Summary
本文证明了用二次 nanoelectrospray 电离耦合高分辨质谱法对呼气的化学成分进行实时表征的一种协议。
Abstract
呼出挥发性有机化合物 (voc) 引起了相当大的兴趣, 因为它们可以作为疾病诊断和环境暴露的生物标志物, 以无创的方式。在这项工作中, 我们提出了一个协议, 用二次 nanoelectrospray 电离耦合到高分辨率质谱 (Sec-nanoESI-HRMS) 实时表征呼出的挥发性有机化合物。自制的 Sec nanoESI 源很容易建立在商业 nanoESI 的基础上。在呼气的背景下减去的质谱中观察到数以百计的峰值, 其质量准确度分别为正负离子检测模式的 4.0-13.5 ppm 和-20.3-1.3 ppm。根据精确的质量和同位素模式, 对峰进行了精确的元素组成。少于三十年代用于一次呼气测量, 并且它需要大约7分钟为六个被复制的测量。
Introduction
随着现代分析技术的飞速发展, 数以百计的挥发性有机化合物 (voc) 已经在人呼出的呼吸中发现了1。这些挥发气主要是由肺泡空气 (350 毫升为一个健康的成人) 和解剖死亡空间空气 (~ 150 毫升)2, 受身体新陈代谢的影响3,4,5,6,7 ,8和环境污染9分别。因此, 如果确定, 这些挥发性有机化合物有望被用作疾病诊断和环境暴露的生物标志物。
气相色谱质谱法 (gc-ms) 是对呼出挥发性有机化合物进行定性定量分析的最广泛应用的技术2, 直接 MS 技术已经发展为实时呼吸分析, 具有高的时间分辨率和简单的样品预准备。直接 MS 技术, 如质子转移反应 ms (PTR)10, 选定的离子流管 ms (筛-ms)11, 二次电喷雾电离 ms (局)12,13 (也命名为萃取电喷雾电离 ms, EESI14,15), 微量大气气体分析仪 (TAGA)16和等离子电离 ms (PI-毫秒)17已被调查近年来。
在所有的直接 MS 技术中, 局是众所周知的通用软电离技术19,20,21;源很容易被定制, 并结合到不同类型的质谱仪,例如, 飞行质量光谱仪的时间8,15, 离子阱质谱仪14和 orbitrap 质谱仪12 ,18。到目前为止, 局已成功地用于诊断呼吸系统疾病22, 测量昼夜节律3,6,23, 药代动力学7,8, 和揭示代谢通路4,等。最近, 一个商业局源已成为可用。
在本研究中, 建立了一种轻便紧凑的二次 nanoelectrospray 电离源 (Sec nanoESI), 并将其耦合到高分辨率质谱仪中。对呼出的挥发性有机化合物进行了实时测量。
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Protocol
警告: 使用前请查阅所有相关的材料安全数据表 (MSDS)。请使用适当的个人防护设备,例如, 实验室外套, 手套, 护目镜, 全长长裤和闭合脚趾鞋)。
1. 设置 Sec-nanoESI 源
- 根据局过程设置 Sec nanoESI 源,即, 引入呼吸气体, 使其与电喷雾羽流相交, 并被带电的水滴电离 (图 1)。在单个实验室中生成的源取决于使用了24、25的质谱仪的接口。在这里, 建立基于商业 nanoESI 源 (图 2) 的 Sec nanoESI 源, 并实现台式四极 orbitrap 质谱仪。
注: 源的主体是一个立方不锈钢腔 (长度25毫米, id 13 毫米) (图 2b), 带有一个入口 (id 4 毫米), 将 nanoESI 毛细管引入腔室。因此, 会议厅未完全密封 (图 2b)。 - 安装两个不锈钢管 (长度8毫米, 外径5毫米, id 3 毫米) 在房间的每一侧的气体输送。
- 将两个石英窗 (14 毫米) 放在房间的顶部和底部, 以检查 nanoESI 毛细管和 nanoESI 喷雾尖端的位置, 无论是眼睛还是数码显微镜。
- 将腔体焊接到质谱仪的扫锥上。
注: 设计可能会因个别实验室使用的质谱仪的大气压界面的特殊几何而改变。
2. 仪器优化
- 根据制造商的指示, 在正负离子检测模式下校准质谱仪。通过应用标定, 将透镜电位和检测条件等质谱参数进行优化, 使灵敏度和峰值形状具有一定的分辨率值。70000的质量分辨率在这里使用。
- 使用商用 ESI 源进行完全 Q Exactive 校准;但是, 可以使用任何兼容的源 (包括定制的) 进行质量校准。
- 设置质谱仪 > 100 °c 的离子传输管 (ITT) 的温度。虽然最高温度可以设置在350摄氏度, 它可能会导致一些化合物的分解。因此, 在本实验中使用了150°c。
注: 对于具有取样孔而非 ITT 的质谱仪, 取样孔的温度设置 > 100 °c。 - 对于 esi 溶剂和流量, 根据溶剂的性质 (例如、极性和挥发性) 和靶向化合物 (例如、质子亲和性) 选择适当的 esi 溶剂。水和甲醇的混合物在各种各样的比率被通常使用作为 ESI 溶剂25。在本实验中, 使用含 0.1% (v/v) 甲酸的水, 为高电离效率已报告此溶剂13,19,23。将 ESI 溶剂的流量设置在 0-1. 5 ul/分钟和 200 nL/分钟的范围内。
注: 加气 ESI 溶剂在使用前为30分钟。 - 优化 nanoESI 源参数, 主要 nanoESI 电压和 nanoESI 毛细管尖端位置。电压通常从2.0 到4.5 伏不等。在这里使用2.5 伏。
注: 当流量增加时, 使用更高的 ESI 电压。刀尖与质谱孔之间的距离可由1到5毫米调整。优化后, 在质量谱中观测到的归一化强度级 (NL) 应为 > 1x106 , 而总离子色谱 (TIC) 在正负离子检测模式下的变化应为 < 10%。质量谱和 TIC 在m-/z 50-750 的质量范围内得到。 - 将纯气体应用于源。这是一个可选的步骤, 旨在减少挥发性有机化合物对室内空气的影响。高纯度氮气 (N2, 99.99%) 或纯净的空气可以使用。在纯气体存在的情况下, 在质量谱中观测到的 NL 应为 > 1x105 , 在正负离子检测模式下, TIC 的变化应为 < 10%。此处使用高纯度 N2 , 并以0.8 升/分交货。
注: 纯气和呼吸气体的总流量应高于通过质谱管孔的流速。
3. 呼出呼气的测量
- 吸入室内空气并进行正常呼气, 以恒定的流速呼出肺部的空气。通过压力计或流量计对该主题可见的流量表监视呼气流速。使用聚四氟乙烯 (PTFE) 油管输送呼吸气体23。
- 为防止管道内的水蒸气凝结, 请在80-100 oC7、23、27或使用 Nafion 烘干机2829的温度下加热油管。在本实验中, 该主题以流量计控制的0.4 升/分呼出。
- 将流量计的入口连接到 Nafion 油管 (长度60厘米), 以除去呼出的呼吸中的水蒸气, 并将流量计的出口连接到聚四氟乙烯油管 (长度13厘米, id 4 毫米)。它采取 < 三十年代为一呼气测量。
- 执行4-6 个复制的测量28,29。
- 为了尽量减少混淆效果, 请让参与者在测量23之前至少30分钟进食、饮用和刷牙。
注: 为了尽量减少挥发性有机化合物对室内空气的影响, 据报道, 它吸入纯气体而不是室内空气26。当使用 Nafion 油管时, 一些极性化合物可能会丢失。 - 在测量过程中, 要检查离子强度是否超过仪器的线性检测极限。信号的饱和可能导致工件的峰值, 这实际上不是由样品中的化合物产生的。通过鼻子吸入, 部分环境挥发性有机化合物和微粒将被去除;然而, 值得注意的是, 鼻腔通道中的化合物也可能被检测到。
4. 获得一个呼吸指纹和一个化合物的时间痕迹
- 获得图谱和质谱。使用软件 (如 Xcalibur) 记录图谱和质谱。由于这是直接的 MS 分析和不进行色谱分离, 总离子色谱 (TIC) 实际上表明了在质谱中检测到的所有信号的时间迹, 提取的离子色谱 (EIC) 显示了一个指定的化合物。
注: 对于其他商用质谱仪, 可通过相应的数据采集软件获得图谱和质量谱。 - 当测量呼出的呼吸时, 在 TIC 中选择一些扫描, 获得呼出的呼吸指纹。获得一个质量频谱, 代表这些扫描的平均值由软件。
- 要消除呼吸指纹的背景峰值, 请使用软件中的减法背景工具。请参阅制造商提供的用户指南。简而言之, 在不引入呼吸样本的情况下, 选择相同数量的扫描, 并从呼吸指纹中减去背景质量谱。
注: 在该方法中, 确定呼吸指纹特征的阈值为背景信号的标准差的三倍。对于其他商用质谱仪, 可以通过相应的数据采集软件进行背景减法。
- 要消除呼吸指纹的背景峰值, 请使用软件中的减法背景工具。请参阅制造商提供的用户指南。简而言之, 在不引入呼吸样本的情况下, 选择相同数量的扫描, 并从呼吸指纹中减去背景质量谱。
- 获取指定化合物的时间迹。在呼吸指纹中选择目标化合物的峰值, 然后通过软件获取该化合物的时间迹。
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Representative Results
图 3显示了在正负离子检测模式下记录的m/z 50-750 的质量范围内的呼吸指纹。分别在正负离子检测模式下, 观察了291峰 (峰值强度 > 5.0x104) 和173峰值 (峰值强度 > 3.0x104)。要识别质量谱中的峰值, 请参阅以前发布的详细信息12,18,24,29。简而言之, 发现了室内空气中挥发性代谢物和 voc。例如, m/z 74.0606 (图 3a) 的峰值是根据人类代谢物数据库 (HMDB) 呼出 n、n 甲基酰胺或 aminoactone 的结果;m/z 462.1447 和m/z 536.1638 (图 3a) 的峰值来自呼出氨和烷 (实验室污染物)12的加合物。正负离子检测模式中的典型质量精度值分别为-4.0-13.5 ppm 和-20.3-1.3 ppm。图 4显示了吲哚 (一种典型内源化合物) 的时间迹, 它由一个主题的呼出呼吸的六个复制测量结果检测到。所有六项测量所需的时间不到7分钟。
图 1.呼出气中挥发性有机化合物的局分析示意图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.(a) 示意图和 (b) 本实验使用的 Sec-nanoESI 源的照片。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.在m-/z 50-750 的质量范围内 (a) 阳性和 (b) 负离子检测模式获得的背景减去呼吸指纹。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.用六种重复测量的方法测定吲哚的时间迹。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
建立基于商业 nanoESI 源的 Sec-nanoESI 源, 其电离效率高于使用 ESI 源30。此外, 封闭腔内的电离效率进一步提高, 因为它将过程与环境背景空气隔离开来, 同时促进气体样品与喷雾羽流的混合。通过使用 Sec nanoESI, 相对于 ESI 源, 需要优化较少的参数, 从而便于安装、应用和维护。
如果 nanoESI-MS 进行呼吸分析时没有观察到信号或灵敏度显著下降, 应检查喷雾毛细管尖端的位置以及毛细管尖端的水滴的形成。将尖端与质谱仪的孔对齐。如果喷雾毛细管被堵塞或尖端被污染, 将喷雾毛细管改成新的。否则, 检查仪器是否被堵塞或被污染。如有必要, 更换或清洗。在检查喷雾毛细管之前关闭 ESI 电压。在室温下设定温度, 等待温度下降。
局-HRMS 已被证明是一个敏感和选择性的技术, 实时呼吸分析4,6,12。在过去的几年中, 这种技术已成功地应用于测量昼夜变化3,6, 监测药代动力学7,8, 确定代谢通路5,等.近年来, 人类呼吸中的氨基酸首次成功地量化了局-MS, 这在定量分析5中取得了显著进展。通过进一步的调查, 局-HRMS 可以作为一种有用和有效的无创临床方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (91543117 号) 的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ultrapure water | Merck Millipore, USA | MPGP04001 | Resistance >18.2 MΩ·cm |
Formic acid | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Corrosive to the respiratory tract. |
Nitrogen gas | Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China | N.A.a | Purity >99.99% |
Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific, USA | 02634L(S/N) | Beware of high voltage and high temperature |
NanoESI source | Thermo Scientific, USA | ES002373(S/N); ES071(P/N) | Beware of high voltage and high temperature |
Nano LC pump | Thermo Scientific, USA | 5041.0010A(P/N) | / |
Xcalibur software (Version 3.0) | Thermo Scientific, USA | BRE0008596 | / |
Dino-Lite Digital Microscope | Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China | CQ401833R(S/N) | / |
Nafion tubing | Perma Pure LLC, USA | ME60 | / |
PTFE tubing (I.D. 4 mm) | Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China | N.A. | Beware of the possible loss of polar compounds |
Mass flow controller | Line-Tech, Korea | M15122007 (S/N) | / |
Flow meter | Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China | 40784 | / |
aN.A.: not available. |
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