Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Metoder för att studera förändringar i inneboende Protein aggregering med åldern i Caenorhabditis elegans

Published: November 26, 2017 doi: 10.3791/56464

Summary

Målet med den metoden som presenteras här är att utforska protein aggregation under normalt åldrande i modell organismen C. elegans. Protokollet utgör ett kraftfullt verktyg att studera de mycket olösligt stora aggregat som bildar med åldern och att avgöra hur förändringar i proteostasis påverkar protein aggregering.

Abstract

I de sista årtiondena, har förekomsten av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD) och Parkinsons sjukdom (PD), vuxit. Dessa ålder-associerade sjukdomar kännetecknas av uppkomsten av protein aggregat med fibrillary struktur i hjärnan hos dessa patienter. Exakt varför normalt lösliga proteiner genomgå en aggregering process är fortfarande dåligt förstådd. Upptäckten att protein aggregering är inte begränsat till sjukdomsprocesser och istället en del av den normala åldrandeprocessen möjliggör studier av molekylära och cellulära mekanismer som reglerar protein aggregering, utan att använda ectopically uttryckt mänskliga sjukdomsassocierade proteiner. Här beskriver vi metoder för att undersöka inneboende protein aggregation i Caenorhabditis elegans genom kompletterande strategier. Först undersöker vi hur man odlar stora mängder ålder-synkroniserad C. elegans att få äldre djur och vi presenterar de biokemiska förfarandena för att isolera mycket-olöslig-stora aggregat. I kombination med en riktad genetisk knockdown, är det möjligt att dissekera rollen av en gen av intresse att främja eller hindra åldersberoende protein aggregation genom att använda antingen en omfattande analys med kvantitativa masspektrometri eller en kandidat-baserad analys med antikroppar. Dessa resultat bekräftas sedan av i vivo analys med transgena djur uttrycker lysrör-taggade aggregation-benägen proteiner. Dessa metoder bör bidra till att klargöra varför vissa proteiner är benägna att aggregat med ålder och i slutändan hur man håller dessa proteiner fullt fungerande.

Introduction

Protein Skellefteåsjukan och aggregering redovisas som ett kännetecken för flera neurodegenerativa sjukdomar som AD, PD, amyotrofisk lateralskleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och många andra. Till exempel, α-synuclein församlingar i amyloida fibriller som ackumuleras som Lewy förkroppsligar bestämt i den substantia nigraen av PD patienter, medan i ALS patienter TDP-43 eller FUS misfold form cytoplasmiska aggregat i degenererande motoriska nervceller. I varje av dessa neurodegenerativa sjukdomar misslyckas mekanismer för att upprätthålla protein homeostas eller proteostasis att förhindra ansamling av felveckning proteiner, följaktligen leder till sjukdom.

Proteostasis är avgörande för att säkerställa cellfunktioner och under normala förhållanden dessa reglerande mekanismer kontrollera tätt proteinsyntes, vikning och nedbrytning. Flera studier visar att med åldrande, många celler och organ förmåga att bevara protein homeostas äventyras gradvis och fysiologiska försämringen av de proteostasis nätverk med ålder är en viktig försvårande faktor för neurodegenerativa sjukdomar (ses i referenser1,2,3). Det faktum att protein kvalitetskontroll och cellulära svar på ovikta protein stress äventyras med ålder antyder att protein Skellefteåsjukan och aggregation kan vara en allmän följd av åldrande. Ja, vi och andra har visat att protein aggregering är inte begränsad till sjukdom och i stället en del av proteomet blir mycket tvättmedel-olöslig i äldre djur4,5,6,7 ,8,9,10. Beräkningsbiologi och i vivo analys visade att dessa fysiologiska åldersrelaterade aggregat liknar sjukdomen aggregat i flera aspekter5. Upptäckten av endogena, åldersberoende protein aggregering ger oss möjlighet att dissekera de molekylära och cellulära mekanismer som reglerar protein aggregering, utan att använda ectopically uttryckta mänskliga sjukdomsassocierade proteiner. För närvarande finns endast begränsad information om regleringen av utbredd protein olöslighet och om effekterna av detta dysreglering på hälsan hos organismen.

Den nematoder C. elegans är en av de mest omfattande studerade modellorganismerna i åldrande forskning som dessa djur har en relativt kort livslängd och visa många karaktäristiska åldrande funktioner hos högre organismer. Effekterna av åldrande på protein olöslighet har studerats i C. elegans av sekventiell biokemiska fraktionering baserat på differentiell löslighet, som ofta används för att extrahera sjukdom aggregat i neurodegeneration forskningsområdet11 . Av kvantitativa masspektrometri visades flera hundra proteiner att bli aggregation-benägen i C. elegans i avsaknad av sjukdom5. Här beskriver vi i detalj i protokollet för att växa stort antal maskar i flytande kultur och sekventiella extraktionen att isolera aggregerade proteiner för kvantifiering av masspektrometri och analys genom Western blot. Eftersom felveckning och aggregation-benägen proteiner ansamlas i åldern C. elegans gonader och masker förändringar i andra somatiska vävnader5,12,13, vi använder en gonad-mindre mutant för att fokusera analysen på protein olöslighet i icke-reproduktiva vävnader. Metoden presenteras möjliggör analys av mycket olösliga i stora aggregat som är olöslig i 0,5% SDS och pelleterat av relativt låg centrifugal hastighet. Alternativt, ett mindre stränga extraktion protokoll att samla också mindre och mer lösliga aggregat har varit publicerad någon annanstans10. Dessutom beskriver vi den metod som används för att bedöma aggregation i vivo i C. elegans.

Sammantaget kan dessa metoder i kombination med RNA-interferens (RNAi) utvärdera rollen av en gen av intresse för modulerande åldersberoende protein aggregering. För detta beskriver vi analysen av extrakt från unga och äldre maskar med och utan Nedslagning av ett specifikt protein av intresse med hjälp av RNAi. Dessa metoder bör vara ett kraftfullt verktyg för att avgöra vilka komponenter av proteostasis nätverket reglerar protein olöslighet. Flera interventioner såsom minskad insulin/insulin-liknande tillväxtfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har visat sig dramatiskt fördröja C. elegans åldrande14. Livslängd vägar inducera ofta protein-kvalitet kontrollmekanismer och således dessa vägar kan aktivt påverka andelen protein aggregering. Som ett exempel visar vi minskad inneboende protein aggregation i långlivade djur vid hämning av IIS väg7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: För en bättre förståelse av förfarandet bifogas en schematisk av arbetsflödet (figur 1).

1. tillväxt av stort nummer av unga och äldre C. elegans utsätts för RNAi inriktning en gen av intresse

Obs: Använd C. elegans temperatur-inducerad sterila gon-2(q388) mutanter (CF2253) att få stora åldern-synkroniserad populationer. Under alla steg är det viktigt att arbeta under delvis sterila förhållanden med öppen låga och att kontrollera att inga föroreningar (till exempel med svampar eller bakterier) är närvarande. Utför steg (också centrifugations) vid rumstemperatur om temperaturen inte beskrivs.

  1. Beredning av C. elegans gon-2(-) mutanter att erhålla gonad-mindre djur
    Obs: För att erhålla sterila djur saknar gonader, förlust-of-function mutation måste induceras i föräldragenerationen av skiftande dessa på den sista larvstadium (L4) till 25 ° C för att undvika maternell bidrag.
    1. Första expansionen av gon-2(-) djur att samla föräldragenerationen för temperatur Skift
      1. Strimma Escherichia coli OP50 stam på Lysogeny buljong (LB) plåt och inkubera det över natten vid 37 ° C.
      2. Nästa dag Inokulera 200 mL LB medium med en OP50 klon och inkubera det över natten vid 37 ° C.
      3. Nästa dag frö 15 hög tillväxt (HG) medellång plåtar (diameter 9 cm) med 0,5 mL OP50 och distribuera OP50 med en spatel. Hålla plattorna i rumstemperatur i två dagar.
      4. Chunk gon-2(-) djur (inte svultit för de senaste två generationerna) på 15 HG medellång plattor som ympats med OP50 och bibehålla dem vid 20 ° C tills plattorna är konfluenta med vuxna och vissa OP50 är fortfarande tillgänglig.
      5. Under tiden frö 60 HG medellång plattor med OP50 enligt beskrivningen i steg 1.1.1.3 och hålla plattorna vid rumstemperatur. Försiktig: Seedade plattor bör inte hållas för mer än en vecka som ägarn kommer att spricka vid rumstemperatur.
      6. Bleach konfluenta plattorna när de flesta vuxna börjar lägga ägg som tidigare beskrivits15. Samla ägg i två 15 mL-rör och placera på en nutating mixer över natten vid 20 ° C.
      7. Nästa dag tvätten kläckts L1s med M9 buffert (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): Centrifugera vid 3 000 x g under 30 s, Kassera supernatanten och fyll upp till 15 mL märket M9. Centrifugera, avlägsna supernatanten och upprepa steg 1.1.1.6. Fyll rören med resulterande mask pellets upp till 15 mL märket M9.
      8. Utvärdera den totala antalet L1s med dissektion Mikroskop genom att räkna L1s närvarande i 2 µL droppar placeras på icke-seedade agarplattor. Genomsnittliga siffrorna erhålls från minst nio droppar.
      9. Lägg till 6,500 L1s per seedade HG plattan och låta maskarna växer vid 20 ° C tills L4 scenen.
    2. Andra expansionen av gon-2(-) djur att få gonad-mindre djur för experiment
      1. I L4 skede, skifta maskar från steg 1.1.1.9 till 25 ° C tills de börjar lägga ägg och L1s kläckning.
      2. Insamling av ägg och L1s genom sedimentering
        Obs: Efter temperatur övergången till 25 ° C är det att föredra att använda sedimentering som en skonsam teknik för att separera bräckliga ägg och L1s från vuxna.
        1. Tvätta plattorna med M9 med hjälp av 5 mL M9 per fem plattor. Över maskar till 50 mL rör.
        2. Fyll upp alla rör till 45 mL märket med M9, låt vuxna sedimenten i ca 10 min, samla varje supernatanten i en 50 mL tub och upprepa detta steg med pelleten. Centrifugera supernatanten som innehåller ägg och L1s vid 3 000 x g i 1 min, låt L1s sedimenten under ca 10 minuter och avlägsna supernatanten tills 15 mL är kvar.
          Obs: Detta är ett kritiskt steg. Ta inte bort supernatanten för tidigt, för att samla så många L1s som möjligt.
        3. Placera rören som innehåller ägg och L1s på en nutating mixer övernattning på 25 ° C.
  2. Flytande kultur gonad-mindre djur att samla unga och äldre djur utsätts för RNAi inriktning en gen av intresse
    Obs: Vissa gener svar på RNAi kan vara temperaturberoende som som tidigare beskrivits16. Som ett alternativ till RNAi, kunde en mutant gen införlivas i gon-2(-) bakgrund.
    1. Beredning av bakterier för flytande kultur
      1. Förbereda OP50 och RNAi bakterier (bakterier producera önskad dsRNA och bakterier med tomma vektorn som kontroll) genom att vaccinera 4 L LB medium med 12 mL respektive bakteriella kulturen (lägga till en slutlig koncentration på 50 µg/mL carbenicillin och 1 mM IPTG RNAi bakteriekulturer) och inkubera dem vid 37 ° C över natten vid 180 rpm.
      2. Nästa dag skörda kulturerna vid 6.700 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanterna och återsuspendera varje pellet i 60 mL iskallt S basala media (100 mM NaCl, 50 mM kalium fosfatbuffert pH 6, förvaras på is). Hålla de tre återsuspenderade pelletarna (OP50, styra RNAi bakterier och RNAi bakterier för gen av intresse) vid 4 ° C tills steg 1.2.2 eller 1.2.3.
        Obs: Maskar kan odlas på RNAi från L1 skede (se steg 1.2.3) eller att undvika defekter från den senaste larvstadium L4 (se steg 1.2.2).
    2. Flytande kultur för behandling med RNAi börjar äntligen larvstadium L4
      1. Lägga till 200 mL S basala media i en Fernbach kultur kolv (kapacitet 2 800 mL). För en slutlig kultur volym 300 ml (se 1.2.2.4), lägga till 10 mM Kaliumcitrat, pH 6, 3 mL Trace metaller lösning (5 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), 2,5 mM FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL karbendazim och 5 µg/mL kolesterol). Tillslut kolven med en membran skruvlock. Se tabell 1 för recept av buffertar.
      2. Ta L1s av 25 ° C (steg 1.1.2.2.3) och överföra dem till 15 mL rör. Centrifugera vid 1 900 x g i 3 min, avlägsna supernatanten och räkna L1s per 2 µL som i steg 1.1.1.8. Lägg till 500.000 L1s i Fernbach kultur kolven beredd i föregående steg.
      3. Lägga till OP50 (från steg 1.2.1) proportionellt till antalet maskar. Exempelvis för 500.000 maskar Tillsätt 60 mL OP50.
      4. Komplett mask kultur med S basala att föra den totala volymen till 300 mL. Inkubera mask kulturen tills L4 scenen vid 25 ° C i en skakande inkubator med 150 rpm.
      5. Nästa dag, bör maskar storleken av vildtyp L4s. Om du vill ändra från OP50 RNAi bakterier, samla in djur i sex 50 mL-rör, låt dem sediment och avlägsna supernatanten. Tvätta L4s med M9 att ta bort kvarvarande OP50 bakterier: Centrifugera 1900 x g under 3 minuter, avlägsna supernatanten och överföra alla L4s till en 50 mL-tub. Räkna L4s per 5 µL (minst nio gånger). Två gånger 50.000 L4s behövs för unga mask insamling och två gånger 100.000 L4s behövs för samlingen år mask.
      6. Förbereda fyra Fernbach kultur kolvar som beskrivs i 1.2.2.1. Också lägga till en slutlig koncentration på 50 µg/mL Carbenicillin och 1 mM IPTG till varje kolv.
      7. Lägga till kontroll RNAi bakterier och RNAi bakterier för gen av intresse (från steg 1.2.1) proportionellt till antalet maskar: Tillsätt 7 mL respektive bakterier per kolv för unga maskar och 14 mL per kolv för åldern maskar.
      8. Lägga till 50.000 maskar per kolv för unga mask uppsamling och 100.000 maskar per kolv för samlingen år mask, och slutföra kulturerna med S basala att fylla upp till 300 mL. Inkubera mask kulturerna (fyra totalt) vid 25 ° C och 150 rpm.
    3. Flytande kultur för behandling med RNAi börjar L1 skede
      1. Förbereda fyra Fernbach kultur kolvar som beskrivs i 1.2.2.1 och lägga till en slutlig koncentration på 50 µg/mL carbenicillin och 1 mM IPTG.
      2. Fortsätta med utarbetandet av L1s som beskrivs i 1.2.2.2. Totalt behövs 300.000 maskar för att dela in dem i fyra kolvar.
      3. Lägga till kontroll RNAi bakterier och RNAi bakterier för gen av intresse (från steg 1.2.1) proportionell mot antalet maskar som beskrivs i steg 1.2.2.7 och betrakta också tillväxtfasen mellan L1 och L4 scenen: Tillsätt 13 mL respektive bakterier per kolv för unga w Orms och 26 mL per kolv för åldern maskar.
      4. Fortsätt enligt beskrivningen i steg 1.2.2.8.
    4. Underhåll av C. elegans flytande kulturer
      1. Med jämna mellanrum samla en alikvot från varje flytande kultur och placera på en glasskiva (alternativt på en agarplatta) att kontrollera att det inte finns några föroreningar. Med dissektion Mikroskop kontrollera bakteriell mat nivåerna i kulturen särskilt under tillväxtfasen. Förbereda i förväg 2 L kulturer kontroll RNAi bakterier och RNAi bakterier för gen av intresse som beskrivs i steg 1.2.1. Lägg till dessa till C. elegans flytande kulturer vid behov och behålla resten vid 4 ° C.
      2. Regelbundet kontrollera att djuren är steril. Majoriteten av djuren har inte en gonad. Beroende på penetrans av gon-2 mutation, vissa kan ha avbrutits gonadala strukturer men inga djur med ägg bör observeras.
  3. Samling av unga och äldre maskar utsätts RNAi i flytande kultur
    Obs: Alla följande steg gäller för en flytande kultur kolven men båda kulturerna i samma ålder med kontroll och RNAi bakterier för gen av intresse bör behandlas tillsammans.
    1. Samla unga maskar på dag 2 eller 3 att mäta basala nivåer av proteinet olöslighet. År maskar bör samlas (senast) när hälften av befolkningen har dött. För att avgöra detta, räknas döda och levande maskar i flera droppar av flytande kultur placeras på en agarplatta. Nyckeltal är i genomsnitt under minst nio droppar.
    2. Förbered följande reagenser: 1 L M9, 1 L M9 med 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) och 40 mL 60% sackaros i ddH2O. hålla reagenserna på is.
    3. Häll maskar från en kolv i en separation tratt och låt maskar sedimenten under 10 minuter vid rumstemperatur. Öppna Avstängningskranen och droppa maskar i en 50 mL tub.
    4. Dela mask pelleten i två 15 mL-rör och centrifugera 1.900 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Att tvätta maskar, avlägsna supernatanten och fyll upp till 15 mL med M9. Upprepa centrifugeringen. Slutligen överföra maskar till två 50 mL rör och fylla upp till 20 mL total volym med iskall M9.
    5. Att ta bort bakterier och döda maskar, lägga till två 20 mL utspädd mask pellets till två 50 mL-rör fyllda med 20 mL iskallt 60% sackaros. Snabbt Centrifugera 2700 x g under 5 minuter i rumstemperatur, 9-acceleration och retardation 7. Ta försiktigt bort det översta mask lagret med en stor Pipettera (25 mL). Ta upp till 15 mL (men mindre om det finns uppenbarligen en massa döda maskar). Sätta in detta direkt i 37 mL M9 + Octoxynol-9 (3 tuber per sackaros tube) beredd på is. Centrifugera vid 2700 x g i 3 min i rumstemperatur, acceleration 9 och retardation 7.
      Obs: Båda behöver vara iskall; annars fungerar inte separation. Blanda inte! Eftersom sackaros är giftigt för maskar är det viktigt att vara snabb för följande steg.
    6. Dela upp pelleten i fyra 15 mL-rör och tvätta två gånger med iskall M9 + Octoxynol-9: Centrifugera vid 1 900 x g för 1 min i rumstemperatur. Ta bort supernatanten, fyll upp till 15 mL-märket med iskall M9 + Octoxynol-9 och upprepa proceduren.
    7. Tvätta en gång med iskall M9 och kombinera de fyra rören till två rör. Fyll upp med M9 vid rumstemperatur till en total volym på 4 mL i 15 mL-rören och rotera på en nutating mixer vid 25 ° C i 40 min.
      Obs: Detta hjälper maskarna att smälta eventuella kvarvarande bakterier i tarmen. Kontrollera maskar under mikroskopet för att se att det finns inga döda.
    8. Tvätta maskar två gånger med iskall M9 + Octoxynol-9 som beskrivs i 1.3.5. Tvätta två gånger med M9 och överföra maskar till en tub.
    9. Tvätta maskar en gång i återmontering (RAB) hög-salt utvinning bufferten utan hämmare (0,1 M 4-morpholineethanesulfonic syra (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic syra (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl, 0,02 M natriumfluorid (NaF)) innan samling. Ta bort supernatanten tills det finns ingen vätska ovanpå mask pelleten.
      Obs: Detta steg och nästa bör ske snabbt för att undvika artefakter i de maskar som orsakas av den höga saltkoncentrationen i bufferten.
    10. Beräkna volymen av masken pellet och tillsätt en identisk volym av RAB-hämmare (2 x proteas hämmare Cocktail). Rita upp maskar med en Pasteur-pipett och sakta droppa i en 50 mL tub halvan fylld med flytande kväve placeras i torr-is. Låt den flytande kvävgasen avdunsta och lagra de frusna maskarna vid-80 ° C tills vidare bearbetning.
      Varning: Flytande kväve är en extremt låg temperatur; bär lämpligt skydd.

2. olösligt Protein utvinning med unga och äldre djur utsätts för RNAi inriktning en gen av intresse

  1. Störningar av djur som samlats in i steg 1.3
    Obs: Det är viktigt att undvika eventuella upptining av masken proverna. Kyla ner morteln med flytande kväve och utför komplett procedur på torris.
    Varning: Flytande kväve är en extremt låg temperatur; bär lämpligt skydd.
    1. Överföra de frusna maskarna till nedkylda mortel och slipa för 2,5 min.
      Var försiktig under slipningen: i början, de frusna maskarna är i små kulor och det är lätt att förlora dem.
    2. Lägga till flytande kväve (ungefär 100 mL) pulvret att kyla ner igen och slipa för en annan 2,5 min. Kontrollera med mikroskopet att masken kroppar är trasiga. Överföra pulvret i 2 mL rör och lagra dem vid-80 ° C.
  2. Snabb olösligt protein utvinning för Western blot analys
    Obs: Använd den här metoden för att jämföra de totala protein innehåll och olösliga proteinnivåerna mellan de olika dagarna med och utan RNAi inriktning genen av intresse. Utföra alla steg fram till steg 2.2.3 på is!
    1. Solubilize 50 mg av marken maskar från steg 2.1 med 150 µL Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysbuffert (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0,5% natriumdeoxikolat (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF), 1 x proteas hämmare Cocktail). Homogenisera fjädringen med en 1 mL spruta med grå nål (27 G x ½ ”, 0,4 mm x 13 mm); Dra upp suspensionen 10 gånger.
    2. Centrifugera vid 18,400 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Samla in supernatanten.
    3. Återsuspendera pelleten i 100 µL RIPA bufferten och centrifugera vid 18,400 x g i 20 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten, snurra inom kort, och var noga med att ta bort överblivna supernatant.
    4. För att solubilize mycket olösligt proteinerna, återsuspendera pelleten i 75 µL Urea/SDS buffert (8 M urea, 2% SDS, 50 mM Ditiotreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
    5. För att analysera den totala proteinhalten, kombinera den första RIPA supernatant från steg 2.2.2 och urinämne/SDS pellet resuspension. För att beakta de volymer som används för utvinning, bör den totala fraktionen innehåller två tredjedelar av RIPA supernatanten och en tredjedel av Urea/SDS pellet bråkdel. På en liten 4-12% toning gel, kontrollera nivåerna av olösligt protein genom att ladda 9 µL i bråket som Urea/SDS och 4 µL kombinerade totalprotein. Utföra en totalprotein blot färgning för att övervaka proteinnivåer. Genom Western blotting med specifika antikroppar, verifiera ändringar i olöslighet för enskilda proteiner kvantifieras av masspektrometri (se avsnitt 3).
  3. Olösligt protein utvinning att isolera SDS-olösliga proteiner för masspektrometri
    Obs: Utföra alla steg på is.
    1. På torr is gånger väger ut två 350 mg marken maskar per tidpunkt och RNAi bakterier (unga och äldre maskar, styra RNAi bakterier och RNAi bakterier för gen av intresse) i 2 mL rör.
    2. Ta bort high-salt lösliga proteiner genom att lägga till två volymer av RAB per vikt (700 µL) med hämmare, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNAS jag, och 100 µg/mL RNase A till varje rör och solubilize pulvret på is. Dra upp suspensionen i en 1 mL spruta (grå nål, 27 G x ½ ”, 0,4 mm x 13 mm) 15 gånger och inkubera det på is för 10 min. Centrifugera vid 18,400 x g i 20 min vid 4 ° C. Gå igenom fettlagret och samla supernatanten innehållande hög salthalt lösliga proteiner i en 2 mL rör per tillstånd (fyra rör totalt). Ta bort fettet och kassera den. Alikvotens hög salthalt lösliga proteiner att frysa vid-80 ° C.
    3. Om du vill ignorera lipider, solubilize pelleten med 700 µL RAB-hämmare som innehåller 1 M sackaros (utan DNAS jag och RNase A). Dra upp suspensionen i en spruta 10 gånger och inkubera det på is för 5 min. Centrifugera vid 18,400 x g i 20 min vid 4 ° C. Var noga med att avlägsna alla supernatanten och lipider och kassera dem.
    4. Ta bort SDS-lösliga proteiner, solubilize pelleten med 700 µL RIPA bufferten. Dra upp suspensionen i en spruta 10 gånger och inkubera det i 10 min på is. Centrifugera vid 18,400 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Samla in supernatanten innehållande SDS-lösliga proteiner och alikvot för frysning vid-80 ° C.
    5. Pool två prover av varje grupp efter solubilizing varje pellet med 500 µL RIPA bufferten villkor. Dra upp suspensionen i en spruta 10 gånger. Centrifugera vid 18,400 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Var försiktig med att ta bort alla supernatanten och kassera den.
      Obs: Mål utvinning är att skilja de lösliga proteinerna från de olösliga proteinerna. Det är därför viktigt att ta bort alla återstående RIPA supernatant innan du lägger till myrsyra i nästa steg.
    6. Solubilize slutliga pelleten som innehåller mycket olösliga proteiner med 400 µL 70% myrsyra och dra upp suspensionen i en spruta 20 gånger. Inkubera i 20 min på is. Centrifugera vid 50 000 x g i 20 min vid 4 ° C, 3 acceleration och retardation 5, för att ta bort masken nagelband skräp. Samla in supernatanten som innehåller mycket olösliga proteiner och frysa den vid-80 ° C.
    7. Dialys av olösligt protein fraktioner för masspektrometri
      Obs: Dialyze vid 4 ° C.
      1. Förbereda 8 L dialys buffert (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7.5) och dela upp det till åtta 1 L bägare. Placera tre membran (membranfilter = 0,025 µM) på buffert ytan för varje 1-litersbägare.
      2. Per membran, noggrant fylla 65 µL av olösligt protein solubilized i myrsyra som erhölls i steg 2.3.6. Varje villkor är uppdelad på sex membran.
      3. Kontrollera pH-värdet i ett prov genom att ta bort 5 µL och lägga det på en pH-remsa. Om pH är mellan 7 och 8 (ungefärligt efter 2 h), samla in provet genom pipettering försiktigt upp och ner. Slutligen Använd 10 µL dialys buffert för att Tvätta fällningen av varje membran. Frysa prover vid-80 ° C.

3. omfattande identifiering och kvantifiering av förändringar i Protein olöslighet med åldern som induceras av RNAi inriktning en gen av intresse

  1. Beredning för Mass spectrometry analys
    1. Utvärdera mängden olösliga proteiner i dialyzed prover av lastning en alikvot till en 4-12% toning gel samt ett referensprov av känd koncentration. Utföra en totalprotein gel färgning och kvantifiera mängden protein med en bild analys programvara. Detta steg är nödvändigt att uppskatta beloppet av trypsin som behövs för matsmältningen (steg 3.1.4).
    2. Koncentrera sig proverna använda en centrifugal förångare och solubilize olösliga proteiner i en slutlig koncentration på 8 M urea.
    3. Alkylering och minskning
      1. Lägg till Tris(2-carboxyethyl) fosfin hydroklorid (TCEP) till en slutlig koncentration på 4 mM till proverna. Inkubera i 1 h vid 57 ° C med 300 rpm. Sätta proverna till rumstemperatur.
      2. Lägga till iodoacetamide till en slutlig koncentration på 8,4 mM. Inkubera det 45 min (kan inkuberas för 2 h) i mörker vid rumstemperatur.
      3. Späd ut proverna i 150 mM hjorthornssalt till en slutkoncentration av 2 M-urea.
    4. Smälta proteiner med 5% w/w modified trypsin över natten vid 37 ° C och 400 rpm.
    5. Läsa in ett urval av de smälta proteinerna på en gel med 12% i SDS och utföra en totalprotein gel färgning för att analysera om matsmältningen arbetat. Om det finns fortfarande några band som är närvarande, upprepa steg 3.1.4 och 3.1.5.
    6. Peptider från unga och äldre kontroll och RNAi behandlas C. elegans är märkta med isobariska taggar för relativa och absoluta kvantitering följa tillverkarens instruktioner.
      Obs: Alternativt andra metoder för märkning av peptider eller proteiner kunde användas för kvantifiering som tandem mass taggar.
      Obs: Samlas spectrometry analys: för att minska prov komplexitet, peptider ska avgränsas med stark ering exchange kromatografi i olika fraktioner för masspektrometri analys5. Flera masspektrometrar klarar av att analysera isobariska taggar för relativa och absoluta kvantitering som beskrivs på andra ställen17. Uppgifterna bör behandlas med lämplig programvara. Övergripande möjliggör analysen identifiering av mycket olösliga proteiner och deras ändringar på ålder och proteostasis modulering.

4. in Vivo utvärdering av påverkan av en gen av intresse på Aggregation mönstret vid åldrande

  1. Masspektrometri analysen i avsnitt 3, Välj en åldersberoende aggregation-benägen protein som ackumuleras i olika utsträckning i de djur som utsätts för RNAi. Generera transgena C. elegans rader som uttrycker detta protein märkta med ett fluorescerande protein och under kontroll av dess respektive tillskyndare eller en vävnad-specifika promotorn (se diskussion för valet av ett lämpligt arrangören). Upprätthålla påfrestningen vid 15 ° C med standardmetoder på Nematoden tillväxt (NG) tallrikar som ympats med OP50. Till exempel, vi valde en mask stam uttrycker polyadenylate-bindande protein (PAB-1) smält vid N-terminalen till tagRFP under kontroll av den faryngeal muskel promotor pmyo-2.
  2. In vivo utvärdering av förändringar i aggregering med åldern vid hämning av genen av intresse
    1. En till två dagar i förväg förbereda NG/carbenicillin (Carb) / IPTG tallrikar med en kontroll (tom RNAi vektor L4440) bakterier och RNAi bakterier att hämma gen av intresse. (För ett detaljerat protokoll om RNAi i C. elegans se JoVE Science Education Database. Essentials i biologi 1: jäst, Drosophila och C. elegans. RNAi i C. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. För RNAi behandling från L1, plats äggläggningen maskar på flera separata små NG/Carb/IPTG (6 cm diameter) plattor som ympats med kontroll RNAi eller RNAi bakterier för gen av intresse vid 20 ° C. Ta bort vuxna efter 2 h, att hålla avkomman vid 20 ° C. För att undvika defekter, kan RNAi behandlingar startas efter den L4 larvstadium.
    3. När avkomman når den L4 larvstadium, överföra dessa L4s på nya NG/Carb/IPTG plattor som ympats med kontroll RNAi eller RNAi bakterier för gen av intresse. Ställa in nio plattor med 15 transgenics varje för båda villkoren och hålla dem vid 20 ° C. Åldrande maskar behöver överföras från deras avkomma till nya plattor varannan dag fram till slutet av deras reproduktiva period för att kunna skilja dem från deras avkomma.
    4. Värdera förändringar i fördelningen av proteinet aggregation-benägen märkt med en fluorescerande tagg under fluorescerande stereo-Mikroskop med 24 x förstoring under vuxenlivet, varannan dag.
      Obs: Åldersberoende ansamling av aggregation-benägen protein i ljusa puncta används som ett avläsningssystem för aggregering. Dessa puncta bör vara mycket orörlig strukturer för att betecknas som aggregat. Detta bör fastställas av fluorescens återställning efter fotoblekning (FRAP) med konfokalmikroskopi. För aggregerade protein, bör ingen återhämtning observeras i regionen blekt efter minst 4 min5,18. För att kvantifiera förändringarna med åldern, vi gjorde spridningsmönster i ålder-synkroniserad maskar överuttryck PAB-1 på dag 2, dag 5 och dag 7 av vuxenlivet som följande: låga aggregering nivåer (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta i bakre svalget glödlampa), medelstora aggregering nivåer (mer än 10 puncta i den bakre svalget glödlampan), och hög aggregering nivåer (mer än 10 puncta i främre faryngala glödlampan).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi använde metoder presenteras här för att utvärdera hur långlivat djur med nedsatt IIS modulera åldersberoende protein aggregering. Genom Western blot (se steg 2.2, snabb olösligt protein utvinning för Western blot analys), Vi analyserade totala och olösliga proteinhalten i ung (dag 3 vuxen) och åldern (dag 18 av vuxenlivet) maskar på kontroll RNAi och RNAi inriktning insulinet / IGF-1-like receptor daf-2. Vi observerade inga stora förändringar i totala proteinnivåer med ålder eller mellan kontroll och daf-2 RNAi villkor (figur 2A). Som förväntat, upptäckte vi en stark åldersrelaterade ökning i nivåer av mycket olösliga proteiner i kontrolldjur (figur 2B). I jämförelse med de långlivade djur på daf-2 RNAi, var aggregering benägenhet kraftigt reducerad. Hela protein färgning av olösliga extrakten visade en mindre komplex protein band mönster i extrakt från 18 dagar gamla maskar på daf-2 RNAi jämfört med åldersmatchade kontroller. Kvantitativa masspektrometri-analysen visade att långlivade djur med nedsatt IIS har övergripande mindre ålder-associerade protein aggregering och ännu viktigare, daf-2 hämning helt upphävts den åldersberoende olöslighet av en specifik delmängd av proteiner7. Att följa upp dessa fynd fokuserade vi på en av dessa aggregation-benägen proteiner, PAB-1. PAB-1 är ett RNA-bindande protein med en förutspådd ”prion-liknande”-domän. Antikropp färgning bekräftade att långlivade djur underhålls PAB-1 lösliga med ålder (figur 2C).

För in-vivo analys av PAB-1 aggregering producerade vi transgena djur uttrycker tagRFP::PAB-1 i svalget musklerna. Hos unga djur, tagRFP::PAB-1 var främst diffust ligger hela svalget (figur 3A, ”låg” mängdnivån) men med åldern, vi observerat en progressiv ackumulation i ljusa puncta startar i de bakre svalget glödlampan ( Figur 3A, ”mellanliggande” mängdnivån). Vid åldrande observerats vi också aggregation i främre faryngala glödlampan (figur 3A, ”hög” aggregationsnivå) i ett ökande antal djur. Genom att gruppera djur i dessa olika kategorier gjorde vi andelen PAB-1 aggregering i en befolkning. På dag 2 i vuxen ålder de flesta maskar (88%) hade ingen eller mycket få puncta och inga djur med hög aggregering nivåer upptäcktes. Redan på dag 5 presenterade 19% av befolkningen visade mellanliggande och 16% hög aggregering nivåer, medan på dag 7 mer än 70% av maskar mellanliggande och hög aggregation nivåer. Att analysera effekten av livslängden på åldersberoende sammanläggning av tagRFP:PAB-1, genererade vi transgena tagRFP::PAB-1 maskar med en daf-2 mutation. Dessa djur visade signifikant minskad tagRFP:PAB-1 puncta formation med åldrande, med mindre än 15% av befolkningen uppvisar mellanliggande och hög aggregation nivåer även vid dag 7 (figur 3B).

Genom att använda de olika metoder som beskrivs här, avslöjade vi att minskad IIS förhindrar åldersberoende protein aggregation i olika utsträckning och långlivade djur är särskilt effektiv i att återställa dynamiken i PAB-17.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk av arbetsflödet att studera förändringar i inneboende protein aggregering med åldern i C. elegans.  Viktigaste stegen är fet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Protein olöslighet ökar med åldern hos kontrolldjur, men inte hos djur med nedsatt daf-2 signalering. (A) totalprotein färgning av totala fraktionen från dag 3 och dag 18 gon-2(-) mutanter underkastas kontroll och daf-2 RNAi (vuxit vid 25 ° C). (B) totalprotein färgning av SDS-olöslig fraktionen från dag 3 och dag 18 gon-2(-) mutanter underkastas kontroll och daf-2 RNAi (vuxit vid 25 ° C). Panelen som publiceras från referens7. (C) Immunoblot upptäcka PAB-1 i SDS-olöslig bråkdel, relevanta protein band markerad med röd pil. Panelen som publiceras från referens7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Minskad daf-2 signalering förhindrar ansamling av tagRFP::PAB-1 puncta med åldern. (A) representativa bilder av maskar med tagRFP::PAB-1 överuttryck i svalget musklerna (hög förstoring Mikroskop, tagRFP detection inställningar: excitation 558 nm, emission 583 nm). Djur med låg (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta i bakre svalget glödlampa), mellanliggande (mer än 10 puncta i den bakre svalget glödlampan) eller hög aggregering nivåerna (mer än 10 puncta i främre faryngala glödlampan) visas. Skalstapeln = 20 µm. (B) kvantifiering av olika tagRFP::PAB-1 aggregering nivåer med åldern i vildtyp och daf-2 mutant bakgrunden avslöjar starkt fördröjd tagRFP::PAB-1 sammanläggning med åldern i långlivade djur. Dag 2, dag 5 och dag 7 daf-2(-) kontra vildtyp bakgrund, låg jämfört med mellanliggande och hög aggregation nivåer: Fishers exakta test, ***p < 0,0001. Panelen som publiceras från referens7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Stamlösning Belopp Slutlig koncentration Kommentarer/Beskrivning
Flytande kultur, total volym 300 mL
S basal (för 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M kalium fosfatbuffert pH 6) 200 mL 1 M kalium fosfatbuffert pH 6: för 1 L: 129 g KH2PO4 monobasiskt, 52 g K2HPO4 dibasiskt vattenfri
1 M kalium citrat pH 6 (för 400 mL: 13,1 g citronsyramonohydrat, 134,4 g tri-kalium citrat monohydrat) 3 mL 10 mM
Spåra metaller lösning (för 1 L: 1,86 g etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O) 3 mL Beståndet förvaras i mörker vid 4 ° C
1 M MgSO4 (för 500 mL: 123,3 g) 900 ΜL 3 mM
1 M CaCl2 (för 500 mL: 73,5 g) 900 ΜL 3 mM
200 µg/mL karbendazim (för 50 mL: 10 mg i metanol) 150 ΜL 100 ng/mL
5 mg/mL kolesterol (för 100 mL: 0,5 g etanol) 300 ΜL 5 µg/mL
(RAB) hög-salt utvinning sammansättningsbufferten, 30 mL
1 M 4-Morpholineethanesulfonic syra (MES) 3 mL 100 mM RAB lager buffert komponent
0,5 M Ethyleneglycoltetraacetic syra (EGTA) 60 ΜL 1 mM RAB lager buffert komponent
0,5 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) 6 ΜL 0,1 mM RAB lager buffert komponent
1 M MgSO4 15 ΜL 0,5 mM RAB lager buffert komponent
5 M NaCl 4,5 mL 750 mM RAB lager buffert komponent
1 M natriumfluorid (NaF) 600 ΜL 20 mM RAB lager buffert komponent
Fyll på till 30 mL totalt med ddH2O
50 x proteas hämmare Cocktail * 2 x * Lägga till reagenser efter tar mängden RAB lager buffert som behövs (för utvinning för masspektrometri 6 mL).
100 mM Phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) i isopropanol,-20 ° C * 1 mM
10 U/µL DNaseI * 200 E/mL
4 mg/mL RNaseA * 100 µg/mL
RAB med 1 M sackaros, 30 mL
2 M sackaros (för 50 mL: 34,2 g) 15 mL 1 M Lägg till RAB buffert reagenserna förutom DNaseI och RNaseA
Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysbuffert, 30 mL
1 M Tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris) pH 8 1,5 mL 50 mM RIPA lager buffert komponent
5 M NaCl 0,9 mL 150 mM RIPA lager buffert komponent
0,5 M EDTA 0,3 mL 5 mM RIPA lager buffert komponent
10% sodium dodecyl sulfate (SDS) 1,5 mL 0,50% RIPA lager buffert komponent
10% natriumdeoxikolat (SDO) 1,5 mL 0,50% RIPA lager buffert komponent
Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) 0,3 mL 1% RIPA lager buffert komponent
Fyll på till 30 mL totalt med ddH2O
100 mM PMSF * 1 mM * Lägga till reagenser efter tar mängden RIPA lager buffert som behövs (för utvinning för masspektrometri 10 mL).
50 x proteas hämmare Cocktail * 1 x
Urea/SDS buffert, 10 mL
Urea 4,8 g 8 M
10% SDS 2 mL 2%
Ditiotreitol (DTT) 77 mg 50 mM
1 M Tris pH 8 0,5 mL 50 mM
Fyll på till 10 mL totalt med ddH2O
Dialys buffert, 1 L
Tris 6 g 50 mM
DTT 154 mg 1 mM
100 mM PMSF 1 mL 0,1 mM
Justera till pH 7,5 och komplett till 1 L totalt med ddH2O

Tabell 1: Buffertar för flytande kultur, olösligt protein utvinning och dialys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här rapporterar vi en metod att isolera mycket olösliga protein aggregat från åldrande C. elegans utsätts för RNAi för analys av masspektrometri och Western blotting. Vi visar att förbättra proteostasis genom att minska IIS kraftigt förhindrar åldersberoende protein aggregering. Genom att välja specifika aggregation-benägen proteiner till överuttrycka i C. elegans, är det möjligt att dissekera ytterligare mekanismer modulerande inneboende protein aggregering.

Inneboende åldersberoende Protein Aggregation kontra sjukdomsassocierade Protein aggregering
Detta nuvarande arbete bygger på de tidigare resultaten som protein aggregering inte är begränsad till specifika proteiner sammanvägning i en sjukdom sammanhang. Genom att fokusera på endogena aggregation-benägen proteiner i stället för ectopically uttryckta sjukdomsassocierade proteiner, är förhoppningen att ge nya insikt i fysiologiska regleringen av aggregation processen. Som åldersberoende protein aggregat finns i olika cellulära platser5, bör deras studie ger också inblick i kupé särskilda mekanismer för kvalitetskontroll. Övergripande, de mekanismer som styr inneboende protein aggregation kan också vara relevant för att förebygga sjukdom protein aggregering. Notera, trots åldersberoende protein aggregering liknar i flera aspekter sjukdom protein aggregering, det är fortfarande oklart huruvida dessa aggregat innehåller amyloida fibriller, kännetecknar många sjukdom aggregat.

Val av C. Elegans modell: fördelar och begränsningar
Jämfört med en däggdjur modell, är en av de största fördelarna med C. elegans för att studera ett åldersrelaterade kännetecken dess mycket kort livslängd. Flera hundra proteiner blivit konsekvent mycket-aggregation-benägen vid åldrande och den stora ökningen i olöslighet är lätt påvisbara även med en förenklad biokemiska utvinning. Dock är en stor begränsning med C. elegans för att studera åldersberoende protein aggregering nödvändigheten att isolera stort antal äldre djur. C. elegans är hermafroditer och producerar cirka 220 eller mer avkomma under deras reproduktiva fas19, är det viktigt att förhindra reproduktion eller eliminera avkomma så för att ålder en befolkning. Det finns flera alternativ att inducera sterilitet: ett alternativ är att använda den kemiska fluorodeoxyuridine (FUdR), en hämmare av DNA-syntes. FUdR leder dock till många biverkningar inklusive förändringar i proteostasis och minskat protein aggregering20,21,22. Ännu viktigare, inducerar FUdR genotyp-specifik Svaren23. Ett annat alternativ är att använda temperaturkänsliga sterila mutanter. Till exempel har spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), och gon-2(q388) använts tidigare för masspektrometri analyser av åldersberoende aggregera proteomet5, 8.

Ändå finns det flera begränsningar med dessa mutanter. Först, eftersom steriliteten är temperaturberoende, är det nödvändigt att växa djuren vid 25 ° C, vilket utgör en mild stress och påskyndar åldrande samt protein aggregering. Däremot har vi observerat att gon-2, glp-1 och fem-1 mutanter är hållbarare jämfört med vildtyp när upprätthålls vid 25 ° C (inga data anges). För det andra, finns det särskilda begränsningar som är associerade med varje typ av reproduktiva defekt. En nackdel med att använda spermier-defekta mutanter är produktionen av obefruktade äggceller (också produceras i år vildtyp hermafroditer). Kvaliteten på dessa oocyter minskar kraftigt med åldern och de ackumuleras i gonad24,25. Kvantitativa masspektrometri analys visar att spermier-defekta mutanter har flera gånger högre halter av olösliga proteiner ansamlas med åldern jämfört med gonad-mindre eller könsceller-brist mutanter. Detta indikerar att protein Skellefteåsjukan och aggregering ligger i gonad5, överens med tidigare studier12,13 och i vivo experimenterar avslöjande aggregerade proteiner i den onormala äggcellen kluster5. Överdriven protein aggregation i gonad skulle därför maskera mer subtila förändringar i protein aggregering i somatiska vävnader. Detta bör också beaktas när man jämför interventioner som fungera i olika utsträckning på reproduktiv och somatisk vävnad proteostasis. Därför för att bedöma endast somatiska protein aggregering, gynnar vi använder gonad-mindre gon-2 mutanter. Ett alternativ vore att använda könsceller-brist glp-1 mutanter. Vi noterar dock att dessa djur har mindre inneboende protein aggregering med åldern jämfört med gon-2 mutanter5. Detta är sannolikt en följd av förbättrade proteostasis i somatiska vävnader på grund av signalering från könsceller-defekta gonad26,27,28. Ett annat alternativ är att använda vilda djur och ta bort avkomma varje dag genom sedimentering. Detta är dock problematiskt på grund av svårigheten att helt ta bort alla avkomman.

En annan allmän begränsning av med C. elegans är dess liten storlek vilket gör specifika vävnad extraktioner utmanande. Eftersom sådana hela djur extraktioner inte ger relevant information om hur olika villkor modulera protein aggregation i specifika vävnader. Notera, skulle problemet potentiellt kunna kringgås genom att använda en nyligen utvecklad metod baserad på fluorescens-aktiverad cell sortering för att isolera specifika celler från C. elegans29. Ännu återstår det avgöras huruvida denna metod skulle vara lämpliga att erhålla tillräckligt material för olösligt protein utvinning och huruvida det skulle vara tillämpliga på äldre djur. Alternativt kan vävnad specifikt protein aggregering och dess reglering utredas genom ytterligare i vivo experiment. Som transgena djur uttrycker en fluorescently-märkt aggregation-benägen protein val kan snabbt genereras och djuren är transparent, det är relativt lätt att undersöka protein aggregation i situ.

Sammantaget är det viktigt att följa upp proteomiska resultatet med in-vivo -experiment i en bakgrund med vildtyp. Kombinationen av en biokemisk och mikroskopi-baserade karakterisering möjliggör en omfattande studie av protein aggregation och en bedömning av rollen av gener av intresse. Den senare underlättas i C. elegans av RNAi förmedlas genom utfodring och tillgängligheten av hela genomet RNAi bibliotek. Dessutom finns ett stort antal kännetecknas mutanter att bekräfta resultat som erhållits av RNAi eller använda i stället för RNAi.

Flytande kultur och biokemiska utvinning: fördelar och begränsningar
Eftersom högt-aggregerade proteiner utgör endast en liten del av totala proteiner, är det nödvändigt att starta utvinning med ett stort antal djur. Med stora mängder olösliga proteiner är det då möjligt att utföra omfattande peptid fraktionering för att minska prov komplexiteten för masspektrometri och därmed förbättra identifiering av lägre riklig proteiner. Om endast små mängder av olösliga proteiner krävs, är ett alternativ att växa maskar på tallrikar och homogenisera dem med keramiska pärlor. En av nackdelarna med flytande kultur är att när det gäller en förorening, hela kulturen påverkas och måste kasseras. I allmänhet, C. elegans åldrande påverkas starkt av temperatur och denna parameter måste styras noggrant i flytande kultur att undvika variationer i åldersberoende protein aggregering. Temperaturkontroll är också viktigt att få en homogen befolkning gonad-mindre djur när du använder gon-2(-) mutanter.

Beroende på syftet med studien är det viktigt att överväga olika extraktionsmetoder. Biokemiska utvinning presenteras här var ursprungligen anpassad från protokoll att isolera sjukdomsassocierade aggregat11,30,31. Vi valde relativt höga koncentrationer av rengöringsmedel såsom 0,5% SDS att isolera mer olösliga aggregat. Också genom pelletering 0,5% SDS olösliga aggregat med låg centrifugal hastigheter, skulle detta protokoll bara isolera de större aggregat. Alternativt, ett mindre strikta protokoll var nyligen publicerad10. I denna studie utvanns mer lösliga och mindre aggregat också genom att utelämna SDS och genom att använda mycket höga centrifugal hastigheter vid 500 000 x g. En jämförelse av de olika protokoll visar en allmän ökning av antalet proteiner i det aggregera proteomet använder mindre strikta protokoll7. Vi noterar att långlivade djur med nedsatt daf-2 signalering effektivt förhindras ackumuleringen av både SDS-lösliga och olösliga i SDS aggregat i gonad-mindre djur7.

In Vivo Analys av åldersberoende Protein Aggregation
När konstruera transgena modeller för följande åldersberoende protein aggregering, är det relevant att överväga i vilken vävnad till överuttrycka aggregation-benägen proteinet av intresse och på vilka nivåer. Vi gynnar uttryck i vävnader i regionen huvudet för att undvika störningar med autofluorescens, som är framträdande i åldrande tarmen. För att visualisera lysrör-märkt aggregat med låg-förstoring, bör aggregation-benägen proteinet uttryckas på en relativt hög nivå. Däremot, kommer att för högt uttryck orsaka aggregation-benägen proteinet bildar aggregat redan hos unga djur.

Sammantaget hjälper dessa metoder oss att förstå varför en del av proteomet aggregat med ålder och i slutändan leda till utvecklingen av strategier för att främja hälsosamt åldrande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av medel från DZNE och en Marie Curie-programmets internationella återintegreringsbidrag (322120 till D.C.D.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fernbach culture flask  Corning 4425-2XL Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap  Schott 1088655 GL45
Nutating Mixer VWR 444-0148
Separatory funnel Nalgene 4300-1000 Capacity 1,000 ml
1 ml syringe  BD Plastipak 300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm BD Microlance 3 300635
Membrane filters 0.025 µM Millipore VSWP04700
pH strip Machery-Nagel 92110 pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693132001 Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9  Applichem A1388 Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol Applichem A1694 Nonidet P40 (NP40)
DNaseI Roche 04716728001 recombinant, RNase free
RNaseA Promega A7973 solution
Total protein blot staining Thermofisher S11791 Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining Thermofisher S12001 Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) Serva 36970
Iodoacetamide Serva 26710
Ammoniumbicarbonate Sigma-Aldrich 09830
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation Sciex 4352135 iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP Beckmann Coulter 393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP Beckmann Coulter 393315
Centrifuge 5424R Eppendorf 5404000413
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702000329
Centrifuge Megafuge 40R Thermo Scientific 75004518
Concentrator Plus Eppendorf 5305000304 Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC  Leica With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope Leica  Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 Zeiss With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software ImageJ
Analysis of mass spectrometry data Protein Prospector http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50 CGC
RNAi bacteria
L4440 Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253 CGC, strain name: EJ1158  Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
  3. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  4. Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
  5. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
  6. Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
  7. Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
  8. Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
  9. Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
  10. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
  11. Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
  12. Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
  13. Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
  14. Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
  15. Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  16. Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
  17. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
  20. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
  21. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
  22. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
  23. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  24. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
  25. Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
  26. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
  27. Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
  28. Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
  29. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
  30. Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
  31. Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).

Tags

Biokemi frågan 129 åldrande protein olöslighet protein aggregering protein Skellefteåsjukan proteostasis C. elegans neurodegenerativa sjukdomar biokemi
Metoder för att studera förändringar i inneboende Protein aggregering med åldern i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Groh, N., Gallotta, I., Lechler, M.More

Groh, N., Gallotta, I., Lechler, M. C., Huang, C., Jung, R., David, D. C. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (129), e56464, doi:10.3791/56464 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter