Summary
Målet med den metode, der præsenteres her er at udforske protein sammenlægning under normal aldring i model organisme C. elegans. Protokollen repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere meget tungtopløseligt store aggregater, der danner med alderen og at fastslå, hvordan ændringer i proteostasis påvirker protein sammenlægning.
Abstract
I de sidste årtier, er forekomsten af neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom (AD) og Parkinsons sygdom (PD), vokset. Disse alder-associerede forstyrrelser er kendetegnet ved forekomsten af protein aggregater med fibrillære struktur i hjernen hos disse patienter. Præcis derfor normalt opløselige proteiner undergår forbliver en sammenlægning proces dårligt forstået. Den opdagelse, at protein sammenlægning er ikke begrænset til sygdomsprocesser og i stedet en del af den normale aldringsproces giver mulighed for undersøgelse af de molekylære og cellulære mekanismer, der regulerer protein sammenlægning, uden at bruge ectopically udtrykt menneskelige sygdom-associerede proteiner. Her beskriver vi metoder til at undersøge iboende protein sammenlægning i Caenorhabditis elegans gennem komplementære metoder. Først skal vi undersøge, hvordan at vokse stort antal alder-synkroniseret C. elegans at få fyldt dyr og præsenterer vi de biokemiske procedurer for at isolere meget-uopløselige-store aggregater. I kombination med en målrettet genetiske knockdown, det er muligt at dissekere et gen af interesse i at fremme eller forebygge aldersbetinget protein sammenlægning ved hjælp af enten en omfattende analyse med kvantitativ massespektrometri rolle eller en kandidat-baseret analyse med antistoffer. Disse resultater bekræftes derefter af i vivo analyse med transgene dyr udtryk for fluorescerende-tagged sammenlægning-tilbøjelige proteiner. Disse metoder bør hjælpe klarlægge hvorfor visse proteiner er udsat for aggregat med alderen og i sidste ende hvordan du holder disse proteiner fuldt funktionel.
Introduction
Protein misfoldning og sammenlægning er anerkendt som et adelsmærke for flere neurodegenerative sygdomme som annonce, PD, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og mange andre. For eksempel, α-synuclein forsamlinger i amyloid fibriller der ophobes som Lewy organer især i substantia nigra PD patienter, mens i ALS patienter TDP-43 eller FUS misfold til form cytoplasmatisk aggregater i udarter motor neuroner. I hver af disse neurodegenerative sygdomme undlader mekanismer opretholde protein homøostase eller proteostasis at forhindre ophobning af fejlfoldede proteiner, derfor fører til sygdom.
Proteostasis er afgørende for at sikre cellulære funktioner og under normale betingelser disse reguleringsmekanismer styre stramt hastigheden af proteinsyntesen, folde og nedbrydning. Flere undersøgelser viser, at med aldrende, mange celler og organer evne til at bevare protein homeostase er gradvist kompromitteret og fysiologiske forværringen af proteostasis netværkene med alder er en vigtig skærpende faktor for neurodegenerative sygdomme (gennemgik i referencer1,2,3). Det faktum, at protein kvalitetskontrol og den cellulære reaktion på udfoldet protein stress er kompromitteret med alderen tyder på, at protein misfoldning og sammenlægning kunne være en almindelig konsekvens af aldring. Ja, vi og andre har demonstreret at protein sammenlægning er ikke begrænset til sygdom og i stedet en del af proteomet bliver meget detergent-uopløselige i alderen dyr4,5,6,7 ,8,9,10. Numerisk og i vivo analyse afslørede, at disse fysiologiske aldersrelaterede aggregater ligne sygdom aggregater i flere aspekter5. Opdagelsen af endogene, aldersbetinget protein aggregation giver os mulighed for at dissekere de molekylære og cellulære mekanismer, der regulerer protein sammenlægning, uden at bruge ectopically udtrykt menneskelige sygdom-associerede proteiner. I øjeblikket findes kun begrænsede oplysninger om regulering af udbredt protein kan og om virkningerne af denne dysregulering på sundheden for organismen.
Den nematodeprøveudtagning C. elegans er en af de mest omfattende studerede modelorganismer i aldring forskning, som disse dyr har en forholdsvis kort levetid og vise mange karakteristiske aging funktioner observeret i højere organismer. Virkningerne af aldring på protein kan er blevet undersøgt i C. elegans af sekventielle biokemiske fraktionering baseret på differentierede opløselighed, som er almindeligt anvendt til at udtrække sygdom aggregater i neurodegeneration forskningsområdet11 . Ved kvantitativ massespektrometri, var flere hundrede proteiner vist at blive sammenlægning-liggende i C. elegans i mangel af sygdom5. Her beskriver vi i detaljer protokollen for at vokse stort antal orme i flydende kultur og den sekventielle udvinding at isolere aggregerede proteiner til kvantificering af massespektrometri og analyse af vestlige skamplet. Fordi fejlfoldede og sammenlægning-tilbøjelige proteiner ophobes i alderen C. elegans gonaderne og masker ændringer i andre somatiske væv5,12,13, bruger vi en gonade-mindre mutant for at fokusere analysen på protein kan i ikke-reproduktive væv. Metoden fremlægges muliggør analysen af stærkt uopløseligt, store aggregater, der er uopløselig i 0,5% SDS og pelleted ved relativt lav centrifugal hastighed. Alternativt, et lempeligere udvinding protokollen at indsamle også mindre og mere opløselige aggregater har været offentliggjort andetsteds10. Derudover beskrive vi metoden bruges til at vurdere sammenlægning i vivo i C. elegans.
Samlet set kan disse metoder i kombination med RNA-interferens (RNAi) vurdere rolle i et gen af interesse i modulerende aldersbetinget protein sammenlægning. Dette beskriver vi analyse af uddrag af unge og ældre orme med og uden knockdown af et specifikt protein af interesse ved hjælp af RNAi. Disse metoder bør være et effektivt redskab til at bestemme, hvilke komponenter af proteostasis netværket regulere protein kan. Flere interventioner såsom nedsat insulin/insulin-lignende vækstfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har vist at dramatisk forsinke C. elegans aging14. Levetiden veje fremkalde ofte protein-kvalitet kontrolmekanismer og dermed disse veje kunne aktivt påvirke hastigheden af protein sammenlægning. Som et eksempel demonstrere vi reduceret iboende protein sammenlægning i langlivede dyr ved hæmning af IIS vej7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: For en bedre forståelse af proceduren, en skematisk af arbejdsproces (figur 1) er fastgjort.
1. vækst i stort tal af unge og ældre C. elegans udsat for RNAi målretning et gen af interesse
Bemærk: Brug C. elegans temperatur-induceret sterile gon-2(q388) mutanter (CF2253) at opnå store alderen-synkroniseret befolkninger. Under alle trin er det vigtigt at arbejde under semi-sterile forhold med åben ild og at kontrollere at ingen forureninger (for eksempel med svampe eller bakterier) er til stede. Udfør trin (også centrifugations) ved stuetemperatur, hvis temperaturen ikke er beskrevet.
- Forberedelse af C. elegans gon-2(-) mutanter at opnå gonade-mindre dyr
Bemærk: For at få sterile dyr mangler gonaderne, tab af funktion mutation skal fremkaldes i forældregenerationen ved at flytte disse på det sidste larve stadie (L4) til 25 ° C for at undgå maternel bidrag.- Første udvidelse af gon-2(-) dyr til at indsamle forældrenes generation for temperatur Skift
- Streak Escherichia coli OP50 stamme på en Lysogeny bouillon (LB) tallerken og inkuberes det natten over ved 37 ° C.
- Den næste dag podes 200 mL LB medium med én OP50 klon og inkuberes det natten over ved 37 ° C.
- De næste dag frø 15 høj vækst (HG) medium plader (diameter 9 cm) med 0,5 mL OP50 og distribuere OP50 med en spatel. Holde pladerne ved stuetemperatur i to dage.
- Luns gon-2(-) dyr (ikke sultet for de sidste to generationer) på 15 HG mellemlang plader med OP50 og fastholde dem ved 20 ° C, indtil pladerne er sammenflydende med voksne og nogle OP50 er stadig tilgængelige.
- I mellemtiden frø 60 HG mellemlang plader med OP50 som beskrevet i trin 1.1.1.3 og holde pladerne ved stuetemperatur. Forsigtig: Seedede plader bør ikke opbevares i mere end en uge som agaren vil knæk ved stuetemperatur.
- Bleach sammenflydende pladerne, når de fleste voksne begynder at lægge æg som tidligere beskrevet15. Indsamle æg i to 15 mL-rør og placere på en nutating mixer natten over ved 20 ° C.
- Den næste dag vask udklækket L1s med M9 buffer (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): centrifugeres ved 3.000 x g i 30 s, Fjern supernatanten og fyld op til 15 mL mærket med M9. Der centrifugeres, supernatanten fjernes, og Gentag trin 1.1.1.6. Fylde rørene med deraf følgende orm pellets op til 15 mL mærket med M9.
- Vurdere det samlede antal L1s med en dissektion mikroskop ved at tælle L1s stede i 2 µL dråber placeret på ikke-seedede agar plader. Gennemsnitlig tal fremstillet af mindst ni dråber.
- Tilføje 6.500 L1s pr. seedede HG plade og lad ormene vokse ved 20 ° C indtil L4 fase.
- Anden udvidelse af gon-2(-) dyr at få gonade-mindre dyr for eksperiment
- På L4 fase, skal du flytte orme fra trin 1.1.1.9 til 25 ° C, indtil de begynder at lægge æg og L1s rugeæg.
- Indsamling af æg og L1s ved bundfældning
Bemærk: Efter temperatur Skift til 25 ° C, det er at foretrække at bruge sedimentering som en blid teknik til at adskille de skrøbelige æg og L1s fra voksne.- Vaske pladerne med M9 ved hjælp af 5 mL M9 pr. fem plader. Overføres ormene til 50 mL rør.
- Fylde alle rør til 45 mL mærket med M9, lad den voksne sediment i ca 10 min, indsamle hver supernatanten i en 50 mL tube, og Gentag trinnet med pellet. Centrifugeres supernatanten, der indeholder æg og L1s på 3.000 x g i 1 minut, lad L1s sedimentet i ca 10 min, og Fjern supernatanten indtil 15 mL er tilbage.
Bemærk: Dette er et kritisk skridt. Fjern ikke supernatanten for tidligt for at indsamle så mange L1s som muligt. - Placer de rør, der indeholder æg og L1s på en nutating mixer overnatning på 25 ° C.
- Første udvidelse af gon-2(-) dyr til at indsamle forældrenes generation for temperatur Skift
- Flydende kultur gonade-mindre dyr at samle unge og ældre dyr udsættes for RNAi rettet mod et gen af interesse
Bemærk: Nogle gener svar RNAi kan være temperatur afhængige som tidligere beskrevet16. Som et alternativ til RNAi, kan en mutant gen indgå i gon-2(-) baggrund.- Forberedelse af bakterier til flydende kultur
- Forberede OP50 og RNAi bakterier (bakterier producerer den ønskede dsRNA og bakterier med den tomme vektor som kontrol) ved at vaccinere 4 L LB medium med 12 mL af den respektive bakteriekulturen (tilføje en endelig koncentration på 50 µg/mL carbenicillin og 1 mM IPTG til RNAi bakteriel kulturer) og dem der inkuberes ved 37 ° C natten over på 180 rpm.
- Den næste dag høste kulturer på 6.700 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjerne analysere og resuspend hver pellet i 60 mL iskold S basal medier (100 mM NaCl, 50 mM kalium fosfat pH 6, opbevares på is). Holde de tre resuspenderede pellets (OP50, styre RNAi bakterier, og RNAi bakterier for gen af interesse) ved 4 ° C indtil trin 1.2.2 eller 1.2.3.
Bemærk: Orme kan dyrkes på RNAi fra L1 fase (Se trin 1.2.3) eller at undgå udviklingsmæssige mangler fra den sidste larve stadie L4 (Se trin 1.2.2).
- Flydende kultur for behandling med RNAi begynder omsider larve stadie L4
- Tilføje 200 mL S basal medier i en Fernbach kultur kolbe (kapacitet 2.800 mL). For en endelige kultur volumen på 300 mL (Se 1.2.2.4), tilføje 10 mM kalium citrat, pH 6, 3 mL Trace metaller løsning (5 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), 2,5 mM FeSO4, 1 mM frihedsbevægelse2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL carbendazim og 5 µg/mL kolesterol). Kolben lukkes med en membran skruelåg. Se tabel 1 for opskrifter af buffere.
- Tag L1s ud af 25 ° C (trin 1.1.2.2.3) og overføre dem til 15 mL rør. Der centrifugeres ved 1.900 x g i 3 min, Fjern supernatanten og tælle L1s pr. 2 µL som i trin 1.1.1.8. Tilføje 500.000 L1s i den Fernbach kultur kolbe forberedt i forrige trin.
- Tilføje OP50 (fra trin 1.2.1) proportionalt med antallet af orme. For eksempel for 500.000 orme tilføje 60 mL OP50.
- Komplet orm kultur med S basal at bringe den samlede mængde til 300 mL. Inkuber orm kultur indtil L4 fase ved 25 ° C i en rystende kuvøse med 150 rpm.
- Den næste dag, bør orme være på størrelse med wild-type L4s. For at skifte fra OP50 til RNAi bakterier, indsamle dyr i seks 50 mL-rør, lad dem sediment og Fjern supernatanten. Vask L4s med M9 at fjerne resterende OP50 bakterier: centrifugeres ved 1900 x g i 3 min, Fjern supernatanten og overføre alle L4s ind i et 50 mL-rør. Tæl L4s pr. 5 µL (mindst ni gange). To gange 50.000 L4s er nødvendige for samlingen unge orm og to gange 100.000 L4s er nødvendige for samlingen alderen orm.
- Forberede fire Fernbach kultur kolberne som beskrevet i 1.2.2.1. Tilføj også en endelig koncentration på 50 µg/mL Carbenicillin og 1 mM IPTG til hver kolbe.
- Tilføje kontrol RNAi bakterier og RNAi bakterier for gen af interesse (fra trin 1.2.1) proportionalt med antallet af orme: tilføje 7 mL af de respektive bakterier pr. flaske for unge orme og 14 mL pr. flaske for alderen orme.
- Tilføje 50.000 orme pr. flaske for samlingen unge orm og 100.000 orme pr. flaske for samlingen alderen orm, og komplet kulturer med S basal at fylde op til 300 mL. Inkuber orm kulturer (fire i alt) på 25 ° C og 150 rpm.
- Flydende kultur for behandling med RNAi startende med L1 fase
- Forberede fire Fernbach kultur kolberne som beskrevet i 1.2.2.1 og tilføje en endelig koncentration på 50 µg/mL carbenicillin og 1 mM IPTG.
- Fortsætte med udarbejdelsen af L1s som beskrevet i 1.2.2.2. I alt 300.000 orme er nødvendige for at opdele dem i fire kolber.
- Tilføje kontrol RNAi bakterier og RNAi bakterier for gen af interesse (fra trin 1.2.1) proportional med antallet af orme som beskrevet i trin 1.2.2.7 og Overvej også vækstfase mellem L1 og L4 scenen: tilføje 13 mL af de respektive bakterier pr. flaske for unge w ORMs og 26 mL pr. flaske for alderen orme.
- Forsæt som beskrevet i trin 1.2.2.8.
- Vedligeholdelse af C. elegans flydende kulturer
- Regelmæssigt indsamle en prøve fra hvert flydende kultur og placere på et glas dias (alternativt på en agar plade) til at kontrollere, at der ingen forureninger. Bruger en dissektion mikroskop, kontrollere bakteriel mad niveauer i kulturen, især i vækstfasen. Forberede i forvejen 2 L kulturer af kontrol RNAi bakterier og RNAi bakterier for gen af interesse som beskrevet i trin 1.2.1. Tilføje disse til C. elegans flydende kulturer, hvis det er nødvendigt og holde resten ved 4 ° C.
- Kontrollér med jævne mellemrum, at dyrene er sterile. Fleste af dyr vil ikke have en gonade. Afhængigt af penetrans af gon-2 mutation, nogle kan have afbrudt gonadale strukturer, men ingen dyr med æg bør overholdes.
- Forberedelse af bakterier til flydende kultur
- Samling af unge og ældre orme udsættes for RNAi i flydende kultur
Bemærk: Alle de følgende trin er for et flydende kultur kolbe men begge kulturer i samme aldersgruppe med kontrol og RNAi bakterier for gen af interesse bør behandles sammen.- Indsamle unge orme på dag 2 eller dag 3 at måle basal niveauer af protein kan. Alderen orme bør indsamles (senest), når halvdelen af befolkningen er død. For at finde ud af, tælles døde og levende orme i flere dråber af flydende kultur placeret på en agar plade. Nøgletal er gennemsnit over mindst ni dråber.
- Forbered de følgende reagenser: 1 L M9, 1 L M9 med 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) og 40 mL 60% saccharose i ddH2O. holde reagenser på is.
- Hæld orme fra en kolbe i en skilletragt og lad orme sediment i 10 min ved stuetemperatur. Åbne hanen og dryppe orme i en 50 mL tube.
- Opdele orm pellet i to 15 mL-rør og centrifugeres ved 1.900 x g i 5 min ved stuetemperatur. At vaske ormene, Fjern supernatanten og fylde op til 15 mL med M9. Gentag centrifugeringen. Endelig overføres ormene til to 50 mL rør og fylde til 20 mL samlede volumen med iskold M9.
- At fjerne bakterier og døde orme, tilføje to 20 mL fortyndet orm pellets til to 50 mL-rør fyldt med 20 mL iskold 60% saccharose. Hurtigt centrifugeres ved 2.700 x g i 5 min. ved stuetemperatur, 9-acceleration og deceleration 7. Fjern forsigtigt den øverste orm lag med en stor pipette (25 mL). Tage op til 15 mL (men mindre, hvis der er selvfølgelig en masse af døde orme). Opstille indeværende direkte i 37 mL M9 + Octoxynol-9 (3 rør pr. saccharose tube) udarbejdet på is. Der centrifugeres ved 2.700 x g i 3 min. ved stuetemperatur, acceleration 9 og deceleration 7.
Bemærk: Begge skal være iskolde; ellers vil adskillelse ikke arbejde. Bland ikke! Fordi saccharose er giftige for orm er det vigtigt at være hurtig for de følgende trin. - Opdele pellet i fire 15 mL-rør og vaskes to gange med iskold M9 + Octoxynol-9: centrifuge på 1.900 x g i 1 minut ved stuetemperatur. Fjern supernatanten, fylde til 15 mL mærket med iskold M9 + Octoxynol-9 og Gentag proceduren.
- Vask en gang med iskold M9 og kombinere de fire rør til to rør. Fyld med M9 ved stuetemperatur til en samlet maengde paa 4 mL i 15 mL-rør og rotere på en nutating mixer ved 25 ° C i 40 min.
Bemærk: Dette hjælper orme til at fordøje eventuelle resterende bakterier i tarmen. Kontrollere orme under mikroskop for at se, at der er ingen døde ones. - Vask orme to gange med iskold M9 + Octoxynol-9, som beskrevet i 1.3.5. Vaskes to gange med M9 og overføre orme til et rør.
- Vaske ormene engang i gensamling (RAB) høj-salt ekstraktionsbuffer uden hæmmere (0,1 M 4-morpholineethanesulfonic syre (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic syre (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl, 0,02 M natriumfluorid (NaF)) før samling. Fjern supernatanten, indtil der ikke er nogen væske oven på orm pellet.
Bemærk: Dette trin og den næste skal gøres hurtigt for at undgå artefakter i worms forårsaget af den høje saltkoncentration i bufferen. - Vurdere mængden af ormen pellet og tilføje en ens volume af RAB med hæmmere (2 x Protease hæmmer Cocktail). Ved hjælp af Pasteurs pipette, udarbejde orme og langsomt dryppe i en 50 mL tube halvt fyldt med flydende kvælstof placeret i tøris. Lad den flydende nitrogen fordamper og gemme de frosne orme ved-80 ° C indtil videre forarbejdning.
Forsigtig: Flydende nitrogen er en ekstremt lav temperatur; bær passende beskyttelse.
2. uopløselige Protein ekstraktion med unge og gamle dyr udsættes for RNAi rettet mod et gen af interesse
-
Afbrydelse af dyr indsamlet i trin 1.3
Bemærk: Det er vigtigt at undgå enhver optøning af ormen prøver. Køle ned mørtel med flydende kvælstof og udfører en komplet på tøris.
Forsigtig: Flydende nitrogen er en ekstremt lav temperatur; bær passende beskyttelse.- Overføre de frosne orme til pre afkølede mørtel og male for 2,5 min.
Bemærk: Vær forsigtig under slibning: i begyndelsen, de frosne orme er i små kugler og det er nemt at tabe dem. - Tilføj flydende kvælstof (ca. 100 mL) til pulver til at køle det ned igen og male til en anden 2,5 min. Tjek med mikroskop at ormen organer er brudt. Overførsel af pulver til 2 mL rør og opbevar dem ved-80 ° C.
- Overføre de frosne orme til pre afkølede mørtel og male for 2,5 min.
-
Hurtig uopløselige protein udvinding for Western blot analyse
Bemærk: Brug denne metode til at sammenligne total protein indhold og uopløselige protein niveauer mellem de forskellige dage med og uden RNAi målretning gen af interesse. Udfør alle trin indtil trin 2.2.3 på is!- Solubilize 50 mg af jorden orme fra trin 2.1 med 150 µL Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS), 0,5% natrium deoxycholate (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF), 1 x Protease hæmmer Cocktail). Homogeniseres suspensionen ved hjælp af en 1 mL sprøjte med grå nål (27 G x ½", 0,4 mm x 13 mm); udarbejde suspension 10 gange.
- Der centrifugeres ved 18.400 x g i 20 min. ved 4 ° C. Indsamle supernatanten.
- Resuspenderes i 100 µL RIPA buffer og centrifugeres ved 18.400 x g i 20 min. ved 4 ° C. Supernatanten, spin om kort tid, og være omhyggelig med at fjerne levn supernatanten.
- For at solubilize de meget tungtopløseligt proteiner, resuspenderes i 75 µL Urea/SDS buffer (8 M urinstof, 2% SDS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- For at analysere de samlede proteinindhold, kombinere den første RIPA supernatanten fra trin 2.2.2 og Urea/SDS pellet ophvirvling. For at tage hensyn til de mængder, der anvendes til ekstraktion, bør den samlede fraktion indeholder to tredjedele af RIPA supernatanten og en tredjedel af urinstof/SDS pellet brøkdel. På en lille 4-12% gradient gel, kontrollere niveauet af uopløselige protein ved at indlæse 9 µL af urinstof/SDS brøkdel og 4 µL totale kombinerede protein. Udføre en total protein skamplet farvning for at overvåge protein niveauer. Ved Western blotting ved hjælp af specifikke antistoffer, kontrollere ændringer i kan for enkelte proteiner kvantificeres ved massespektrometri (Se afsnit 3).
-
Uopløselige protein udvinding at isolere SDS-uopløselige proteiner for massespektrometri
Bemærk: Udføre alle trinene på is.- På tøris gange vejer ud to 350 mg jorden orme pr. tidspunkt og RNAi bakterier (unge og alderen orme, styre RNAi bakterier, og RNAi bakterier for gen af interesse) i 2 mL rør.
- Hvis du vil fjerne de høj-salt opløselige proteiner, skal du tilføje to bind af RAB pr. vægt (700 µL) med hæmmere, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNase jeg, og 100 µg/mL RNase A til hver tube og solubilize pulver på is. Udarbejde suspension i en 1 mL sprøjte (grå nål, 27 G x ½", 0,4 mm x 13 mm) 15 gange og der inkuberes i isbad i 10 min. Centrifuge på 18.400 x g i 20 min. ved 4 ° C. Gå igennem det fedtlag og indsamle supernatanten med høj-salt opløselige proteiner i et 2 mL rør pr. betingelse (fire rør i alt). Fjerner fedt og kassér den. Alikvot høj-salt opløselige proteiner til at fryse ved-80 ° C.
- For at kassere lipider, solubilize pellet med 700 µL RAB med hæmmere indeholdende 1 M saccharose (uden DNase jeg og RNase A). Udarbejde suspension i en sprøjte 10 gange og der inkuberes i isbad i 5 min. Centrifuge på 18.400 x g i 20 min. ved 4 ° C. Vær omhyggelig med at fjerne alle supernatanten og lipider og kassere dem.
- Hvis du vil fjerne SDS-opløselige proteiner, solubilize pellet med 700 µL RIPA buffer. Udarbejde suspension i en sprøjte 10 gange og inkuberes i 10 min. på køl. Der centrifugeres ved 18.400 x g i 20 min. ved 4 ° C. Indsamle supernatanten indeholdende SDS-opløselige proteiner og delprøve til frysning ved-80 ° C.
- Pool to prøver af hver tilstand sammen efter solubilizing hver pellet med 500 µL RIPA buffer. Udarbejdelse af suspension i en sprøjte 10 gange. Der centrifugeres ved 18.400 x g i 20 min. ved 4 ° C. Vær omhyggelig med at fjerne alle supernatanten og kassér den.
Bemærk: Målet med ekstraktionen er at adskille de opløselige proteiner fra de uopløselige proteiner. Derfor er det vigtigt at fjerne alle resterende RIPA supernatanten før du tilføjer myresyre i næste trin. - Solubilize den endelige pellet, der indeholder meget tungtopløseligt proteiner med 400 µL 70% myresyre og udarbejde suspension i en sprøjte 20 gange. Ruger i 20 min. på is. Der centrifugeres ved 50.000 x g i 20 min. ved 4 ° C, acceleration 3 og deceleration 5, til at fjerne ormen neglebånd snavs. Indsamle supernatanten, der indeholder meget tungtopløseligt proteiner og fryse det ved-80 ° C.
- Dialyse af uopløselige protein brøker for massespektrometri
Bemærk: Dialyze ved 4 ° C.- Forberede 8 L dialyse buffer (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, pH 7,5) og dividere det til otte 1 L bægerglas. Sted tre membraner (membranfiltre = 0,025 µM) på buffer overfladen for hver 1 L bæger.
- Per membran, omhyggeligt indlæses 65 µL af uopløselige protein oploeses i myresyre fremstillet i trin 2.3.6. Hver tilstand er fordelt på seks membraner.
- Tjek pH i en prøve at fjerne 5 µL og føje det til en pH strimmel. Hvis pH-værdien er mellem 7 og 8 (ca efter 2 h), indsamle prøven af pipettering forsigtigt op og ned. Endelig, bruge 10 µL dialyse buffer til bundfaldet off hver membran. Fryse prøver ved-80 ° C.
3. omfattende identifikation og kvantificering af ændringer i Protein kan med alderen induceret af RNAi rettet mod et gen af interesse
-
Forberedelse til masse massespektrometri analyse
- Vurdere mængden af uopløselige proteiner i dialyzed prøver ved at indlæse en alikvot på en 4-12% gradient gel og en referenceprøve af kendt koncentration. Udføre en total protein gel farvning og kvantificere protein beløbet med en billede analyse software. Dette trin er nødvendige for at anslå størrelsen af trypsin nødvendige for fordøjelsen (trin 3.1.4).
- Koncentrere prøver ved hjælp af en centrifugal fordamper og solubilize de uopløselige proteiner i en endelig koncentration på 8 M urinstof.
- Alkylering og reduktion
- Tilføj Tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochlorid (TCEP) til en slutkoncentration på 4 mM til prøverne. Inkuber i 1 time på 57 ° C med 300 rpm. Sætte prøverne for stuetemperatur.
- Føje iodoacetamide til en endelig koncentration på 8,4 mM. Inkuber det i 45 min. (kan være inkuberes i 2 h) i mørke ved stuetemperatur.
- Fortynd prøver i 150 mM ammoniumbicarbonat at opnå en slutkoncentration 2 M urinstof.
- Fordøje proteiner med 5% w/w ændrede trypsin natten over ved 37 ° C og 400 rpm.
- Indlæse et udsnit af de fordøjede proteiner på en 12% SDS gel og udføre en total protein gel farvning for at analysere hvis fordøjelsen arbejdede. Hvis der er stadig nogle bands til stede, skal du gentage trin 3.1.4 og 3.1.5.
- Peptider fra unge og alderen kontrol og RNAi behandlet C. elegans er mærket med Isobar tags for relative og absolutte kvantitering efter fabrikantens anvisninger.
Bemærk: Alternativt, andre metoder til mærkning peptider eller proteiner kan bruges til kvantificering som tandem masse tags.
Bemærk: Mass massespektrometri analyse: for at reducere prøve kompleksitet, peptider skal være adskilt af stærk kationbytter kromatografi i forskellige fraktioner til massespektrometri analyse5. Flere massespektrometre er i stand til at analysere Isobar tags for relative og absolutte kvantitering som beskrevet andetsteds17. De fremkomne data skal behandles med passende software. Samlet set denne analyse giver mulighed for identificering af meget tungtopløseligt proteiner og deres ændringer af alder og proteostasis graduering.
4. in Vivo evaluering af et gen af interesse indflydelse på sammenlægning mønster under aldring
- Massespektrometri analysen i afsnit 3, Vælg en aldersbetinget sammenlægning-tilbøjelige protein, der ophobes i forskellige omfang i dyrene udsættes for RNAi. Generere transgene C. elegans linjer at udtrykke dette protein mærket med en fluorescerende proteiner og under kontrol af dens respektive promotor eller en væv-specifikke promotor (Se diskussion for valget af en passende promotor). Vedligeholde stamme ved 15 ° C ved hjælp af standard teknikker på Nematode vækst (NG) plader med OP50. For eksempel, valgte vi en orm stamme udtryk for polyadenylate-bindende protein (PAB-1) på N-terminus til tagRFP under kontrol af svælg muskler promotor af smeltet pmyo-2.
-
In vivo evaluering af ændringer i sammenlægning med alder ved hæmning af gen af interesse
- En til to dage i forvejen, forberede NG/carbenicillin (Carb) / IPTG plader med en kontrol (Tom RNAi vektor L4440) bakterier og RNAi bakterier til at hæmme gen af interesse. (For en detaljeret protokol om RNAi i C. elegans Se JoVE videnskab uddannelse Database. Essentials af biologi 1: gær, Drosophila og C. elegans. RNAi i C. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
- RNAi behandling fra L1, sted æglægning orme på flere adskilte små NG/Carb/IPTG (6 cm diameter) plader frøet med kontrolelementet RNAi eller RNAi bakterier for gen af interesse ved 20 ° C. Fjerne voksne efter 2 h, at holde afkommet ved 20 ° C. For at undgå udviklingsmæssige defekter, kan RNAi behandlinger startes efter L4 larver scenen.
- Når afkom når L4 larver scenen, overføre disse L4s til nye NG/Carb/IPTG plader frøet med kontrolelementet RNAi eller RNAi bakterier for gen af interesse. Oprettet ni plader med 15 transgenics for begge betingelser og holde dem ved 20 ° C. Ormene aldring skal være overført fra deres afkom til nye plader hver anden dag indtil slutningen af deres reproduktive periode for at kunne skelne dem fra deres afkom.
- Evaluere ændringer i fordelingen af sammenlægning-tilbøjelige protein mærket med en fluorescerende tag under en fluorescerende stereo-mikroskop med 24 x forstørrelse i voksenalderen, hver anden dag.
Bemærk: Aldersbetinget ophobning af sammenlægning-tilbøjelige protein i lyse puncta er brugt som en læse-out til sammenlægning. Disse puncta bør være meget immobile strukturer at blive karakteriseret som aggregater. Dette bør afgøres af fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) ved hjælp af Konfokal mikroskopi. For aggregerede protein bemærkes ingen opsving i regionen bleget efter mindst 4 min.5,18. For at kvantificere ændringer med alderen, vi scorede distribution mønstre i de alder-synkroniseret orme overekspression PAB-1 på dag 2, dag 5, og 7 i voksenalderen som følgende: lav aggregeringsniveauer (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta i posterior svælg pære), medium aggregeringsniveauer (mere end 10 puncta i den posteriore svælg pære) og høj aggregeringsniveauer (mere end 10 puncta i den forreste svælg pære).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte de metoder, der præsenteres her til at vurdere hvordan langlivede dyr med reduceret IIS modulere aldersbetinget protein sammenlægning. Af Western duppes (Se trin 2.2, rask uopløselige protein udvinding for Western blot analyse), vi analyseret samlet og uopløselige proteinindholdet i young (dag 3 i voksenalderen) og alderen (dag 18 i voksenalderen) orme på kontrol RNAi og RNAi målretning insulin / IGF-1-lignende receptor daf-2. Vi observerede ingen store ændringer i total protein niveauer med alderen eller mellem kontrol og daf-2 RNAi betingelser (figur 2A). Som forventet, fundet vi en stærk aldersrelateret stigning i niveauet af stærkt uopløseligt proteiner i kontroldyr (figur 2B). I sammenligning med langlivede dyr på daf-2 RNAi, blev sammenlægning tilbøjelighed stærkt reduceret. Hele protein farvning af uopløselige uddrag afslørede en mindre komplekst protein band mønster i uddrag fra 18 dage gamle orme på daf-2 RNAi i forhold til alder-matchede kontrol. Kvantitativ massespektrometri analyse viste, at langlivede dyr med reduceret IIS har samlet mindre alder-associerede protein sammenlægning og vigtigere, daf-2 hæmning helt ophævet aldersbetinget kan af en bestemt delmængde af proteiner7. Opfølgning på disse resultater fokuserede vi på en af disse udsat for sammenlægning proteiner, PAB-1. PAB-1 er et RNA-bindende protein med en forventet "prion-lignende" domæne. Antistoffarvning bekræftet, at langlivede dyr opretholdes PAB-1 opløselige med alderen (figur 2C).
I vivo analyse af PAB-1 sammenlægning producerede vi transgene dyr at udtrykke tagRFP::PAB-1 i svælg muskler. I unge dyr, tagRFP::PAB-1 var hovedsagelig diffust placeret overalt i svælget (fig. 3A, "lav" sammenlægning niveau), men med alderen, vi observeret en gradvis ophobning i lyse puncta starter i den posteriore svælg pære ( Figur 3A, "mellemliggende" sammenlægning niveau). Under aldring bemærkede vi også sammenlægning i den forreste svælg pære (fig. 3A, "høj" sammenlægning niveau) i et stigende antal dyr. Ved gruppering af dyr i disse forskellige kategorier scorede vi sats af PAB-1 sammenlægning i en befolkning. På dag 2 i voksenalderen de fleste af orme (88%) havde ingen eller meget få puncta og ingen dyr med høj aggregeringsniveauer blev ikke fundet. Allerede på dag 5 præsenterede 19% af befolkningen viste mellemliggende og 16% høj sammenlægning niveauer, mens på dag 7 mere end 70% af orme mellemliggende og høj aggregeringsniveauer. At analysere effekten af levetiden på aldersbetinget sammenlægning af tagRFP:PAB-1, vi genereret transgene tagRFP::PAB-1 orme med en daf-2 mutation. Disse dyr viste signifikant reduceret tagRFP:PAB-1 puncta dannelse med aldrende, med mindre end 15% af befolkningen udstiller mellemliggende og høj aggregeringsniveauer selv på dag 7 (fig. 3B).
Ved hjælp af de forskellige tilgange, der beskrives her, afslørede vi at reduceret IIS forhindrer aldersbetinget protein sammenlægning i forskellige udvidelser og langlivede dyr er især effektiv i genskabe dynamikken i PAB-17.
Figur 1 : Skematisk af arbejdsprocessen til at studere ændringer i iboende protein sammenlægning med alder i C. elegans. Vigtigste skridt er fed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Protein kan øges med alderen i kontroldyr, men ikke hos dyr med reduceret daf-2 signalering. (A) Total protein farvning af samlede fraktion fra dag 3 og dag 18 gon-2(-) mutanter underkastes kontrol og daf-2 RNAi (vokset ved 25 ° C). (B) samlede protein farvning af SDS-uopløselige fraktion fra dag 3 og dag 18 gon-2(-) mutanter underkastes kontrol og daf-2 RNAi (vokset ved 25 ° C). Panelet genudgives fra reference7. (C) immunblot påvisning PAB-1 i SDS-uopløselige brøkdel, relevante protein bands angivet med rød pil. Panelet genudgives fra reference7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Reduceret daf-2 signalering forhindrer ophobning af tagRFP::PAB-1 puncta med alder. (A) repræsentative billeder af orme med tagRFP::PAB-1 overekspression i svælg musklerne (høj forstørrelse microscope, tagRFP registrering af indstillinger: excitation 558 nm, emission 583 nm). Dyr med lavt (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta i posterior svælg pære), mellemliggende (mere end 10 puncta i den posteriore svælg pære), eller høj aggregeringsniveauer (mere end 10 puncta i den forreste svælg pære) er vist. Skalalinjen = 20 µm. (B) kvantificering af forskellige tagRFP::PAB-1 sammenlægning niveauer med alderen i vildtype og daf-2 mutant baggrunden afslører stærkt forsinket tagRFP::PAB-1 sammenlægning med alderen i langlivede dyr. Dag 2, dag 5 og dag 7 daf-2(-) versus vildtype baggrund, lav i forhold til mellemliggende og høj aggregeringsniveauer: Fisher eksakt test, ***p < 0,0001. Panelet genudgives fra reference7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stamopløsningen | Beløb | Endelig koncentration | Bemærkninger/beskrivelse |
| Flydende kultur, samlede volumen 300 mL | |||
| S basal (For 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M kalium fosfat pH 6) | 200 mL | 1 M kalium fosfat pH 6: For 1 L: 129 g KH2PO4 monobasic, 52 g K2HPO4 dibasiske vandfri | |
| 1 M kalium citrat pH 6 (For 400 mL: 13,1 g citronsyre monohydrat, 134.4 g tri-kalium citrat monohydrat) | 3 mL | 10 mM | |
| Trace metaller løsning (For 1 L: 1,86 g ethylendiamintetra syre (EDTA), 0.69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g frihedsbevægelse2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O) | 3 mL | Gemme stamopløsning i mørke ved 4 ° C | |
| 1 M MgSO4 (For 500 mL: 123.3 g) | 900 ΜL | 3 mM | |
| 1 M CaCl2 (For 500 mL: 73,5 g) | 900 ΜL | 3 mM | |
| 200 µg/mL Carbendazim (50 mL: 10 mg i Methanol) | 150 ΜL | 100 ng/mL | |
| 5 mg/mL kolesterol (For 100 mL: 0,5 g i Ethanol) | 300 ΜL | 5 µg/mL | |
| Remontering (RAB) høj-salt ekstraktionsbuffer, 30 mL | |||
| 1 M 4-Morpholineethanesulfonic syre (MES) | 3 mL | 100 mM | RAB stock buffer komponent |
| 0,5 M Ethyleneglycoltetraacetic syre (EGTA) | 60 ΜL | 1 mM | RAB stock buffer komponent |
| 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) | 6 ΜL | 0,1 mM | RAB stock buffer komponent |
| 1 M MgSO4 | 15 ΜL | 0,5 mM | RAB stock buffer komponent |
| 5 M NaCl | 4.5 mL | 750 mM | RAB stock buffer komponent |
| 1 M natriumfluorid (NaF) | 600 ΜL | 20 mM | RAB stock buffer komponent |
| Til 30 mL samlede med ddH2O | |||
| 50 x Protease hæmmer Cocktail | * | 2 x | * Tilføje reagenser efter at tage mængden af RAB stock buffer, der er behov for (for udvinding for massespektrometri 6 mL). |
| 100 mM Phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) i isopropanol,-20 ° C | * | 1 mM | |
| 10 U/µL DNaseI | * | 200 U/mL | |
| 4 mg/mL RNaseA | * | 100 µg/mL | |
| RAB med 1 M saccharose, 30 mL | |||
| 2 M saccharose (For 50 mL: 34,2 g) | 15 mL | 1 M | Tilføje RAB buffer reagenser ud over DNaseI og RNaseA |
| Radioimmunoprecipitation og (RIPA) analysebuffer, 30 mL | |||
| 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 8 | 1,5 mL | 50 mM | RIPA stock buffer komponent |
| 5 M NaCl | 0.9 mL | 150 mM | RIPA stock buffer komponent |
| 0,5 M EDTA | 0,3 mL | 5 mM | RIPA stock buffer komponent |
| 10% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) | 1,5 mL | 0,50% | RIPA stock buffer komponent |
| 10% natrium deoxycholate (SDO) | 1,5 mL | 0,50% | RIPA stock buffer komponent |
| Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) | 0,3 mL | 1% | RIPA stock buffer komponent |
| Til 30 mL samlede med ddH2O | |||
| 100 mM PMSF | * | 1 mM | * Tilføje reagenser efter at tage mængden af RIPA stock buffer, der er behov for (for udvinding for massespektrometri 10 mL). |
| 50 x Protease hæmmer Cocktail | * | 1 x | |
| Urea/SDS buffer, 10 mL | |||
| Urinstof | 4.8 g | 8 M | |
| 10% SDS | 2 mL | 2% | |
| Dithiothreitol (DTT) | 77 mg | 50 mM | |
| 1 M Tris pH 8 | 0,5 mL | 50 mM | |
| Til 10 mL samlede med ddH2O | |||
| Dialyse buffer, 1 L | |||
| Tris | 6 g | 50 mM | |
| DTT | 154 mg | 1 mM | |
| 100 mM PMSF | 1 mL | 0,1 mM | |
| Justeres til pH 7,5 og komplet til 1 L total med ddH2O | |||
Tabel 1: Buffere for flydende kultur, uopløselige protein udvinding og dialyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporterer vi en metode til at isolere meget uopløseligt protein aggregater fra aging C. elegans udsat for RNAi for analyse af massespektrometri og Western blotting. Vi viser, at forbedre proteostasis ved at reducere IIS høj grad forhindrer aldersbetinget protein sammenlægning. Ved at vælge specifikke sammenlægning-tilbøjelige proteiner til overexpress i C. elegans, er det muligt at dissekere yderligere mekanismer modulerende iboende protein sammenlægning.
Iboende aldersbetinget Protein sammenlægning Versus sygdom-forbundet Protein sammenlægning
Denne nuværende arbejde er baseret på de tidligere resultater, at protein sammenlægning ikke er begrænset til specifikke proteiner sammenlægning i forbindelse med sygdom. Ved at fokusere på endogene sammenlægning-tilbøjelige proteiner i stedet for ectopically udtrykt sygdom-associerede proteiner, forventes at give ny indsigt i fysiologiske regulering af sammenlægning proces. Aldersbetinget protein aggregater er fundet i forskellige cellulære steder5, bør deres undersøgelse også give indsigt i rum specifikke kvalitetskontrol mekanismer. Samlet set kunne de mekanismer, der styrer iboende protein sammenlægning også være relevant at forebygge sygdom protein sammenlægning. Af note, selvom aldersbetinget protein sammenlægning ligner i flere aspekter sygdom protein sammenlægning, uklart det stadig, om disse aggregater indeholde amyloid fibriller, karakteristisk for mange sygdom aggregater.
Valg af C. Elegans Model: fordele og begrænsninger
I forhold til et pattedyr model, er en af de største fordele ved at bruge C. elegans for at studere et aldersrelaterede kendetegn dens meget kort levetid. Flere hundrede proteiner blevet konsekvent meget-sammenlægning-udsat under aldring og denne store stigning i kan detekteres nemt selv med en forenklet biokemiske udvinding. En stor begrænsning af brug af C. elegans for at studere aldersbetinget protein sammenlægning er imidlertid behovet for at isolere stort antal ældre dyr. Som C. elegans er hermafroditter og producere ca 220 eller flere afkom i løbet af deres reproduktive fase19, er det vigtigt at forebygge reproduktion eller fjerne afkom for at alder en befolkning. Flere valgmuligheder er tilgængelige til at fremkalde sterilitet: en mulighed er at bruge den kemiske fluorodeoxyuridine (FUdR), en hæmmer af DNA syntese. Men FUdR fører til talrige bivirkninger herunder ændringer i proteostasis og reduceret protein sammenlægning20,21,22. Vigtigere, inducerer FUdR genotype-specifikke svar23. En anden mulighed er at bruge temperatur-følsomme sterile mutanter. For eksempel, har spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), og gon-2(q388) været brugt tidligere til massespektrometri analyser i den alder afhængige samle proteom5, 8.
Der er endnu flere begrænsninger forbundet med at bruge disse mutanter. Først, som sterilitet er temperatur afhængige, er det nødvendigt at vokse dyr ved 25 ° C, som udgør en mild stress og fremskynder aldring samt protein sammenlægning. Omvendt, vi har observeret at gon-2, glp-1 og Five-1 mutanter er teknologiinvesteringer sammenlignet med vildtype når vedligeholdes ved 25 ° C (data ikke vist). For det andet, der er særlige begrænsninger i forbindelse med hver type af reproduktive defekt. En ulempe ved at bruge sæd-defekt mutanter er produktionen af ubefrugtede oocyter (også produceret i alderen vildtype hermafroditter). Kvaliteten af disse oocyter falder stærkt med alderen og de ophobes i gonade24,25. Kvantitativ massespektrometri analyse viser, at sæd-defekt mutanter har flere fold højere niveauer af uopløselige proteiner akkumuleres med alderen sammenlignet med gonade-mindre eller germline-mangelfuld mutanter. Dette angiver protein misfoldning og sammenlægning beliggende i gonade5, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser12,13 og i vivo forsøg afslørende aggregerede proteiner beliggende i den unormale oocyt klynger5. Derfor ville overdreven protein sammenlægning i gonade maske mere subtile ændringer i protein sammenlægning i de somatiske væv. Dette bør også overvejes, når man sammenligner interventioner, der handle til forskellige udvidelser på reproduktive og somatiske væv proteostasis. Derfor, for at vurdere kun somatiske protein sammenlægning, vi favoriserer bruger gonade-mindre gon-2 mutanter. Et alternativ ville være at bruge genom-mangelfuld glp-1 mutanter. Men vi konstatere, at disse dyr har mindre iboende protein sammenlægning med alderen sammenlignet med gon-2 mutanter5. Dette er sandsynligvis en følge af forbedret proteostasis i somatiske væv på grund af signaler fra den germline-defekt gonade26,27,28. Et andet alternativ er at bruge wild-type dyr og fjerne afkom hver dag af sedimentation. Dette er dog problematisk på grund af vanskeligheden ved helt at fjerne alle afkom.
En anden generel begrænsning af brug af C. elegans er dens lille størrelse, hvilket gør specifikke væv ekstraktioner udfordrende. Da sådanne hele dyr ekstraktioner ikke giver relevante oplysninger relateret til hvordan forskellige betingelser modulere protein sammenlægning i bestemte væv. Af note, kunne dette spørgsmål potentielt være omgået ved hjælp af en nyligt udviklede metode baseret på fluorescens-aktiveret celle sortering til at isolere bestemte celler fra C. elegans29. Endnu er det stadig skal fastlægges, om denne metode ville være passende at få tilstrækkeligt materiale til uopløselige protein udvinding og om det ville være relevant at alderen dyr. Alternativt, væv specifikke protein sammenlægning og dets forordning kan blive undersøgt af yderligere i vivo eksperimenter. Som transgene dyr at udtrykke en fluorescently mærket sammenlægning-tilbøjelige protein valg kan hurtigt oprettes, og som dyrene er gennemsigtige, er det relativt nem at undersøge protein sammenlægning i situ.
Samlet set er det vigtigt at følge op på proteom resultaterne med i vivo eksperimenter i wild-type baggrund. Kombinationen af en biokemiske og mikroskopi-baserede karakterisering muliggør en omfattende undersøgelse af protein sammenlægning og en vurdering af rollen af gener af interesse. Sidstnævnte er lettet i C. elegans af RNAi medieret gennem fodring og tilgængelighed af hele genom RNAi biblioteker. Desuden findes et stort antal karakteriseret mutanter at bekræfte resultaterne af RNAi eller bruge i stedet for RNAi.
Flydende kultur og biokemiske udvinding: fordele og begrænsninger
Som stærkt aggregerede proteiner udgør kun en lille brøkdel af total protein, er det nødvendigt at starte udvinding med et stort antal dyr. Med store mængder af uopløselige proteiner er det så muligt at udføre omfattende peptid fraktionering for at reducere prøve kompleksiteten for massespektrometri og dermed forbedre identifikation af lavere rigelige proteiner. Hvis der kun små mængder af uopløselige proteiner er nødvendige, er et alternativ at vokse orme på plader og homogeniseres dem med keramiske perler. En af ulemperne ved flydende kultur er at hele kulturen i tilfælde af en forurening, er ramt og skal kasseres. Generelt, C. elegans aldring er stærkt påvirket af temperaturen, og denne parameter skal styres stramt i den flydende kultur at undgå variationer i aldersbetinget protein sammenlægning. Temperaturkontrol er også afgørende for at opnå en homogen population af gonade-mindre dyr, når du bruger gon-2(-) mutanter.
Afhængig af målet med undersøgelsen er det vigtigt at overveje forskellige udvindingsmetoder. Biokemiske udvinding præsenteres her var oprindeligt tilpasset fra protokoller at isolere sygdom-associerede aggregater11,30,31. Vi valgte relativt høje koncentrationer af vaske-og rengøringsmidler som 0,5% SDS at isolere mere uopløselige aggregater. Også af pelleringsmidler 0,5% SDS uopløselige aggregater med lav centrifugal hastigheder, vil denne protokol kun isolere de større aggregater. Alternativt, en lempeligere protokol blev for nylig offentliggjort10. I denne undersøgelse, var mere opløselige og mindre aggregater også udvindes ved at udelade SDS og ved hjælp af meget høj centrifugal hastigheder på 500.000 x g. En sammenligning af de forskellige protokoller viser en generel stigning i antallet af proteiner i samle proteomet ved hjælp af mindre strenge protokol7. Vi bemærker, at langlivede dyr med reduceret daf-2 signalering effektivt forhindrede ophobning af SDS-opløselige og SDS-uopløselige aggregater i gonade-mindre dyr7.
In Vivo Analyse af aldersbetinget Protein sammenlægning
Ved beregningen af transgene modeller for følgende aldersbetinget protein sammenlægning, er det relevant at overveje i hvilken væv til overexpress aggregation-tilbøjelige protein af interesse og på hvilke udtryk niveauer. Vi favoriserer udtryk i væv beliggende i regionen hoved at undgå interferens med autofluorescence, som er fremtrædende i aging tarmen. For at visualisere fluorescerende-mærket aggregater med lav forstørrelse, bør den sammenlægning-tilbøjelige protein udtrykkes på et relativt højt niveau. På den anden side vil for høj udtryk medføre den sammenlægning-tilbøjelige protein til form aggregater allerede i unge dyr.
Taget sammen, vil disse metoder hjælpe os med at forstå, hvorfor en del af proteomet aggregater med alderen og i sidste ende føre til udvikling af strategier for fremme af sund aldring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra DZNE og en Marie Curie International reintegrationsstipendium (322120 til D.C.D.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
