Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i Caenorhabditis elegans

Published: November 26, 2017 doi: 10.3791/56464
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1
1Protein Aggregation and Aging, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Graduate School of Cellular and Molecular Neuroscience, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

Summary

Målet med metoden som presenteres her er å utforske protein aggregering under normal aldring i modellen organismen C. elegans. Protokollen representerer et kraftig verktøy til å studere de svært uløselig store aggregatene som danner med alderen og bestemme hvordan endringer i proteostasis påvirker protein aggregering.

Abstract

I de siste tiårene, har utbredelsen av nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD) og Parkinsons sykdom (PD), vokst. Disse alder-tilknyttede lidelser er preget av utseendet på protein aggregat med fibrillary strukturen i hjernen til disse pasientene. Nøyaktig hvorfor vanligvis løselige proteiner gjennomgå fortsatt en samling prosessen dårlig forstått. Oppdagelsen at protein samling er ikke begrenset til sykdom prosesser og en del av normal aldringsprosessen kan stedet studere molekylære og cellulære mekanismer som regulerer protein aggregering, uten å bruke ectopically uttrykt menneskelige sykdomsassosierte proteiner. Her beskriver vi metoder for å undersøke iboende protein samling i Caenorhabditis elegans gjennom supplerende tiltak. Først vi undersøker hvordan å vokse stort antall alder-synkroniserte C. elegans hente alderen dyr og presenterer vi de biokjemiske fremgangsmåtene for å isolere svært uløselig-store mengder. I kombinasjon med en målrettet genetisk knockdown, er det mulig å dissekere rollen en genet av interesse i å fremme eller forebygge alder-avhengige proteiner aggregering ved hjelp av enten en omfattende analyse med kvantitative massespektrometri eller kandidat-basert analyse med antistoffer. Disse funnene er deretter bekreftet av i vivo analyse med transgene dyr uttrykke fluorescerende-merket samling utsatt proteiner. Disse metodene bør klargjøre hvorfor visse proteiner er utsatt for samlet med alder og til slutt hvordan beholde disse proteinene funksjonell.

Introduction

Protein misfolding og aggregering gjenkjennes som et kjennetegn på flere nevrodegenerative sykdommer som Annonsen, PD, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal-demens (FTD) og mange andre. For eksempel α-synuclein samlinger i amyloid fibrils som akkumuleres som Lewy-legemer i substantia nigra PD pasienter, mens i ALS pasienter TDP-43 eller Fu misfold til skjemaet cytoplasmatiske aggregat i degenereres motor neurons. I hver av disse nevrodegenerative lidelser mislykkes mekanismer opprettholde protein homeostase eller proteostasis å hindre akkumulering av misfolded proteiner, derfor fører til sykdom.

Proteostasis er avgjørende for å sikre cellulære funksjoner under normale forhold disse regulatoriske mekanismene kontroll tett frekvensen av proteinsyntese, bretting og fornedrelse. Flere studier viser at med aldring, evne til mange cellene og organene å bevare protein homeostase settes gradvis og fysiologiske forverring av proteostasis nettverk med alderen er en viktig skjerpende faktor for nevrodegenerative sykdommer (omtalt i referanser1,2,3). Det faktum at protein kvalitetskontroll og cellulær respons på brettet protein stress er utsatt med alderen antyder at protein misfolding og aggregering kan være en generell konsekvens av aldring. Faktisk har vi og andre vist at protein samling er ikke begrenset til sykdom og i stedet en del av proteom blir svært vaskemiddel-uløselig i alderen dyr4,5,6,7 ,8,9,10. Beregningsorientert og i vivo analyse viste at disse fysiologiske aldersrelatert aggregater ligner sykdom mengdefunksjoner i flere aspekter5. Oppdagelsen av endogen, alder avhengig av protein aggregering gir oss muligheten til å analysere molekylære og cellulære mekanismer som regulerer protein aggregering, uten å bruke ectopically uttrykt menneskelige sykdomsassosierte proteiner. I dag finnes begrenset informasjon om regulering av utbredt protein insolubility og effekten av denne feilregulering på helsen til organismen.

Rundormer C. elegans er en av de mest omfattende studerte modell organismene i aldring forskning som disse dyrene har en relativt korte levetid og viser mange karakteristiske aldring funksjoner i høyere organismer. Effektene av aldring på protein insolubility har vært studert i C. elegans av sekvensiell biokjemiske fraksjoneres basert på differensial løselighet, som er mye brukt til å trekke ut sykdom aggregater innen neurodegeneration forskning11 . Ved kvantitative massespektrometri, ble mange hundre proteiner vist å bli aggregering utsatt i C. elegans i fravær av sykdom5. Her beskrive vi i detalj protokollen for å vokse stort antall ormer i flytende kultur og sekvensiell utvinning isolere aggregert proteiner for kvantifisering av massespektrometri og analyse ved Western blot. Fordi misfolded og aggregering utsatt proteiner akkumuleres i alderen C. elegans gonader og masker endringer i andre somatiske vev5,12,13, vi bruker en gonad-mindre mutant fokusere analyse på protein insolubility i ikke-reproduktiv vev. Metoden presentert kan analyse av svært-uløselig, stor Sammendrag som er uløselig i 0,5% SDS og pelleted ved relativt lav sentrifugal hastighet. Alternativt en mindre strenge utvinning protokoll samle også mindre og mer løselig aggregater har vært publisert andre steder,10. I tillegg beskriver vi metoden brukes til å vurdere aggregering i vivo i C. elegans.

Samlet kan disse metodene sammen med RNA-interferens (RNAi) vurdere rollen en genet av interesse modulerende alder-avhengige proteiner aggregering. For dette beskrive vi analyse av ekstrakter fra ung og gammel ormer med og uten knockdown av et bestemt protein rundt ved hjelp av RNAi. Disse metodene bør være et kraftig verktøy for å finne ut hvilke komponenter av proteostasis nettverket regulere protein insolubility. Flere tiltak som redusert insulin/insulin-lignende vekstfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har vist seg å forsinke dramatisk C. elegans aldring14. Levetid veier indusere ofte protein kvalitet kontrollmekanismer og dermed disse veiene kan være aktivt påvirke hastigheten av protein aggregering. Som et eksempel viser vi redusert iboende protein samling i varige dyr på hemming av IIS veien7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: For en bedre forståelse av prosedyren, en skjematisk av arbeidsflyten (figur 1) er festet.

1. vekst av store tall for unge og eldre C. elegans utsatt RNAi mot et genet av interesse

Merk: Bruk C. elegans temperatur-indusert sterilt gon-2(q388) mutanter (CF2253) å få alderen-synkroniserte folkerike. I alle trinnene er det viktig å arbeide under semi sterile forhold med åpen flamme og kontroller at det finnes ingen forurensing (for eksempel med sopp eller bakterier). Utfør trinnene (også centrifugations) ved romtemperatur hvis temperaturen ikke er beskrevet.

  1. Utarbeidelse av C. elegans gon-2(-) mutanter hente gonad-mindre dyr
    Merk: For å få sterilt dyr mangler gonader, tap av funksjon mutasjonen må bli indusert i overordnede dyrene ved å flytte disse på siste larvestadiet (L4) 25 ° c for å unngå mors bidrag.
    1. Første utvidelsen av gon-2(-) dyr å samle foreldre generasjon for temperatur skift
      1. Strek Escherichia coli OP50 belastning på en Lysogeny kjøttkraft (LB) plate og ruge det overnatting på 37 ° C.
      2. Neste dag vaksinere 200 mL LB medium med en OP50 klone og Inkuber det overnatting på 37 ° C.
      3. De neste dagen frø 15 høy vekst (HG) medium platene (diameter 9 cm) med 0,5 mL OP50 og distribuere OP50 med en slikkepott. Holde platene ved romtemperatur for to dager.
      4. Blings gon-2(-) dyr (ikke sultet for de siste to generasjonene) på 15 HG middels plater plantet med OP50 og opprettholde dem ved 20 ° C til platene er confluent med voksne og noen OP50 er fremdeles tilgjengelig.
      5. I mellomtiden frø 60 HG medium plater med OP50 som beskrevet i trinn 1.1.1.3 og holde platene ved romtemperatur. Forsiktig: Seeded platene ikke vare mer enn en uke som agar vil sprekke ved romtemperatur.
      6. Bleach confluent platene når de fleste voksne begynner å legge egg som beskrevet tidligere15. Samle egg i to 15 mL-rør og plasser på en nutating mikser overnatting på 20 ° C.
      7. Neste dag vask klekket L1s med M9 buffer (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): sentrifuge 3000 x g for 30 s, kast nedbryting og fyll opp til 15 mL merket med M9. Sentrifuge, forkaste nedbryting og gjenta trinnet 1.1.1.6. Fyll rør med resulterende ormen pellets opp til 15 mL merket med M9.
      8. Evaluere totalt antall L1s med disseksjon mikroskop ved å telle L1s i 2 µL dråper plassert på ikke-seeded agar plater. Gjennomsnittlig tallene fra minst ni dråpene.
      9. Legge til 6500 L1s per seeded HG plate og la ormer vokse ved 20 ° C til L4 scenen.
    2. Andre utvidelsen av gon-2(-) dyr å få gonad-mindre dyr for eksperimentet
      1. På L4 stadiet, skifte ormer fra trinn 1.1.1.9 til 25 ° C før de begynner å legge egg og L1s er klekking.
      2. Samling av egg og L1s av sedimentering
        Merk: Etter temperatur skiftet til 25 ° C er det best å bruke sedimentering som en mild teknikk for å skille skjøre egg og L1s fra voksne.
        1. Vask platene med M9 ved hjelp av 5 mL M9 per fem platene. Overføre ormer til 50 mL rør.
        2. Fylle opp alle rør til 45 mL merke med M9, la voksne sediment for ca 10 min, samle hver nedbryting i en 50 mL tube, og gjenta dette med pellet. Sentrifuge nedbryting som inneholder egg og L1s på 3000 x g for 1 min, la L1s sediment for ca 10 min og fjerne nedbryting gjenstår 15 mL.
          Merk: Dette er et viktig skritt. Ikke Fjern nedbryting for tidlig, for å samle så mange L1s som mulig.
        3. Plassere rør som inneholder egg og L1s på en nutating mikser overnatting på 25 ° C.
  2. Flytende kultur, gonad-mindre dyr å samle unge og eldre dyr utsatt for RNAi målretting en genet av interesse
    Merk: Svaret på noen gener RNAi kan være temperatur avhengig som beskrevet tidligere16. Som et alternativ til RNAi, kan en muterte genet innlemmes i gon-2(-) bakgrunnen.
    1. Utarbeidelse av bakterier for flytende kultur
      1. Klargjør OP50 og RNAi bakterier (bakterier produserer ønsket dsRNA og bakterier med Tom vektoren som kontroll) ved å vaksinere 4 L LB medium med 12 mL av respektive bakteriell kultur (legge til en siste konsentrasjon av 50 µg/mL carbenicillin og 1 mM IPTG til RNAi bakteriekulturer) og Inkuber dem på 37 ° C over natten på 180 rpm.
      2. Neste dag høste kulturer 6700 x g i 10 min på 4 ° C. Fjerne supernatants og resuspend hver pellet i 60 mL iskald S basale media (100 mM NaCl, 50 mM kalium fosfat pH 6, holdt på is). Holde tre resuspended pellets (OP50, RNAi bakterier, og RNAi bakterier for genet av interesse) på 4 ° C til trinn 1.2.2 eller 1.2.3.
        Merk: Ormer kan dyrkes på RNAi L1 scenen (se trinn 1.2.3) eller å unngå utviklingsmessige mangler fra siste larvestadiet L4 (se trinn 1.2.2).
    2. Flytende kultur for behandling med RNAi starter endelig larvestadiet L4
      1. Legge til 200 mL S basale medier i en Fernbach kultur kolbe (kapasitet 2800 mL). For et siste kultur volum 300 ml (se 1.2.2.4), legger 10 mM kalium citrate, pH 6, 3 mL spor metaller løsning (5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 2,5 FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2100 ng/mL carbendazim og 5 µg/mL kolesterol). Lukk flasken skrukork membran. Se tabell 1 for oppskrifter på buffere.
      2. Ta L1s av 25 ° C (trinn 1.1.2.2.3) og overføre dem til 15 mL rør. Sentrifuge på 1900 x g for 3 min, fjerne nedbryting og telle L1s per 2 µL som i trinn 1.1.1.8. Legge til 500.000 L1s i Fernbach kultur flasken i forrige trinn.
      3. Legg til OP50 (fra trinn 1.2.1) proporsjonalt antall ormer. For eksempel for 500.000 ormer legge 60 mL OP50.
      4. Komplett ormen kultur med S basale å bringe det totale volumet til 300 mL. Inkuber ormen kulturen til L4 scenen ved 25 ° C i en risting inkubator med 150 rpm.
      5. Neste dag, skal ormer størrelsen på vill-type L4s. For å endre fra OP50 å RNAi bakterier, samle dyr i seks 50 mL-rør, la dem sedimenter og fjerne nedbryting. Vask L4s med M9 fjerne gjenværende OP50 bakterier: sentrifuge på 1900 x g for 3 min, fjerne nedbryting og overføre alle L4s til en 50 mL-rør. Telle L4s per 5 µL (minst ni ganger). To ganger 50.000 L4s kreves for samlingen unge orm og to ganger 100.000 L4s kreves for samlingen alderen ormen.
      6. Forberede fire Fernbach kultur flasker som beskrevet i 1.2.2.1. Legg også en endelige konsentrasjon av 50 µg/mL Carbenicillin og 1 mM IPTG til hver kolbe.
      7. Legge kontrollen RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet av interesse (fra trinn 1.2.1) proporsjonalt antall ormer: legge til 7 mL av respektive bakterier per kolbe for unge ormer og 14 mL per kolbe for alderen ormer.
      8. Legg 50.000 ormer per kolbe for unge ormen innsamling og 100.000 ormer per kolbe for alderen ormen samlingen, og fullføre kulturer s basale å fylle opp til 300 mL. Inkuber ormen kulturer (fire totalt) på 25 ° C og 150 rpm.
    3. Flytende kultur for behandling med RNAi fra L1 scenen
      1. Forberede fire Fernbach kultur flasker som beskrevet i 1.2.2.1 og legge til en siste konsentrasjon av 50 µg/mL carbenicillin og 1 mM IPTG.
      2. Fortsett med utarbeidelse av L1s som beskrevet i 1.2.2.2. Totalt er 300.000 ormer nødvendig å dividere seg i fire flasker.
      3. Legge kontrollen RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet av interesse (fra trinn 1.2.1) proporsjonal med antall ormer som beskrevet i trinn 1.2.2.7 og vurdere også vekstfase mellom L1 og L4 scenen: legge til 13 mL av respektive bakterier per kolbe for unge w Orms og 26 mL per kolbe for alderen ormer.
      4. Fortsett som beskrevet i trinn 1.2.2.8.
    4. Vedlikehold av C. elegans flytende kulturer
      1. Innhente en aliquot fra hver flytende kultur og sted på et glass lysbilde (alternativt på en agar plate) til å kontrollere at det er ingen forurensing. Bruk disseksjon mikroskop kontrollere bakteriell mat nivåene i kulturen spesielt under vekstfase. Forberede seg på forhånd 2 L kulturer kontroll RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet av interesse som beskrevet i trinn 1.2.1. Legg disse til C. elegans flytende kulturer hvis nødvendig og holde resten på 4 ° C.
      2. Periodisk sjekk at dyrene er sterilt. Fleste dyr trenger ikke et gonad. Avhengig av penetrance av gon-2 mutasjon, noen kanskje har avbrutt gonadal strukturer, men ingen dyr med egg observeres.
  3. Samling av unge og eldre utsatt for RNAi i flytende kultur
    Merk: Alle trinnene nedenfor gjelder for en flytende kultur kolbe men begge kulturer på samme alder med kontroll og RNAi bakterier for genet av interesse bør behandles sammen.
    1. Innhente unge ormer i 2 eller 3 for å måle basale nivåer av protein insolubility dager. Alderen ormer skal samlet (til siste) når halvparten av befolkningen har dødd. For å fastslå dette, telles døde og levende i flere dråper flytende kultur på en agar plate. Prosenter beregnes gjennomsnitt over minst ni dråpene.
    2. Klargjør følgende reagenser: 1 L M9, 1 L M9 med 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) og 40 mL 60% sukrose i ddH2O. holde reagensene på is.
    3. Hell ormer fra en flasken i en separasjon trakt og la ormer sediment i 10 min ved romtemperatur. Åpne stopcock og dryppe ormer i en 50 mL tube.
    4. Delt ormen pellet i to 15 mL-rør og sentrifuge på 1900 x g i 5 minutter ved romtemperatur. For å vaske ormer, Fjern nedbryting og fylle opp til 15 mL med M9. Gjenta sentrifugering. Til slutt overføre ormer til to 50 mL rør og fylle opp til 20 mL totale volumet med iskald M9.
    5. Fjerne bakterier og død ormer, legge to 20 mL utvannet ormen pellets til to 50 mL-rør fylt med 20 mL iskald 60% sukrose. Raskt sentrifuge 2700 x g i 5 minutter ved romtemperatur, 9-akselerasjon og deselerasjon 7. Fjern forsiktig topp ormen laget med en stor Pipetter (25 mL). Ta opptil 15 mL (men mindre hvis det er åpenbart mye død ormer). Sette dette direkte i 37 mL av M9 + Octoxynol-9 (3 rør per sukrose tube) forberedt på is. Sentrifuge 2700 x g for 3 min i romtemperatur, akselerasjon 9 og retardasjon 7.
      Merk: Begge må være iskald; ellers vil separasjon ikke fungere. Bland ikke! Fordi sukrose er giftig for ormer er det viktig å være rask for følgende trinn.
    6. Del pellet i fire 15 mL-rør og vaske to ganger med iskald M9 + Octoxynol-9: sentrifuge på 1900 x g for 1 min ved romtemperatur. Fjern nedbryting, fylle opp til 15 mL merke med iskald M9 + Octoxynol-9 og gjenta prosedyren.
    7. Vask en gang med iskald M9 og kombinere de fire rørene til to rør. Fyll opp med M9 ved romtemperatur å et totalt volum på 4 mL i 15 mL-rør og rotere på en nutating mikser ved 25 ° C i 40 minutter.
      Merk: Dette hjelper ormer å fordøye eventuelle gjenværende bakterier i tarmen. Sjekk ormer under mikroskop for å se at det er ingen døde.
    8. Vask ormer to ganger med iskald M9 + Octoxynol-9 som beskrevet i 1.3.5. Vask to ganger med M9 og overføre ormer til en tube.
    9. Vask ormer en gang i gjenoppbygging (RAB) høy-salt utvinning bufferen uten hemmere (0.1 M 4-morpholineethanesulfonic acid (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic syre (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl, 0.02 M natrium fluor (NaF)) før samling. Fjerne nedbryting inntil det er ingen væske på toppen av ormen pellets.
      Merk: Dette trinnet og neste bør gjøres raskt for å unngå gjenstander i ormer forårsaket av den høye salt konsentrasjonen i bufferen.
    10. Beregne volumet av ormen pellets og legge en identisk volum på RAB med hemmere (2 x Protease Inhibitor Cocktail). Bruke en Pasteur pipette, utarbeide ormer og sakte dryppe ned en 50 mL tube halvdel fylt med flytende nitrogen i tørris. La flytende nitrogen fordamper og lagre frosne ormer ved-80 ° C før videre behandling.
      Forsiktig: Flytende nitrogen er en ekstremt lav temperatur; Bruk passende beskyttelse.

2. uløselig Protein utvinning med unge og eldre dyr utsatt for RNAi målretting en genet av interesse

  1. Avbrudd av dyr samlet i trinn 1.3
    Merk: Det er viktig å unngå noen tining av ormen prøvene. Avkjøl mørtelen med flytende nitrogen og utføre den komplette prosedyren på tørris.
    Forsiktig: Flytende nitrogen er en ekstremt lav temperatur; Bruk passende beskyttelse.
    1. Transfer frosne ormer til pre-avkjølt mørtelen og male for 2,5 min.
      Merk: Vær forsiktig under slipe: i begynnelsen, frosne ormer er i små kuler og det er lett å miste dem.
    2. Legge til flytende nitrogen (ca 100 mL) pulveret til å kjøle den ned igjen og male for en annen 2,5 min. Sjekk med mikroskopet at ormen organer brytes. Overføre pulver til 2 mL rør og lagre dem på-80 ° C.
  2. Rask uløselig protein utvinning for Western blot analyse
    Merk: Bruk denne metoden til å sammenligne de totale protein innhold og uløselig protein nivåene mellom de ulike dagene med og uten RNAi målretting genet av interesse. Utfør alle trinn til trinn 2.2.3 på isen!
    1. Solubilize 50 mg bakken ormer fra trinn 2.1 med 150 µL Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% natrium dodecyl sulfate (SDS), 0,5% natrium deoxycholate (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF), 1 x Protease Inhibitor Cocktail). Homogenize suspensjon bruker en 1 mL sprøyte med grå nål (27 G x ½", 0,4 x 13 mm); Utarbeide suspensjon 10 ganger.
    2. Sentrifuge 18,400 x g for 20 min på 4 ° C. Samle nedbryting.
    3. Resuspend pellets i 100 µL RIPA buffer og sentrifuger 18,400 x g for 20 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting, spin kort tid og være forsiktig fjerne leftover supernatant.
    4. For å solubilize svært uløselig proteiner, resuspend pellet 75 µL Urea/SDS buffer (8 M urea, 2% SDS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) og ruge i 10 min ved romtemperatur.
    5. For å analysere total proteininnholdet, Kombiner den første RIPA supernatant fra trinn 2.2.2 og Urea/SDS pellet rørets. Kontoen for volumene brukes for utvinning, bør totalt brøken inneholde to tredjedeler av RIPA supernatant og en tredjedel av Urea/SDS pellet brøkdel. På en liten 4-12% gradient gel, sjekk nivåene av uløselig protein av lessing 9 µL av den Urea/SDS fraksjon og 4 µL totale kombinerte protein. Utføre en total protein blot flekker å overvåke protein nivå. Western blotting bruke spesifikke antistoffer, kontrollerer endringer i insolubility for individuelle proteiner kvantifisert ved massespektrometri (se avsnitt 3).
  3. Uløselig protein utvinning isolere SDS-uløselig proteiner for massespektrometri
    Merk: Utføre alle skritt på is.
    1. På tørris ganger veie ut to 350 mg bakken ormer per punkt og RNAi bakterier (unge og alderen ormer, kontrollere RNAi bakterier og RNAi bakterier for genet av interesse) i 2 mL rør.
    2. Hvis du vil fjerne høy-salt løselig proteiner, legge to bind av RAB per vekt (700 µL) med hemmere, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNase jeg, og 100 µg/mL RNase A hver rør og solubilize pulver på is. Utarbeide suspensjon 1 mL sprøyter (grå p, 27 G x ½", 0,4 x 13 mm) til 15 ganger og Inkuber det på is 10 min. sentrifuge 18,400 x g for 20 min på 4 ° C. Gå gjennom fett laget og samle nedbryting som inneholder høy-salt løselig proteiner i en 2 mL tube per betingelse (fire rør totalt). Fjerne fettet og kaste den. Aliquot høy-salt løselig proteiner fryse på-80 ° C.
    3. Hvis du vil forkaste lipider, solubilize pellets med 700 µL RAB med hemmere som inneholder 1 M sukrose (uten DNase jeg og RNase A). Utarbeide suspensjon sprøyter til 10 ganger og Inkuber det på is 5 min. sentrifuge 18,400 x g for 20 min på 4 ° C. Pass på å fjerne alle nedbryting og lipider og kaste seg.
    4. Hvis du vil fjerne SDS-løselig proteiner, solubilize pellets med 700 µL RIPA buffer. Utarbeide suspensjon sprøyter til 10 ganger og ruge det for 10 min på is. Sentrifuge 18,400 x g for 20 min på 4 ° C. Samle nedbryting inneholder SDS-løselig proteiner og aliquot for frysing på-80 ° C.
    5. Basseng to eksempler på hver betingelse sammen etter solubilizing hver pellets med 500 µL RIPA buffer. Trekke opp suspensjon sprøyter til 10 ganger. Sentrifuge 18,400 x g for 20 min på 4 ° C. Pass på å fjerne alle nedbryting og kaste den.
      Merk: Målet med utvinning er å skille løselig proteiner fra uløselig proteiner. Derfor er det viktig å fjerne alle rester RIPA supernatant ør maursyre i neste trinn.
    6. Solubilize den endelige pellet som inneholder svært uløselig proteiner med 400 µL 70% maursyre og utarbeide suspensjon sprøyter til 20 ganger. Inkuber etter 20 min på is. Sentrifuge 50.000 x g for 20 min 4 ° C, 3-akselerasjon og retardasjon 5, fjerne ormen cuticle rusk. Samle nedbryting som inneholder svært uløselig proteiner og fryse den på-80 ° C.
    7. Dialyse av uløselig protein fraksjoner for massespektrometri
      Merk: Dialyze på 4 ° C.
      1. Forberede 8 L dialyse buffer (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7.5) og dele det til åtte 1 L kanner. Sted tre membraner (membran filtre = 0.025 µM) på bufferen overflaten for hver 1 liters kanne.
      2. Per membran, nøye laste 65 µL uløselig protein solubilized i maursyre fikk i trinn 2.3.6. Hver tilstand er delt på seks membraner.
      3. Sjekk pH i ett utvalg av fjerne 5 µL og legge den på en pH stripe. Hvis pH er mellom 7 og 8 (ca etter 2 timer), samle prøven av pipettering forsiktig opp og ned. Til slutt bruk 10 µL dialyse buffer for å vaske utløse av hver membran. Fryse eksempler på-80 ° C.

3. omfattende identifikasjon og måling av endringer i Protein Insolubility med alderen av RNAi målretting en genet av interesse

  1. Forberedelse for masse massespektrometri analyse
    1. Vurdere mengden uløselig proteiner i de dialyzed prøvene ved lasting en aliquot på en 4-12% gradient gel sammen med en referanse utvalg av kjente konsentrasjon. Utføre en total protein gel flekker og kvantifisere protein beløpet med en analyseprogramvare. Dette trinnet er nødvendig for å estimere mengden av trypsin nødvendig for fordøyelsen (trinn 3.1.4).
    2. Konsentrere eksemplene bruker en sentrifugal fordamperen og solubilize uløselig proteinene i en siste konsentrasjon av 8 M urea.
    3. Alkylation og reduksjon
      1. Legge til Tris(2-carboxyethyl) phosphine hydroklorid (TCEP) å en final konsentrasjon av 4 mM til prøvene. Inkuber 1t ved 57 ° C med 300 rpm. Sett prøvene til romtemperatur.
      2. Legge til iodoacetamide en siste konsentrasjon av 8.4 mM. Inkuber det for 45 min (kan være ruget for 2t) i mørket ved romtemperatur.
      3. Fortynne eksemplene i 150 mM ammonium bikarbonat å få en siste 2 M urea konsentrasjon.
    4. Digest proteiner med 5% w/w endret trypsin overnatting på 37 ° C og 400 rpm.
    5. Laste inn en prøve av fordøyd proteiner på en 12% SDS gel og utføre en total protein gel flekker å analysere hvis fordøyelsen arbeidet. Hvis det er fortsatt noen band tilstede, gjentar du trinn 3.1.4 og 3.1.5.
    6. Peptider fra ung og gammel og RNAi behandlet C. elegans er merket med isobar koder for relative og absolutte kvantifisering følge instruksjonene fra produsenten.
      Merk: Eventuelt andre metoder for merking av peptider eller proteiner kan brukes for kvantifisering som tandem masse tagger.
      Merk: Masse massespektrometri analyse: redusere utvalget kompleksitet, bør peptider skilles med sterk cation exchange Ture i forskjellige fraksjoner massespektrometri analyse5. Flere masse spektrometre er i stand til å analysere isobar koder for relative og absolutte kvantifisering som beskrevet andre steder17. Dataene innhentet bør behandles med passende programvare. Samlet kan denne analysen identifisering av svært uløselig proteiner og endringene alder og proteostasis modulering.

4. i Vivo evaluering av påvirkning av en genet av interesse på aggregering mønster under aldring

  1. Massespektrometri analysen i del 3, Velg en alder-avhengige aggregering utsatt protein som akkumuleres i forskjellig grad i dyr utsatt for RNAi. Generere transgene C. elegans linjer uttrykke dette proteinet merket med et fluorescerende protein og under kontroll av sine respektive arrangøren eller en vev-spesifikke promoter (se diskusjon for valg av en passende promoter). Opprettholde belastningen på 15 ° C ved standard teknikker på Rundormer vekst (NG) plater plantet med OP50. For eksempel, valgte vi en orm belastning uttrykke polyadenylate-binding protein (PAB-1) smeltet på N-terminus til tagRFP under kontroll av den pharyngeal muskel utbyggeren pmyo-2.
  2. I vivo evaluering av endringer i samling med alder ved hemming av genet av interesse
    1. Én til to dager på forhånd, forberede NG/carbenicillin (Carb) / IPTG plater med kontroll (tom RNAi vektor L4440) bakterier og RNAi bakterier å hemme genet av interesse. (For en detaljert protokoll om RNAi i C. elegans se JoVE vitenskap utdanning Database. Vesentlige av biologi 1: gjær, Drosophila og C. elegans. RNAi i C. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. For RNAi behandling fra L1, place egg-legging ormer på flere skille små NG/Carb/IPTG (6 cm diameter) plater seeded med RNAi eller RNAi bakterier for genet av interesse på 20 ° C. Fjerne voksne etter 2 h, holde avkommet på 20 ° C. For å unngå utviklingsmessige defekter, kan RNAi behandlinger startes etter L4 larvestadiet.
    3. Når avkom når L4 larvestadiet, overføre disse L4s på nye NG/Carb/IPTG plater seeded med RNAi eller RNAi bakterier for genet av interesse. Sette opp ni plater med 15 transgenics hver for begge betingelsene og holde dem på 20 ° C. Aldring ormer må overføres fra deres avkom til nye plater hver annen dag til slutten av menstruasjonen reproduktive for å kunne skille dem fra deres avkom.
    4. Vurdere endringer i fordelingen av aggregering utsatt protein merket med et fluorescerende merke under fluorescerende stereo-mikroskop med 24 x forstørrelse voksen, annenhver dag.
      Merk: Avhengig av alder akkumulering av aggregering utsatt proteinet i lyse puncta brukes som en skrivebeskyttet ut for aggregering. Disse puncta bør være svært immobile strukturer som aggregater. Dette bør fastsettes av fluorescens gjenoppretting etter photobleaching (FRAP) ved hjelp av AC confocal mikroskopi. For aggregert protein praktiseres noen utvinning i regionen bleket etter minst 4 min5,18. For å kvantifisere endres med alderen, vi scoret distribusjon mønstre i alder-synkroniserte ormer overexpressing PAB-1 på dag 2 og dag 5 dag 7 av voksen som følgende: lav aggregering nivåer (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta i bakre pharyngeal pære), middels aggregering nivåer (mer enn 10 puncta i bakre pharyngeal pære), og høy aggregering nivåer (mer enn 10 puncta i fremre pharyngeal pære).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brukte metodene presenteres her for å evaluere hvordan varige dyr med redusert IIS modulerer alder-avhengige proteiner aggregering. Western blot (se trinn 2.2, hastig uløselig protein utvinning for Western blot analyse), vi analysert totalt og uløselig proteininnhold av unge (dag 3 av voksen) og alderen (dag 18 voksen) ormer kontroll RNAi og på RNAi målretting insulin / IGF-1-lignende reseptor daf-2. Vi observerte ingen store endringer i totalt protein nivå med alder eller mellom kontrollen og daf-2 RNAi betingelser (figur 2A). Som forventet, oppdaget vi en sterk aldersrelatert økning i nivåene av svært-uløselig proteinene i kontrollen dyr (figur 2B). Til sammenligning i varige dyrene på daf-2 RNAi ble aggregering tilbøyelighet sterkt redusert. Hele protein farging av uløselig ekstrakter avdekket et mindre komplekse protein bandet mønster i utdrag fra 18 dager gamle ormer på daf-2 RNAi sammenlignet med alder-matchet kontroller. Kvantitativ massespektrometri analysen viste at langvarige dyr med redusert IIS har samlet mindre alder-assosiert protein aggregering og viktigere, daf-2 hemming helt avskaffet alder-avhengige insolubility av en spesifikke delsett av proteiner7. Oppfølging på disse resultatene fokuserte vi på en av disse aggregering utsatt proteiner, PAB-1. PAB-1 er en RNA-bindende protein med en anslått "prion-like"-domenet. Antistoff flekker bekreftet at langvarige dyr opprettholdt PAB-1 løselig med alder (figur 2C).

For i vivo analyse av PAB-1 aggregering produsert vi transgene dyr uttrykke tagRFP::PAB-1 i pharyngeal muskler. Ung dyrene, tagRFP::PAB-1 ble hovedsakelig diffusely plassert i pharynx (Figur 3A, "lavt" aggregering nivå) men med alderen, observerte vi en progressiv akkumulasjon i lyse puncta i bakre pharyngeal pære ( Figur 3A, "middels" aggregering nivå). Under aldring observerte vi også samling i fremre pharyngeal pære (Figur 3A, "høy" aggregering nivå) i et økende antall dyr. Gruppering dyrene i disse ulike kategorier scoret vi frekvensen av PAB-1 samling i en populasjon. På dag 2 av voksen mesteparten av ormer (88%) hadde ingen eller svært få puncta og ingen dyr med høy aggregering nivåer ble funnet. Allerede på dag 5 presenterte 19% av befolkningen viste mellomliggende og 16% høy aggregering nivåer, mens på dag 7 mer enn 70% av ormer middels og høy mengdenivåer. Analysere effekten av lang levetid på alder-avhengige aggregering av tagRFP:PAB-1, vi generert transgene tagRFP::PAB-1 ormer med en daf-2 mutasjon. Disse dyrene viste signifikant redusert tagRFP:PAB-1 puncta formasjon med aldring, med mindre enn 15% av befolkningen viser middels og høy aggregering nivåer selv på dag 7 (Figur 3B).

Ved å bruke de ulike tilnærmingene som beskrevet her, avdekket vi at redusert IIS hindrer alder-avhengige proteiner samling forskjellig grad og varige dyr er spesielt effektiv i å gjenopprette dynamikken i PAB-1-7.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk for arbeidsflyten å studere endringer i iboende protein samling med alder i C. elegans.  Hovedtrinn er uthevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Protein insolubility øker med alderen i kontrollen dyr, men ikke i dyr med redusert daf-2 signalering. (A) Total protein farging av totale fraksjon fra dag 3 og dag 18 gon-2(-) mutanter underlegges kontroll og daf-2 RNAi (vokst ved 25 ° C). (B) Total protein flekker SDS-uløselig brøkdel fra dag 3 og dag 18 gon-2(-) mutanter underlegges kontroll og daf-2 RNAi (vokst ved 25 ° C). Panelet publiseres referanse7. (C) Immunoblot oppdage PAB-1 i SDS-uløselig brøk, relevante protein band angitt med rød pil. Panelet publiseres referanse7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Redusert daf-2 signalering forhindrer akkumulering av tagRFP::PAB-1 puncta med alderen. (A) representant bilder av ormer med tagRFP::PAB-1 overuttrykte i pharyngeal muskler (høy forstørrelsen microscope, tagRFP oppdagelsen innstillinger: eksitasjon 558 nm, utslipp 583 nm). Dyr med lav (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta i bakre pharyngeal pære), middels (mer enn 10 puncta i bakre pharyngeal pære) eller høy aggregering nivåer (mer enn 10 puncta i fremre pharyngeal pære) vises. Skala bar = 20 µm. (B) kvantifisering av forskjellige tagRFP::PAB-1 aggregering nivåer med alder i wildtype og daf-2 mutant bakgrunn avslører sterkt forsinkede tagRFP::PAB-1 samling med alderen i varige dyr. Dag 2 og dag 5 dag 7 daf-2(-) versus wildtype bakgrunn, lav sammenlignet med middels og høy mengdenivåer: Fishers pressepenger test, ***p < 0,0001. Panelet publiseres referanse7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Lagerløsning Beløp Siste konsentrasjon Kommentarer/beskrivelse
Flytende kultur, totalt volum 300 mL
S basale (For 500 mL: 5.9 g NaCl, 50 mL 1 M kalium fosfat pH 6) 200 mL 1 M kalium fosfat pH 6: For 1 L: 129 g KH2PO4 monobasic, 52 g K2HPO4 dibasic vannfri
1 M kalium citrate pH 6 (For 400 mL: 13,1 g sitronsyre monohydrat, 134.4 g tri-kalium sitrat monohydrat) 3 mL 10 mM
Spore metaller løsning (For 1 L: 1.86 g Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7T2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7T2O, 0.025 g CuSO4 · 5t2O) 3 mL Lagre lagerløsning i mørket på 4 ° C
1 M MgSO4 (For 500 mL: 123.3 g) 900 ΜL 3 mM
1 M CaCl2 (For 500 mL: 73.5 g) 900 ΜL 3 mM
200 µg/mL Carbendazim (For 50 mL: 10 mg i metanol) 150 ΜL 100 ng/mL
5 mg/mL kolesterol (For 100 mL: 0,5 g i etanol) 300 ΜL 5 µg/mL
Gjenoppbygging (RAB) høy-salt utvinning buffer, 30 mL
1 M 4-Morpholineethanesulfonic syre (MES) 3 mL 100 mM RAB lager buffer komponent
0,5 M Ethyleneglycoltetraacetic syre (EGTA) 60 ΜL 1 mM RAB lager buffer komponent
0,5 M Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) 6 ΜL 0,1 mM RAB lager buffer komponent
1 M MgSO4 15 ΜL 0,5 mM RAB lager buffer komponent
5 M NaCl 4.5 mL 750 mM RAB lager buffer komponent
1 M natrium fluor (NaF) 600 ΜL 20 mM RAB lager buffer komponent
Fullføre til 30 mL totalt med ddH2O
50 x Protease Inhibitor Cocktail * 2 x * Legge reagenser etter tar mengden RAB lager buffer som er nødvendig (for utvinning for massespektrometri 6 mL).
100 mM Phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) i isopropanol, 20 ° C * 1 mM
10 U/µL DNaseI * 200 U/mL
4 mg/mL RNaseA * 100 µg/mL
RAB med 1 M sukrose, 30 mL
2 M sukrose (For 50 mL: 34,2 g) 15 mL 1 M Legge til RAB buffer reagensene dessuten DNaseI og RNaseA
Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer, 30 mL
1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 8 1,5 mL 50 mM RIPA lager buffer komponent
5 M NaCl 0.9 mL 150 mM RIPA lager buffer komponent
0,5 M EDTA 0,3 mL 5 mM RIPA lager buffer komponent
10% natrium dodecyl sulfate (SDS) 1,5 mL 0,50% RIPA lager buffer komponent
10% natrium deoxycholate (SDO) 1,5 mL 0,50% RIPA lager buffer komponent
Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) 0,3 mL 1% RIPA lager buffer komponent
Fullføre til 30 mL totalt med ddH2O
100 mM PMSF * 1 mM * Legge reagenser etter tar mengden RIPA lager buffer som er nødvendig (for utvinning for massespektrometri 10 mL).
50 x Protease Inhibitor Cocktail * 1 x
Urea/SDS buffer, 10 mL
Urea 4.8 g 8 M
10% SDS 2 mL 2%
Dithiothreitol (DTT) 77 mg 50 mM
1 M Tris pH 8 0,5 mL 50 mM
Fullføre til 10 mL totalt med ddH2O
Dialyse buffer, 1 L
Tris 6 g 50 mM
DTT 154 mg 1 mM
100 mM PMSF 1 mL 0,1 mM
Justere pH 7,5 og fullstendig til 1 L total med ddH2O

Tabell 1: Buffere for flytende kultur, uløselig protein utvinning og dialyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi en metode for å isolere svært-uløselig protein aggregater fra aldring C. elegans utsatt for RNAi for analyse av massespektrometri og vestlige blotting. Vi viser at forbedre proteostasis ved å redusere IIS sterkt hindrer alder-avhengige proteiner aggregering. Ved å velge bestemte aggregering utsatt proteiner til overexpress i C. elegans, er det mulig å analysere videre mekanismer modulerende iboende protein aggregering.

Iboende alder-avhengige Protein aggregering Versus sykdomsassosierte Protein aggregering
Dette arbeidet er basert på de tidligere funnene som protein samling ikke er begrenset til spesifikke proteiner samles i en sykdom sammenheng. Ved å fokusere på endogene aggregering utsatt proteiner i stedet for ectopically uttrykt sykdomsassosierte proteiner, er forventning å gi ny innsikt i fysiologiske regulering av aggregering. Alder-avhengige proteiner aggregater er funnet i mobilnettet steder5, bør deres studie også gi innsikt i kupeen bestemt kvalitetskontroll mekanismer. Samlet kan mekanismene som styrer iboende protein aggregering også være relevante i å forebygge sykdom protein aggregering. Av notatet, selv om alder-avhengige proteiner aggregering ligner i flere aspekter sykdom protein aggregering, fortsatt det uklart om disse aggregater inneholder amyloid fibrils, karakteristisk for mange sykdom aggregat.

Valg av C. Elegans modell: fordeler og begrensninger
Sammenlignet med en pattedyr modell, er en av de største fordelene med å bruke C. elegans for å studere en aldring-relaterte kjennetegn dens svært kort levetid. Mange hundre proteiner blitt konsekvent svært aggregering-utsatt under aldring og denne stor økning i insolubility er lett detectable selv med en forenklet biokjemiske utvinning. Men er en stor begrensning av bruker C. elegans for å studere alder-avhengige proteiner aggregering nødvendigheten av å isolere stort antall alderen dyr. C. elegans er hermafroditter og produsere ca 220 eller mer avkom under deres reproduktive fase19, er det viktig å hindre reproduksjon eller eliminere avkom for å alder innbyggere. Flere alternativer er tilgjengelige å indusere sterilitet: ett alternativ er å bruke den kjemiske fluorodeoxyuridine (FUdR), en inhibitor av DNA-syntese. Men fører FUdR til mange bivirkninger inkludert endringer i proteostasis og redusert protein aggregering20,21,22. Viktigere, induserer FUdR genotype-spesifikke tiltak23. Et annet alternativ er å bruke temperatur-sensitive sterilt mutanter. For eksempel har spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141), og gon-2(q388) vært brukt tidligere til massespektrometri analyser av alder-avhengige samles proteom5, 8.

Men det er flere begrensninger forbundet med å bruke disse mutanter. Først som sterilitet temperaturen-avhengige, er det nødvendig å vokse dyrene ved 25 ° C, som utgjør en mild stress og akselererer aldring samt protein aggregering. Omvendt, vi har observert at gon-2, glp-1 og fem-1 mutanter er longer-lived sammenlignet med vill-type når vedlikeholdt ved 25 ° C (data ikke vist). Andre, finnes det spesifikke begrensninger knyttet til hver type reproduktive defekt. En ulempe med å bruke sæd-defekt mutanter er produksjon av 5mas oocytes (også produsert i alderen vill-type hermafroditter). Kvaliteten på disse oocytes avtar sterkt med alderen, og de akkumuleres i gonad24,25. Kvantitativ massespektrometri analyse viser at sæd-defekt mutanter har flere ganger høyere nivåer av uløselig proteiner samler med alderen sammenlignet med gonad-mindre eller germline-mangelfull mutanter. Dette angir protein misfolding og aggregering ligger i gonad5, med tidligere studier12,13 og i vivo eksperimenter avslørende aggregert proteiner i den unormale oocyte klynger5. Derfor ville overdreven protein samling i gonad skjule mer subtile endringer i protein aggregering i somatiske vev. Dette bør også vurderes når man sammenligner intervensjoner som fungerer forskjellig grad på reproduktive og somatiske vev proteostasis. Derfor for å vurdere bare somatiske protein aggregering, favoriserer vi bruker gonad-mindre gon-2 mutanter. Et alternativ vil være å bruke germline-mangelfull glp-1 mutanter. Men oppmerksom vi på at disse dyrene har mindre iboende protein samling med alder sammenliknet med gon-2 mutanter5. Dette er trolig en konsekvens av bedre proteostasis i somatiske vev på grunn av signalene fra germline-defekt gonad26,27,28. Et annet alternativ er å bruke vill-type dyr og fjerne avkom hver dag av sedimentering. Men er dette problematisk på grunn av vanskelighetene med å helt fjerne alle avkom.

En annen generelle begrensning bruker C. elegans er dens liten størrelse som gjør bestemte vev utdrag utfordrende. Som slik helt dyr utdrag gir relevant informasjon relatert til hvordan ulike forhold modulere protein aggregering bestemt vev. Av notatet, kan potensielt problemet omgås ved hjelp av en nylig utviklet metode basert på fluorescens-aktivert celle sortering isolere bestemte celler fra C. elegans29. Men gjenstår det for å fastsettes om denne metoden ville være egnet til å få nok materiale for uløselig protein utvinning og om det ville være aktuelt å alderen dyr. Alternativt kan vev bestemt protein aggregering og dens regulering bli undersøkt av ekstra i vivo eksperimenter. Som transgene dyr uttrykke et fluorescently-merket samling utsatt protein valg kan raskt genereres og som dyrene er gjennomsiktig, er det relativt lett å undersøke protein aggregering i situ.

Samlet sett er det viktig å følge opp proteomic resultatene med i vivo eksperimenter i en vill-type bakgrunn. Kombinasjonen av biokjemiske og mikroskopi-baserte karakteristikk gir en omfattende studie av protein aggregering og en vurdering av rollen av gener av interesse. Sistnevnte er tilrettelagt i C. elegans av RNAi formidlet gjennom fôring og tilgjengeligheten av hele genomet RNAi biblioteker. I tillegg finnes et stort antall preget mutanter å bekrefte resultatene av RNAi eller i stedet for RNAi.

Flytende kultur og biokjemiske utvinning: fordeler og begrensninger
Som svært samlet proteiner utgjør bare en brøkdel av totale proteiner, er det nødvendig å starte utvinning med et stort antall dyr. Med store mengder uløselig proteiner er det mulig å utføre omfattende peptid fraksjoneres for å redusere utvalget kompleksitet for massespektrometri og dermed bedre identifikasjon av lavere rikelig proteiner. Hvis bare små mengder uløselig proteiner er nødvendig, er et alternativ å vokse ormer på plater og homogenize dem med keramiske perler. En av ulempene med flytende kultur er at hvis en forurensning, hele kulturen påvirkes og må kastes. Generelt, C. elegans aldring er sterkt påvirket av temperatur og denne parameteren må kontrolleres nøye i flytende kulturen å unngå variasjoner i alder-avhengige proteiner aggregering. Temperaturkontroll er også avgjørende for å få en homogen befolkning av gonad-mindre dyr ved gon-2(-) mutanter.

Avhengig av målet av studien er det viktig å vurdere ulike utvinning metoder. Biokjemiske utvinning presenteres her ble opprinnelig tilpasset fra protokoller isolere sykdomsassosierte aggregater11,30,31. Vi valgte relativt høye konsentrasjoner av vaskemidler som 0,5% SDS isolere de mer uløselig aggregatene. Også av pelleting 0,5% SDS uløselig aggregat med lave sentrifugal hastigheter, ville denne protokollen bare isolere de større aggregatene. Alternativt var en mindre strenge protokoll nylig publisert10. I denne studien var mer løselig og mindre aggregater også hentet utelater SDS og bruker svært høye sentrifugal hastigheter på 500.000 x g. En sammenligning av de ulike protokollene viser en generell økning i antall proteiner i samles proteom bruker mindre strenge protokollen7. Vi registrerer at langvarige dyr med redusert daf-2 signalering effektivt hindret akkumulering av både SDS-løselig og SDS-uløselig mengdefunksjoner i gonad-mindre dyr7.

I Vivo Analyse av alder-avhengige Protein aggregering
Under oppretting av transgene modeller for følgende alder-avhengige proteiner aggregering, er det relevant å vurdere i hvilken vev overexpress aggregering utsatt protein av interesse og på hvilke uttrykk nivåer. Vi ønsker uttrykk i vev i hodet regionen for å unngå interferens med autofluorescence, som er fremtredende i aldring tarmen. For å visualisere fluorescerende-merket aggregater med lav-forstørrelse, bør aggregering utsatt protein uttrykkes på et relativt høyt nivå. På den annen side, vil for høy uttrykk føre aggregering utsatt protein til skjemaet aggregat allerede i ung dyrene.

Sammen vil disse metodene hjelpe oss å forstå hvorfor en del av proteom samler med alder og til slutt føre til utvikling av strategier for å fremme sunn aldring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra DZNE og Marie Curie International reintegrasjon stipend (322120 til D.C.D.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fernbach culture flask  Corning 4425-2XL Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap  Schott 1088655 GL45
Nutating Mixer VWR 444-0148
Separatory funnel Nalgene 4300-1000 Capacity 1,000 ml
1 ml syringe  BD Plastipak 300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm BD Microlance 3 300635
Membrane filters 0.025 µM Millipore VSWP04700
pH strip Machery-Nagel 92110 pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693132001 Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9  Applichem A1388 Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol Applichem A1694 Nonidet P40 (NP40)
DNaseI Roche 04716728001 recombinant, RNase free
RNaseA Promega A7973 solution
Total protein blot staining Thermofisher S11791 Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining Thermofisher S12001 Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) Serva 36970
Iodoacetamide Serva 26710
Ammoniumbicarbonate Sigma-Aldrich 09830
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation Sciex 4352135 iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP Beckmann Coulter 393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP Beckmann Coulter 393315
Centrifuge 5424R Eppendorf 5404000413
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702000329
Centrifuge Megafuge 40R Thermo Scientific 75004518
Concentrator Plus Eppendorf 5305000304 Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC  Leica With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope Leica  Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 Zeiss With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software ImageJ
Analysis of mass spectrometry data Protein Prospector http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50 CGC
RNAi bacteria
L4440 Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253 CGC, strain name: EJ1158  Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
  3. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  4. Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
  5. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
  6. Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
  7. Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
  8. Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
  9. Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
  10. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
  11. Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
  12. Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
  13. Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
  14. Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
  15. Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  16. Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
  17. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
  20. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
  21. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
  22. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
  23. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  24. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
  25. Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
  26. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
  27. Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
  28. Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
  29. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
  30. Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
  31. Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).

Tags

Biokjemi problemet 129 aldring protein insolubility protein aggregering protein misfolding proteostasis C. elegans nevrodegenerative sykdommer biokjemi
Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Groh, N., Gallotta, I., Lechler, M.… More

Groh, N., Gallotta, I., Lechler, M. C., Huang, C., Jung, R., David, D. C. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (129), e56464, doi:10.3791/56464 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter