התרבות תולעת עד שלב L4-25 מעלות צלזיוס חממה חזק עם סל"ד 150.
- למחרת, התולעים צריך להיות בגודל של פראי-סוג L4s. כדי לשנות OP50 חיידקים RNAi, לאסוף חיות 6 50 מ"ל-צינורות, תן להם משקעים ולהסיר את תגובת שיקוע. לשטוף את L4s עם M9 כדי להסיר שאריות חיידקים OP50: צנטריפוגה ב g x 1900 למשך 3 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, להעביר L4s כל אחת 50 מ"ל-צינור. לספור את L4s לכל 5 µL (לפחות 9 פעמים). שתי פעמים 50,000 L4s דרושים עבור אוסף צעירים תולעת, פעמיים 100,000 L4s דרושים עבור אוסף בגילאי תולעת.
- הכינו ארבע מבחנות תרבות Fernbach כפי שמתואר 1.2.2.1. להוסיף גם ריכוז הסופי של µg/mL Carbenicillin 50 ו 1 מ"מ IPTG כל הבקבוק.
- הוספת פקד RNAi חיידקים ובקטריות RNAi עבור הגן עניין (מתוך שלב 1.2.1) באופן פרופורציונלי למספר של תולעים: להוסיף mL 7 של החיידק בהתאמה לכל הבקבוק לתולעים צעיר ו- 14 מ לכל הבקבוק לתולעים בגילאי.
- להוסיף תולעים 50,000 לכל הבקבוקון של אוסף צעירים תולעת ותולעים 100,000 לכל הבקבוקון של אוסף תולעת בגילאי והשלם את התרבויות עם S הבזליים למלא עד 300 מ. דגירה התרבויות תולעת (ארבעה בסך הכל) 25 ° C ו 150 סל ד.
- תרבית נוזלית לטיפול עם RNAi מתחיל בשלב L1
- הכינו ארבע מבחנות תרבות Fernbach כפי שמתואר 1.2.2.1 ולהוסיף ריכוז סופי של 50 carbenicillin µg/mL ו 1 מ"מ IPTG.
- המשך הכנת L1s כפי שמתואר 1.2.2.2. בסך הכל, תולעים 300,000 נחוצים כדי לחלק אותם ארבע המבחנות.
- הוספת פקד RNAi חיידקים ובקטריות RNAi עבור הגן של עניין (מתוך שלב 1.2.1) פרופורציונלי למספר של תולעים כפי שמתואר צעד 1.2.2.7, קח בחשבון גם את שלב הצמיחה בין השלב L1 ו- L4: להוסיף מ"ל 13 של החיידק בהתאמה לכל הבקבוק עבור w צעיר orms, 26 מ לכל הבקבוק לתולעים בגילאי.
- המשך כפי שמתואר בשלב 1.2.2.8.
- תחזוקה של C. elegans תרבויות נוזלי
- מעת לעת לאסוף aliquot של כל תרבות נוזלי, המקום על משטח זכוכית (לחלופין על צלחת אגר) כדי לוודא שאין שום מציג. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, לבדוק את רמות חיידקי מזון בתרבות במיוחד במהלך שלב הגדילה. להכין מראש 2 ל' תרבויות השליטה RNAi חיידקים ובקטריות RNAi עבור הגן של עניין כפי שמתואר בשלב 1.2.1. להוסיף את אלה לתרבויות נוזלי C. elegans במידת הצורך ולהשאיר את השאר ב 4 º C.
- בדוק מעת לעת כי בעלי החיים הם סטרילי. רוב בעלי החיים לא יהיו בלוטה. בהתאם penetrance של המוטציה גון-2 , חלקם שייתכן בוטלו מבנים האשכים אך אין חיות עם ביצים להתייחס.
- הכנה של חיידקים תרבית נוזלית
- אוסף של תולעים, בגיל צעיר נתון RNAi בתרבות נוזלי
הערה: כל השלבים הבאים מיועדים הבקבוק תרבית נוזלית אחת אבל שתי תרבויות, באותו הגיל ועם בקרת חיידקים RNAi עבור הגן עניין תעובד ביחד.- לאסוף תולעים צעירות יום 2 או יום 3 כדי למדוד רמות הבסיס של חלבון insolubility. תולעים בגילאי צריך להיות שנאספו (ב העדכנית) כאשר חצי מהאוכלוסייה מתו. כדי לקבוע זאת, תולעים מתים וחיים נספרים במספר טיפות של תרבית נוזלית מונחת צלחת אגר. יחסי הן בממוצע לפחות 9 טיפות.
- להכין את ריאגנטים הבאים: 1 L M9, 1 L M9 0.01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9), ו- 40 מ ל 60% סוכרוז ddH2O. לשמור את ריאגנטים על קרח.
- יוצקים את התולעים מכל אחד את הבקבוק לתוך משפך ההפרדה ותנו המשקע תולעים 10 דקות בטמפרטורת החדר. פתח את צימוד, לטפטף את התולעים לתוך שפופרת אחת 50 מ.
- לפצל בגדר תולעת שני 15 מ"ל-צינורות, צנטריפוגה-1,900 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התולעים, להסיר את תגובת שיקוע ולמלא עד 15 מ"ל M9. חזור על צנטריפוגה. לבסוף להעביר את התולעים שני צינורות 50 מ ל, למלא כדי הנפח הכולל 20 מ עם M9 קר כקרח.
- כדי להסיר חיידקים, תולעים מתים, להוסיף כדורי תולעת שני 20 מ"ל מדולל על שני 50 מ"ל-צינורות מלאים 20 mL קר כקרח 60% סוכרוז. במהירות צנטריפוגה-2,700 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, האצת 9 ו ההאטה 7. הסר בזהירות את השכבה העליונה תולעת עם pipet גדול (25 מ ל). לקחת עד 15 מ"ל (אך פחות אם יש מן הסתם הרבה תולעים מתים). . שים את זה ישירות לתוך 37 mL M9 + Octoxynol-9 (3 צינורות למחזור סוכרוז) שהוכנו על קרח. צנטריפוגה ב g 2,700 x למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, האצת 9 והאטה 7.
הערה: שניהם צריכים להיות הקר; אחרת ההפרדה לא יעבוד. לא לערבב! מאחר סוכרוז הוא רעיל התולעים חשוב שיהיה מהיר עבור השלב הבא. - לחלק בגדר ארבעה 15 מ"ל-צינורות ולשטוף פעמיים עם קרח M9 + Octoxynol-9: צנטריפוגה ב 1,900 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תגובת שיקוע, למלא לסימון 15 מ"ל עם M9 + Octoxynol קר כקרח-9 ו הליך החזרה.
- לשטוף פעם אחת עם קרח M9 ומשלבים הצינורות ארבע כדי ששתי שפופרות. להתמלא M9 בטמפרטורת החדר את הנפח הכולל של 4 מ ל 15 מ"ל-הצינורות ולסובב על מיקסר nutating ב 25 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
הערה: פעולה זו מסייעת התולעים לעכל כל חיידק שיורית בבטן. בדוק את התולעים תחת מיקרוסקופ כדי לראות שאין שום המתים. - לשטוף את התולעים פעמיים עם M9 + Octoxynol קר כקרח-9 כפי שמתואר 1.3.5. לשטוף פעמיים עם M9 ולהעביר את התולעים שפופרת אחת.
- לשטוף את התולעים פעם במאגר מלח גבוהה החילוץ של ההרכבה מחדש (ראב) ללא מעכבי (0.1 M 4-morpholineethanesulfonic חומצה (MES), חומצה ethyleneglycoltetraacetic 1 מ מ (EGTA), 0.1 מ מ EDTA, 0.5 מ מ MgSO4, 0.75 מ' NaCl, מ' 0.02 נקודות סודיום פלואוריד (NaF)) לפני אוסף. הסר את תגובת שיקוע עד שיש אין נוזלים על גבי בגדר תולעת.
הערה: שלב זה, והבא צריך להיעשות במהירות כדי להימנע חפצים ב התולעים הנגרמת על ידי ריכוז המלח גבוה במאגר. - להעריך את עוצמת הקול של תולעת צניפה ולהוסיף אמצעי אחסון זהה של ראב עם מעכבי (2 x קוקטייל מעכב פרוטאז). באמצעות פיפטה של פסטר, לצייר את התולעים, לטפטף לאט לאט לתוך צינור 50 מ ל שחצי מלאה עם חנקן נוזלי ממוקמים בתוך קרח יבש. תן את חנקן נוזלי מתאדים ולאחסן את התולעים קפוא ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
התראה: חנקן נוזלי היא בטמפרטורה נמוכה במיוחד; לענוד הגנה הולמת.
2. מיצוי חלבונים מסיסים עם בעלי חיים, בגיל צעיר, נתון RNAi מיקוד הגן עניין
-
שיבוש חיות שנאספו בשלב 1.3
הערה: חשוב להימנע מכל הפשרתו של הדגימות תולעת. לקרר המליטה עם חנקן נוזלי, בצע את ההליך מלאה בקרח יבש.
התראה: חנקן נוזלי היא בטמפרטורה נמוכה במיוחד; לענוד הגנה הולמת.- להעביר את התולעים קפוא המליטה טרום מקורר, לטחון 2.5 דקות.
הערה: להיזהר במהלך שהטחינה: בהתחלה, התולעים קפואים הם כדורים קטנים וזה קל לאבד אותם. - מוסיפים חנקן נוזלי (כ 100 מ ל) האבקה תקרר אותו שוב, לטחון עבור מינימלית 2.5 אחר הסימון עם המיקרוסקופ כי הגופים תולעת הם שבורים. להעביר את האבקה לתוך צינורות 2 מ"ל ואחסן אותם ב- 80 ° c
- להעביר את התולעים קפוא המליטה טרום מקורר, לטחון 2.5 דקות.
-
חילוץ מהיר חלבונים לא מסיסים לניתוח תספיג חלבון
הערה: השתמש בשיטה זו כדי להשוות את רמות חלבונים לא מסיסים ושביעות רצון חלבון הכולל בין הימים שונה עם ובלי RNAi מיקוד הגן עניין. לבצע את כל השלבים עד שלב 2.2.3 על הקרח!- Solubilize 50 מ ג של הקרקע תולעים מהשלב 2.1 עם 150 µL Radioimmunoprecipitation assay (ריפה) מאגר (50 מ מ טריס pH 8, 150 מ מ NaCl, 5 מ מ EDTA, 0.5% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), 0.5% נתרן deoxycholate (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF), 1 x קוקטייל מעכב פרוטאז). Homogenize את המתלים. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט אפור (27 G x ½", 0.4 מ"מ x 13 מ"מ); לצייר את ההשעיה 10 פעמים.
- צנטריפוגה ב 18,400 x g כעשרים דקות ב 4 º C. לאסוף את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר 100 µL ריפה מאגר, צנטריפוגה-g x 18,400 עבור 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, ספין זמן קצר, יש להקפיד להסיר את שארית supernatant.
- כדי solubilize את החלבונים מסיסים מאוד, resuspend בגדר µL 75 שתנן/מרחביות מאגר (שמונה מ' אוריאה, 2% מרחביות, 50 מ מ dithiothreitol (DTT), 50 מ מ. טריס, pH 8) ולאחר תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- כדי לנתח את תכולת החלבון הכולל, לשלב supernatant מהשלב 2.2.2 מלון ריפה הראשון את resuspension צנפה שתנן/מרחביות. להביא בחשבון אמצעי האחסון המשמש להפקת, השבר סה כ צריך להכיל שני שליש ריפה supernatant ושליש של שתנן/מרחביות צניפה שבר. על ג'ל צבע קטנים 4-12%, לבדוק את הרמות של חלבונים לא מסיסים על-ידי טעינת µL 9 של השבר שתנן/מרחביות, 4 µL חלבון משולב הכולל. לבצע צביעת חשופה חלבון הכולל לעקוב אחר רמות החלבון. על-ידי המערב סופג באמצעות נוגדנים ספציפיים, לוודא שינויים ב- insolubility חלבונים בודדים לכמת באמצעות ספקטרומטר מסה (ראה סעיף 3).
-
מיצוי חלבונים לא מסיסים כדי לבודד חלבונים מרחביות-לא מסיס עבור ספקטרומטר מסה
הערה: בצע את כל השלבים על קרח.- על קרח יבש שוקלים שניים פי 350 מ"ג הקרקע תולעים לכל נקודת זמן ולפי RNAi חיידקים (תולעים, בגיל צעיר, בקרה RNAi חיידקים ובקטריות RNAi עבור ג'ין עניין) לתוך צינורות 2 מ"ל.
- כדי להסיר את החלבונים מסיסים מלח גבוהה, להוסיף שני כרכים של ראב לפי משקל (700 µL) עם מעכבי, 1 מ PMSF, 200 DNase U/mL, 100 µg/mL RNase A לכל צינור, solubilize את האבקה על קרח. לצייר את ההשעיה לתוך מזרק 1 מ"ל (מחט אפור, 27 G x ½", 0.4 מ"מ x 13 מ"מ) 15 פעמים, דגירה זה על קרח במשך 10 דקות צנטריפוגה-g x 18,400 עבור 20 דקות ב 4 º C. לעבור את שכבת השומן ולאסוף את תגובת שיקוע המכיל חלבונים מסיסים מלח גבוהה לתוך שפופרת אחת 2 מ"ל לכל תנאי (ארבעה צינורות סה כ). להסיר את השומן וזורקים אותו. Aliquot חלבונים מסיסים מלח גבוהה להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס.
- כדי למחוק ליפידים, solubilize בגדר עם 700 µL ראב עם מעכבי המכיל סוכרוז 1 מ' (ללא DNase ואני RNase A). לצייר את ההשעיה לתוך מזרק 10 פעמים, דגירה זה על קרח במשך 5 דק צנטריפוגה-g x 18,400 עבור 20 דקות ב 4 º C. להיות זהירים כדי להסיר כל תגובת שיקוע ושומנים ולמחוק אותם.
- כדי להסיר חלבונים מסיסים מרחביות, solubilize בגדר עם 700 µL ריפה מאגר. לצייר את ההשעיה לתוך מזרק 10 פעמים, דגירה זה 10 דקות על קרח. צנטריפוגה ב 18,400 x g כעשרים דקות ב 4 º C. לאסוף את תגובת שיקוע המכילה חלבונים מסיסים מרחביות, aliquot עבור הקפאת ב-80 מעלות צלזיוס.
- בריכת שתי דוגמאות לכל תנאי ביחד אחרי solubilizing כל גלולה עם 500 µL ריפה מאגר. לצייר את ההשעיה לתוך מזרק 10 פעמים. צנטריפוגה ב 18,400 x g כעשרים דקות ב 4 º C. הקפד להסיר את כל תגובת שיקוע ולמחוק אותו.
הערה: המטרה של החילוץ הוא להפריד את החלבונים מסיסים חלבונים לא מסיסים. לכן, חשוב להסיר כל RIPA לשארי supernatant לפני הוספת חומצה פורמית בשלב הבא. - Solubilize בגדר הסופי המכיל חלבונים מסיסים מאוד עם חומצה פורמית 70% µL 400 וצייר את ההשעיה לתוך מזרק 20 פעמים. תקופת דגירה של 20 דקות על קרח. צנטריפוגה-g x 50,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C, האצה 3 והאטה 5, להסרת התולעת לציפורן פסולת. לאסוף את תגובת שיקוע המכילה חלבונים מסיסים מאוד ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס.
- דיאליזה חלבונים לא מסיסים שברים עבור ספקטרומטר מסה
הערה: Dialyze ב 4 º C.- להכין מאגר דיאליזה 8 L (50 מ"מ. טריס, 1 מ"מ DTT, 0.1 מ"מ PMSF, pH 7.5), לחלק אותם 8 בקבוקונים 1 ליטר. במקום שלושה ממברנות (ממברנה מסננים = 0.025 מיקרומטר) על פני מאגר עבור כל גביע 1 ליטר.
- לכל ממברנה, בזהירות לטעון µL 65 של חלבונים לא מסיסים solubilized, חומצה פורמית שהושג בשלב 2.3.6. כל תנאי מחולק על גבי ממברנות שש.
- בדוק את ה-pH של דוגמא אחת על-ידי הסרת 5 µL והוספת אותה על רצועת ה-pH. אם ה-pH הוא בין 7 ו- 8 (כ לאחר 2h), לאסוף את הדגימה על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות. בסופו של דבר, להשתמש 10 מאגר הדיאליזה µL לשטוף את התמיסה את כל ממברנה. הקפאת דגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
3. מקיף וכימות של שינויים חלבון Insolubility עם הגיל המושרה על ידי RNAi מיקוד הגן עניין
-
הכנה לניתוח ספקטרומטר מסה
- להעריך את כמות חלבונים לא מסיסים הדגימות dialyzed על-ידי טעינת של aliquot על גבי 4-12% מעבר צבע ג'ל יחד עם דגימת ריכוז ידוע. ביצוע של חלבון הכולל ג'ל מכתים, לכמת את כמות חלבון עם תוכנת ניתוח התמונה. שלב זה יש צורך להעריך את כמות טריפסין הדרושים לעיכול (שלב 3.1.4).
- לרכז את הדגימות באמצעות של המאייד צנטריפוגלי, solubilize את החלבונים לא מסיסים ב ריכוז סופי של שתנן שמונה מ'.
- אלקילציה וצמצום
- להוסיף Tris(2-carboxyethyl) הידרוכלוריד פוספין (TCEP) כדי ריכוז סופי של 4 מ מ כדי הדגימות. תקופת דגירה של h 1 ב 57 ° C עם סל"ד 300. לשים את הדגימות לטמפרטורת החדר.
- להוסיף iodoacetamide ריכוז סופי של 8.4 מ מ. תקופת דגירה זה של 45 min (יכול להיות מודגרות עבור 2 h) בחושך בטמפרטורת החדר.
- לדלל את הדגימות ב- 150 מ מ אמוניום ביקרבונט 2 מ' סופית אוריאה בריכוז.
- תקציר חלבונים עם 5% w/w ששינה טריפסין בן לילה-37 ° C ו- 400 סל ד.
- לטעון מדגם של החלבונים מתעכל על ג'ל מרחביות 12% ולבצע מכתים ג'ל הכוללת חלבון כדי לנתח אם העיכול עבד. אם יש עדיין כמה להקות הנוכחי, חזור על השלבים 3.1.4 ו 3.1.5.
- פפטידים של RNAi מטופלים C. elegans ובקרה, בגיל צעיר מסומנות עם תגים isobaric עבור כימות יחסיים ומוחלטים ההוראות של היצרן.
הערה: לחלופין, שיטות אחרות של תיוג של פפטידים או חלבונים יכול לשמש על כימות כגון תגיות המוני טנדם.
הערה: מסה ספקטרומטר ניתוח: כדי להפחית את המורכבות לדוגמה, פפטידים צריך להיות מופרדת באמצעות כרומטוגרפיה קטיון חזק לתוך שברים שונים עבור ניתוח ספקטרומטר מסה5. מספר ספקטרומטרים המונים מסוגלים וניתוח isobaric תגים עבור כימות יחסיים ומוחלטים כמתואר17. צריך ניתן לעבד את הנתונים שהושגו עם תוכנה מתאימה. באופן כללי ניתוח זה מאפשר זיהוי חלבונים מסיסים מאוד ושינויים שלהם על גיל ועל פרוטוסטאזיס אפנון.
4. in Vivo הערכת השפעתה של הגן עניין על התבנית צבירת במהלך ההזדקנות
- מניתוח ספקטרומטר מסה בסעיף 3, בחר חלבון של צבירת נוטה תלויי-גיל שמצטבר במידה שונה בבעלי החיים נתון RNAi. צור הטרנסגניים C. elegans קווים ביטוי חלבון זה מתויג עם החלבון הניאון ותחת שליטה שלו מקדם בהתאמה או מקדם רקמות ספציפיות (ראה דיון הבחירה של מקדם המתאים). לשמור על המתח ב 15 מעלות צלזיוס על ידי טכניקות רגיל על צלחות צמיחה תולעים נימיות (NG) עם OP50. לדוגמה, בחרנו זן תולעת לבטא polyadenylate מחייב חלבון (PAB-1) התמזגו ב קצה אמיני כדי tagRFP תחת השליטה של promotor השרירים בלוע pmyo-2-
-
In vivo הערכה של שינויים צבירה עם הגיל על עיכוב של הגן עניין
- 1-2 ימים מראש, הכינו NG/carbenicillin (פחמימות) / IPTG צלחות עם פקד (ריק RNAi וקטורית L4440) חיידקים ובקטריות RNAi כדי לעכב את הגן עניין. (עבור פרוטוקול מפורט אודות RNAi C . elegans ראה יופיטר מדעי החינוך מסד נתונים. יסודות של ביולוגיה 1: שמרים, דרוזופילה ו C. elegans. RNAi C. elegans. יופיטר, קיימברידג ', מסצ'וסטס, דוי: 10.3791/5105 (2017)).
- לטיפול RNAi מ L1, מקום להטלת ביצים תולעים על גבי מספר להפריד לוחיות קטנות NG/פחמימות/IPTG (קוטר 6 ס"מ) עם שליטה RNAi או חיידקים RNAi עבור הגן עניין ב 20 º C. להסיר את המבוגרים לאחר 2 h, שומר הוא צאצא ב 20 º C. כדי למנוע ליקויים התפתחותיים, ניתן להתחיל טיפולים RNAi לאחר הזחל L4.
- ברגע אופספרינג מגיע הזחל L4, להעביר את אלה L4s על גבי לוחות NG/פחמימות/IPTG חדש עם שליטה RNAi או חיידקים RNAi עבור הגן עניין. להגדיר 9 צלחות עם 15 transgenics כל עבור שני התנאים ולשמור אותם ב- 20 ° C. התולעים הזדקנות צריך להעביר מן הצאצאים שלהם את לוחיות הרישוי בכל יום השני עד תום תקופת הרבייה שלהם כדי להיות מסוגל להבחין בינם לבין צאצאיהם.
- להעריך שינויים בתחום ההפצה של החלבון נוטה צבירת בתווית עם תגית פלורסנט במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו-עם 24 x הגדלה בתקופת הבגרות, בכל יום אחר.
הערה: הצטברות תלויי-הגיל של החלבון נוטה מצבור של puncta בהיר משמש read-out לצורך צבירת. Puncta אלה צריך להיות משותק מאוד מבנים כאנטי אגרגטים. זה צריך להיקבע על-ידי קרינה פלואורסצנטית שחזור לאחר photobleaching (FRAP) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. החלבונים צבור, לא שחזור להתייחס באזור מולבן לאחר דקות לפחות 45,18. כדי לכמת את השינויים עם הגיל, שזכינו את דפוסי ההפצה, התולעים גיל-מסונכרנות overexpressing PAB-1-יום 2 יום 5, 7 ימי הבגרות כפי שמוצג להלן: צבירת רמות (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta של הנורה בלוע האחורי), נמוכות צבירת בינוני רמות (יותר מ-10 puncta של הנורה בלוע האחורי), ורמות צבירה גבוהה (יותר מ-10 puncta של הנורה לועי הקדמי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו השיטות המובאות להעריך איך מאריכים חיים עם IIS מופחתת לווסת את צבירת חלבונים תלויי-גיל. מאת המערבי כתם (ראה שלב 2.2, מהר מיצוי חלבונים לא מסיסים לניתוח תספיג), אנו ניתח את הסיכום והתוכן חלבונים לא מסיסים של יאנג (יום 3 של בגרות), בגילאי תולעים (יום 18 של בגרות) על שליטה RNAi ועל RNAi מיקוד האינסולין / לקולטן IGF-1-כמו הדף היומי-2. . הבחנו אין שינויים גדולים ברמות החלבון הכולל עם הגיל או בין שליטה הדף היומי-2 תנאים RNAi (איור 2א). כצפוי, הבחנו עלייה חזקה הקשורות לגיל רמות החלבונים לא מסיס מאוד בבעלי השליטה (איור 2B). לשם השוואה במאריכים חיים על הדף היומי-2 RNAi, צבירת הנטייה צומצם באופן משמעותי. כל חלבון מכתים של תמציות לא מסיסים חשף חלבון פחות מורכב הלהקה דפוס תמציות בת 18 יום תולעים על הדף היומי-2 RNAi לעומת שולט מתאימים-גיל. ניתוח כמותי ספקטרומטר מסה הפגינו מאריכים חיים עם IIS מופחתת יש הכולל צבירת חלבונים הקשורים בגיל פחות וזה חשוב, הדף היומי-2 עכבות לחלוטין יושב על insolubility תלויי-הגיל של משנה ספציפית של חלבונים7. מעקב על ממצאים אלה, התמקדנו על אחד החלבונים האלה צבירת מועדת, PAB-1. PAB-1 הוא מחייב RNA חלבון עם תחום "פריון כמו" החזוי. נוגדן מכתים אישר כי מאריכים חיים מתוחזק PAB-1 מסיס עם הגיל (איור 2C).
אין ויוו ניתוח של מצבור PAB-1, שהפקנו חיות הטרנסגניים לבטא tagRFP::PAB-1 בהשרירים בלוע. בבעלי חיים צעירים, tagRFP::PAB-1 היה בעיקר diffusely ממוקם לאורך הלוע (איור 3א', רמת צבירה "נמוך") אבל עם הגיל, הבחנו הצטברות מתקדמת ב puncta בהיר החל הנורה בלוע האחורי ( איור 3A, רמת צבירה "ביניים"). במהלך ההזדקנות, אנחנו גם נצפתה צבירה בהנורה לועי הקדמי (איור 3א', רמת צבירה 'גבוהה') מספר גדל והולך של בעלי חיים. על ידי קיבוץ חיות אלה בקטגוריות שונות, אנחנו הבקיע קצב צבירת PAB-1 באוכלוסיה. באותו יום 2 של בגרות רוב התולעים (88%) היו אף אחד או מעט מאוד puncta, אין חיות עם רמות גבוהות צבירת אותרו. כבר ביום 5, 19% של האוכלוסיה הראה ביניים ו 16% צבירה גבוהה ברמות בעוד יום 7 יותר מ 70% של התולעים הציג צבירת בחט רמות. כדי לנתח את ההשפעה של אריכות ימים על צבירה תלויי-הגיל של tagRFP:PAB-1, יצרנו tagRFP::PAB הטרנסגניים-1 תולעים עם מוטציה הדף היומי-2 . בעלי חיים אלה הראו tagRFP:PAB מופחת באופן משמעותי-1 היווצרות puncta עם ההזדקנות, עם פחות מ- 15% מהאוכלוסייה המציגות צבירת בחט רמות אפילו יום 7 (איור 3ב).
באמצעות הגישות השונות שתוארו כאן, אנחנו חשף כי מופחת IIS מונעת צבירת חלבונים תלויי-גיל כדי הרחבות שונות, מאריכים חיים יעילים במיוחד עבור שחזור את הדינמיקה של PAB-17.
איור 1 : סכימטי של זרימת העבודה כדי ללמוד לשינויים חלבון הגלום צבירה עם הגיל ב C. elegans. השלבים העיקריים מודגשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : חלבון insolubility עולה עם הגיל בבעלי שליטה, אבל לא אצל בעלי חיים עם איתות מופחתת הדף היומי-2 - (א) חלבון הכולל כתמים שבר מוחלט בין יום 3 מוטציות gon-2(-) 18 יום נתון שליטה הדף היומי-2 RNAi (גדל ב- 25 ° C). (B) חלבון הכולל כתמים מרחביות-לא מסיס שבר בין יום 3 מוטציות gon-2(-) 18 יום נתון שליטה הדף היומי-2 RNAi (גדל ב- 25 ° C). לוח פרסום מחדש הפניה7. Immunoblot (ג) גילוי PAB-1 בשבר מרחביות-לא מסיס, חלבון הרלוונטיים להקות שמציין החץ האדום. לוח פרסום מחדש הפניה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הדף היומי-2 מופחתת איתות מונע ההצטברות של tagRFP::PAB-1 puncta עם הגיל. (א) נציג תמונות של תולעים עם ביטוי tagRFP::PAB-1 בהשרירים בלוע (בהגדלה מיקרוסקופ, הגדרות לזיהוי tagRFP: עירור 558 ננומטר, פליטה 583 ננומטר). בעלי חיים נמוכה (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta של הנורה בלוע האחורי), ביניים (יותר מ-10 puncta של הנורה בלוע האחורי), או רמות צבירה גבוהה (יותר מ-10 puncta של הנורה לועי הקדמי) מוצגים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) כימות של צבירת tagRFP::PAB שונים-1 רמות עם גיל wildtype, הדף היומי-2 רקע מוטציה מגלה tagRFP::PAB חריפה מושהית-1 צבירה עם הגיל בבעלי חיים ארוכים. יום 2 יום 5, יום 7 daf-2(-) לעומת wildtype רקע, נמוך בהשוואה לצבירת בחט רמות: בדיקה מדוקדקת של פישר, * * *p < 0.0001. לוח פרסום מחדש הפניה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פתרון מניות | כמות | ריכוז סופי | הערות/תיאור |
| תרבית נוזלית, הנפח הכולל 300 מ ל | |||
| S הבזליים (עבור 500 מ"ל: 5.9 גרם NaCl, 50 מ ל 1 מ' אשלגן פוספט pH 6) | 200 מ | 1 מ' אשלגן פוספט pH 6: עבור 1 l: 129 גרם ח'2PO4 monobasic, 52 g K2HPO4 dibasic נטול מים | |
| 1 מ' אשלגן ציטרט pH 6 (400 מ ל: 13.1 g monohydrate חומצה ציטרית, 134.4 g tri-אשלגן ציטרט מונוהידראט) | 3 מ | 10 מ מ | |
| לאתר פתרון מתכות (עבור 1 l: 1.86 גרם חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA), g 0.69 מכל4 · 7 שעות2O, 0.2 גרם MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 שעות2O, 0.025 g CuSO4 · 5 שעות2O) | 3 מ | פתרון מלאי החנות בחושך ב 4 ° C | |
| 1 מ' MgSO4 (עבור 500 מ"ל: 123.3 g) | 900 ΜL | 3 מ מ | |
| CaCl 1 מ'2 (עבור 500 מ"ל: 73.5 g) | 900 ΜL | 3 מ מ | |
| Carbendazim µg/mL 200 (50 מ ל: 10 מ ג של מתנול) | 150 ΜL | 100 ננוגרם למ"ל | |
| כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל (עבור 100 מ ל: 0.5 גרם אתנול) | 300 ΜL | µg 5/mL | |
| מאגר מלח גבוהה החילוץ ההרכבה (רב), 30 מ | |||
| 1 מ' 4-Morpholineethanesulfonic חומצה (MES) | 3 מ | 100 מ מ | רכיב המניות מאגר ראב |
| 0.5 מ' Ethyleneglycoltetraacetic חומצה (EGTA) | 60 ΜL | 1 מ מ | רכיב המניות מאגר ראב |
| 0.5 מ' Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) | 6 ΜL | 0.1 מ מ | רכיב המניות מאגר ראב |
| 1 מ' MgSO4 | 15 ΜL | 0.5 מ מ | רכיב המניות מאגר ראב |
| NaCl 5 מ' | 4.5 מ | 750 מ"מ | רכיב המניות מאגר ראב |
| 1 מ' סודיום פלואוריד (NaF) | 600 ΜL | 20 מ מ | רכיב המניות מאגר ראב |
| להשלים עד סה עם ddH2O 30 מ"ל | |||
| 50 x קוקטייל מעכב פרוטאז | * | 2 x | * להוסיף ריאגנטים לאחר לוקח כמות מאגר מניות ראב זה נדרש (על החילוץ עבור ספקטרומטר מסה 6 מ ל). |
| 100 מ מ Phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) באלכוהול איזופרופיל,-20 ° C | * | 1 מ מ | |
| 10 U/µL DNaseI | * | 200 U/mL | |
| 4 מ"ג/מ"ל RNaseA | * | µg 100/mL | |
| ראב עם 1 מ' סוכרוז, 30 מ | |||
| 2 M סוכרוז (עבור 50 מ ל: 34.2 g) | 15 מ | 1 מ' | הוסף את ריאגנטים מאגר ראב מלבד DNaseI, RNaseA |
| Radioimmunoprecipitation assay (ריפה) מאגר, 30 מ | |||
| 1 מ' טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) pH 8 | 1.5 mL | 50 מ מ | רכיב המניות מאגר ריפה |
| NaCl 5 מ' | 0.9 mL | 150 מ מ | רכיב המניות מאגר ריפה |
| 0.5 EDTA מ' | 0.3 mL | 5 מ מ | רכיב המניות מאגר ריפה |
| 10% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) | 1.5 mL | 0.50% | רכיב המניות מאגר ריפה |
| 10% נתרן deoxycholate (SDO) | 1.5 mL | 0.50% | רכיב המניות מאגר ריפה |
| Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) | 0.3 mL | 1% | רכיב המניות מאגר ריפה |
| להשלים עד סה עם ddH2O 30 מ"ל | |||
| 100 מ מ PMSF | * | 1 מ מ | * להוסיף ריאגנטים לאחר לוקח כמות מאגר מניות ריפה זה נדרש (על החילוץ עבור ספקטרומטר מסה 10 מ ל). |
| 50 x קוקטייל מעכב פרוטאז | * | 1 x | |
| מאגר שתנן/מרחביות, 10 מ | |||
| שתנן | 4.8 גרם | 8 מ' | |
| 10% מרחביות | 2 מ | 2% | |
| Dithiothreitol (DTT) | 77 מ ג | 50 מ מ | |
| 1 מ' טריס pH 8 | 0.5 mL | 50 מ מ | |
| להשלים 10 מ ל הכולל עם ddH2O | |||
| מאגר דיאליזה, 1 ליטר | |||
| טריס | 6 g | 50 מ מ | |
| DTT | 154 מ ג | 1 מ מ | |
| 100 מ מ PMSF | 1 מ"ל | 0.1 מ מ | |
| להתאים את ה-pH 7.5 ושלמה על סך 1 ליטר עם ddH2O | |||
טבלה 1: מאגרי תרבית נוזלית, מיצוי חלבונים לא מסיסים של דיאליזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנחנו מדווחים על מתודולוגיה לבודד אגרגטים חלבון מאוד לא מסיס להזדקן C. elegans נתון RNAi לניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה סופג המערבי. אנו מראים כי שיפור פרוטוסטאזיס על-ידי הפחתת IIS במידה רבה מונעת צבירת חלבונים תלויי-גיל. על-ידי בחירת חלבונים צבירת-מועדים ספציפיים כדי overexpress C. elegans, זה אפשרי לנתח נוסף המנגנונים להתכוונן חלבון הגלום צבירה.
חלבונים תלויי-גיל הגלום צבירה לעומת צבירה חלבונים הקשורים למחלה
העבודה הנוכחית מתבססת על הממצאים הקודמים כי צבירת חלבון היא לא מוגבלת חלבונים ספציפיים צבירה בהקשר למחלה. על-ידי התמקדות אנדוגני חלבונים צבירת נוטה יותר מאשר ectopically ביטוי חלבונים הקשורים למחלה, הציפייה היא לספק הרומן תובנה פיזיולוגית רגולציה של תהליך צבירת. כמו אגרגטים חלבון תלויי-גיל מצויים במקומות שונים הסלולר5, המחקר שלהם אמור גם לספק תובנה תא מסוים מנגנוני בקרת איכות. בסך הכל, מנגנוני בקרה חלבון הגלום צבירת יכול גם להיות רלוונטי במניעת מחלת חלבון צבירה ראוי לציין, למרות צבירת חלבונים תלויי-גיל דומה בצבירת מספר היבטים המחלה חלבון, עדיין עדיין לא ברור אם אגרגטים אלה מכילים הסיבים עמילואיד, מאפיין של אגרגטים למחלות רבות.
הבחירה של C. Elegans דגם: יתרונות ומגבלות
בהשוואה למודל יונקים, אחד היתרונות הגדולים של שימוש C. elegans ללמוד מאפיין זיקנה היא תוחלת החיים קצרה מאוד שלה. מאות חלבונים שונים באופן עקבי להיות מאד-צבירת-מועדים במהלך ההזדקנות, עלייה זו גדולה insolubility בקלות לזיהוי אפילו עם מיצוי הביוכימי מפושטת. מגבלה משמעותית של השימוש C. elegans ללמוד צבירת חלבונים תלויי-גיל זאת, הצורך לבודד מספר גדול של בעלי חיים גיל. כמו C. elegans הן אנדרוגיניות ולייצר כ 220 או רומא עוד בתקופת הרבייה שלהם שלב19, זה חיוני כדי למנוע רבייה או לחסל את רומא כדי גיל אוכלוסיה. קיימות מספר אפשרויות לגרום עקרות: אפשרות אחת היא שימוש fluorodeoxyuridine כימיים (FUdR), מעכב של סינתזת ה-DNA. עם זאת, FUdR מוביל רבים תופעות לוואי לרבות שינויים פרוטוסטאזיס האופטימיזציות חלבון צבירת20,21,22. חשוב לציין, FUdR גורם ספציפי גנוטיפ תגובות23. אפשרות נוספת היא להשתמש הרגיש סטרילי מוטציות. לדוגמה, spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), ו gon-2(q388) שימשו בעבר ניתוחים ספקטרומטר מסה של תלויי-גיל בהעלאת פרוטאום5, 8.
אך ישנם מספר מגבלות שקשורים לשימוש המוטנטים האלה. ראשית, כמו העקרות היא תלוית טמפרטורה, יש צורך לגדל את החיות ב 25 ° C, אשר מהווה הלחץ מתון, מאיץ הזדקנות, כמו גם חלבון צבירת. לעומת זאת, הבחנו כי מוטציות גון-2, glp-1 ו fem-1 הם longer-lived לעומת פראי-סוג כאשר ומתוחזק על 25 ° C (נתונים לא מוצג). שנית, יש מגבלות מסוימות הקשורות לכל סוג של פגם הרבייה. חיסרון אחד של שימוש זרע תקינה מוטציות הוא הייצור של oocytes מופרית (מיוצר גם בגילאי אנדרוגינוסים פראי-סוג). האיכות של אלה oocytes מסרב באופן משמעותי עם הגיל ולצבור בלוטת המין24,25. ניתוח כמותי ספקטרומטר מסה מדגים כי מוטציות זרע תקינה יש מספר קיפול רמות גבוהות יותר של חלבונים לא מסיסים צבירת עם הגיל בהשוואה מוטציות פחות בלוטת המין או germline לקויה. מציין חלבון misfolding, צבירת ממוקם בלוטת המין5, מסכים עם הקודם מחקרים12,13 , ויוו ניסויים חושפניים חלבונים צבורים ממוקם oocyte חריגה אשכולות5. לכן, צבירת החלבון ב- בלוטת המין יסתיר שינויים עדינים יותר בצבירת חלבונים ברקמות סומאטית. זה גם נחשבות בהשוואת התערבויות לפעול הרחבות שונות על פרוטוסטאזיס ברקמות הרבייה וגופניות. לכן, כדי להעריך רק חלבון סומאטית צבירה, אנחנו מעדיפות באמצעות מוטציות בלוטת המין-פחות גון-2 . חלופה יהיה להשתמש מוטציות germline לקויה glp-1 . עם זאת, נציין אלה שלבעלי-חיים יש פחות הגלום צבירת חלבון עם הגיל בהשוואה גון-2 מוטציות5. . זה כנראה תוצאה של פרוטוסטאזיס משופרת ברקמות סומאטית עקב איתות ה27,26,תקינה germline בלוטת המין28... אלטרנטיבה אחרת היא להשתמש בבעלי חיים פראי-סוג, להסיר את רומא כל יום על-ידי שיקוע. עם זאת, זה בעייתי בגלל הקושי לחלוטין הסרת כל רומא.
עוד מגבלה כללי השימוש C. elegans הוא גודלו הקטן, מה שהופך את רקמות ספציפיות עקירות מאתגר. כמו עקירות כל בעלי חיים כאלה אינם מספקים מידע רלוונטי הקשור תנאים שונים איך לווסת את צבירת חלבונים ברקמות מסוימות. ראוי לציין, בעיה זו יכול באופן פוטנציאלי שיפרו באמצעות השיטה פיתחה לאחרונה בהתבסס על תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון כדי לבודד תאים ספציפיים של C. elegans29. עדיין נשאר שיקבע אם שיטה זו יהיה מתאים להשיג מספיק חומר לחילוץ חלבונים לא מסיסים, בין אם זה יהיה ישים בגילאי חיות. לחלופין, רקמת חלבון ספציפי צבירת ורגולציה שלה יכול ייחקרו על ידי ניסויים נוספים ויוו . כחיות הטרנסגניים לבטא שכותרתו fluorescently חלבון צבירת נוטה להתמקד יכול במהירות להיווצר, כמו החיות הם שקופים, זה יחסית קל לבחון חלבון צבירת בחיי עיר.
בסך הכל, זה חיוני לעקוב אחר התוצאות פרוטיאומיה מבנית עם ויוו ניסויים ברקע פראי-סוג. השילוב של אפיון הביוכימי, מבוסס מיקרוסקופיה מאפשר מחקר מקיף של חלבון מצבור הערכה על תפקידם של הגנים של עניין. האחרון בהנחייתם של C . elegans RNAi בתיווך מצרי באמצעות האכלה ואת הזמינות של כל הגנום RNAi ספריות. בנוסף, קיימים מספר רב של מוטציות מאופיין לאישור התוצאות המתקבלות על-ידי RNAi או להשתמש במקום RNAi.
תרבית נוזלית והפקת הביוכימי: יתרונות ומגבלות
כמו חלבונים המצטברים מאוד מהווים רק חלק קטן של חלבונים הכולל, יש צורך להתחיל את החילוץ עם מספר גדול של בעלי חיים. עם כמויות גדולות של חלבונים לא מסיסים, זה ואז ריאלי לביצוע פפטיד נרחב fractionation כדי להפחית את המורכבות מדגם ספקטרומטר מסה וכך לשפר את זיהוי של חלבונים בשפע נמוך יותר. אם רק כמויות קטנות של חלבונים לא מסיסים נדרשים, דרך חלופית היא לגדל תולעים על צלחות homogenize אותם עם חרוזים קרמיים. אחד החסרונות של תרבות נוזלי היא כי במקרה של זיהום, כל התרבות מושפע חייב להיות מושלך. באופן כללי, C. elegans הזדקנות מושפעת מאד טמפרטורה, פרמטר זה חייבים להיות מבוקרים היטב בתרבות נוזלי כדי להימנע בווריאציות צבירת חלבונים תלויי-גיל. בקרת טמפרטורה חיוני גם להשיג אוכלוסיה הומוגנית של בלוטת המין-פחות בעלי חיים בעת שימוש המוטציות gon-2(-) .
בהתאם המטרה של המחקר, חשוב לשקול בשיטות חילוץ שונות. החילוץ הביוכימי המובאת כאן הותאמה בתחילה מן הפרוטוקולים לבודד אגרגטים הקשורים למחלה11,30,31. בחרנו ריכוזים גבוהים יחסית של דטרגנטים כגון 0.5% מרחביות לבודד מצרפי יותר לא מסיסים. גם על-ידי pelleting 0.5% מרחביות מצרפי לא מסיסים במהירויות נמוכות צנטריפוגלי, פרוטוקול זה רק לבודד מצרפי גדול יותר. לחלופין, פרוטוקול מחמירים פחות היה שפורסמו לאחרונה10. במחקר זה, אגרגטים קטנים של מסיס יותר חולצו גם על-ידי השמטת מרחביות ועל -ידי שימוש במהירויות מאוד גבוהות צנטריפוגלי ב g 500,000 x. השוואה של הפרוטוקולים השונים מראה עלייה כללית במספר של חלבונים ב- פרוטאום צבירה באמצעות פרוטוקול7מחמירים פחות. נציין כי מאריכים חיים עם מופחת הדף היומי-2 מערכת אזעקה יעילה למנוע ההצטברות של מרחביות מסיסים והן אגרגטים מרחביות-לא מסיס ב בלוטת המין-פחות חיות7.
אין ויוו ניתוח של צבירת חלבונים תלויי-גיל
כאשר בונים מודלים מהונדס לצורך צבירת חלבונים תלויי-הגיל הבאות, זה רלוונטי לשקול איזו רקמה כדי overexpress החלבון נוטה צבירת עניין ועל איזה רמות הביטוי. אנחנו מעדיפות ביטוי ברקמות הממוקמים באזור הראש כדי למנוע הפרעה autofluorescence, אשר בולט במעי הזדקנות. כדי להמחיש את התווית על-ידי פלורסנט אגרגטים עם ההגדלה נמוך, החלבון צבירת נוטה צריך להתבטא ברמה גבוהה יחסית. מצד שני, ביטוי גבוה מדי יגרום החלבון צבירת נוטה אל טופס אגרגטים כבר בבעלי חיים צעירים.
יחדיו, שיטות אלה יעזור לנו להבין למה חלק פרוטאום אגרגטים עם הגיל ולהוביל בסופו של דבר להתפתחות של אסטרטגיות קידום הזדקנות בריאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון את DZNE וגרנט מארי קירי הבינלאומי אפשרות (322120 כדי D.C.D.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
