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Chemistry

उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित माध्यमिक Nanoelectrospray Ionization का उपयोग करके वास्तविक समय सांस विश्लेषण

Published: March 9, 2018 doi: 10.3791/56465
* These authors contributed equally

Summary

उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमेट्री करने के लिए युग्मित ionization माध्यमिक nanoelectrospray का उपयोग करके वास्तविक समय में exhaled सांस की निस्र्पक रासायनिक संरचना के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है ।

Abstract

Exhaled वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (VOCs) काफी रुचि पैदा की है, क्योंकि वे रोग निदान और एक गैर इनवेसिव तरीके से पर्यावरण के जोखिम के लिए जैव चिह्नों के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस काम में, हम उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सेक-nanoESI-HRMS) करने के लिए युग्मित माध्यमिक nanoelectrospray ionization का उपयोग करके वास्तविक समय में exhaled VOCs की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । घर का बना सेकंड-nanoESI स्रोत आसानी से एक वाणिज्यिक nanoESI स्रोत के आधार पर स्थापित किया गया था । चोटियों के सैकड़ों exhaled सांस की पृष्ठभूमि-घटाई जन स्पेक्ट्रा में मनाया गया, और बड़े पैमाने पर सटीकता मान रहे हैं-4.0-13.5 पीपीएम और-20.3-1.3 पीपीएम सकारात्मक और नकारात्मक आयन का पता लगाने मोड, क्रमशः में । चोटियों सटीक द्रव्यमान और isotopic पैटर्न के अनुसार सटीक मौलिक संरचना के साथ सौंपा गया था. से कम 30 एस एक समाप्ति माप के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह छह प्रतिकृति माप के लिए लगभग 7 मिनट लगते हैं ।

Introduction

आधुनिक विश्लेषणात्मक तकनीक के तेजी से विकास के साथ, अस्थिर कार्बनिक यौगिकों (VOCs) के सैकड़ों मानव exhaled सांस1में पहचान की गई है । ये VOCs ज्यादातर वायुकोशीय हवा से परिणाम (~ 350 एक स्वस्थ वयस्क के लिए एमएल) और संरचनात्मक मृत अंतरिक्ष वायु (~ 150 एमएल)2, जो शरीर के चयापचय से प्रभावित होते हैं3,4,5,6,7 ,8 और पर्यावरण प्रदूषण9, क्रमशः । एक परिणाम के रूप में, यदि पहचान की, इन VOCs रोग निदान और एक गैर इनवेसिव तरीके से पर्यावरणीय जोखिम के लिए के रूप में इस्तेमाल किया जा करने का वादा कर रहे हैं ।

हालांकि गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-ms) exhaled VOCs के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक है2, प्रत्यक्ष एमएस तकनीक, जो वास्तविक समय सांस विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, के फायदे है उच्च समय संकल्प और सरल नमूना पूर्व तैयारी । प्रत्यक्ष एमएस तकनीक, जैसे प्रोटॉन स्थानांतरण प्रतिक्रिया एमएस (PTR-ms)10, चयनित आयन प्रवाह ट्यूब एमएस (झारना-ms)11, माध्यमिक electrospray ionization एमएस (सेसि-ms)12,13 (भी नाम के रूप में निष्कर्षण electrospray ionization एमएस, EESI-एमएस14,15), ट्रेस वायुमंडलीय गैस विश्लेषक (तागा)16 और प्लाज्मा ionization एमएस (PI-ms)17 हाल के वर्षों में जांच की गई है ।

सभी प्रत्यक्ष एमएस तकनीक के अलावा, सेसि एक सार्वभौमिक नरम ionization तकनीक के रूप में अच्छी तरह से जाना जाता है19,20,21; और स्रोत के लिए अनुकूलित किया जाना आसान है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के विभिंन प्रकार के लिए युग्मित, जैसे, उड़ान मास के समय स्पेक्ट्रोमीटर8,15, आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमीटर14 और orbitrap जन स्पेक्ट्रोमीटर12 ,18. अब तक, सेसि-एमएस सफलतापूर्वक श्वसन रोगों के निदान में इस्तेमाल किया गया है22, gauging circadian ताल3,6,23, फार्माकोकाइनेटिक्स7,8, और चयापचय रास्ते4, आदिखुलासा हाल ही में, एक वाणिज्यिक सेसि स्रोत उपलब्ध हो गया है ।

इस अध्ययन में, एक सतही और कॉंपैक्ट माध्यमिक nanoelectrospray ionization स्रोत (एसईसी-nanoESI) की स्थापना की और एक उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित किया गया था । साँस में exhaled VOCs की वास्तविक समय माप प्रस्तुत की गई.

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Protocol

सावधानी: उपयोग से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें । कृपया, लैब कोट, दस्ताने, काले चश्मे, पूर्ण लंबाई पैंट और बंद पैर के जूते) उदा, उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण का उपयोग करें ।

1. सेकंड-nanoESI स्रोत सेट करें

  1. सेसि प्रक्रिया के अनुसार एक एसईसी-nanoESI स्रोत सेट करें, अर्थात्, सांस गैस एक electrospray बेर काटना और आरोपी बूंदों (चित्रा 1) द्वारा के लिए शुरू की है । व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में निर्मित स्रोत मास स्पेक्ट्रोमीटर के इंटरफेस पर निर्भर करता है24,25इस्तेमाल किया । यहां, एक वाणिज्यिक nanoESI स्रोत (चित्रा 2) के आधार पर सेकंड-nanoESI स्रोत सेट और एक benchtop quadrupole orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए लागू.
    नोट: स्रोत के मुख्य शरीर एक घन स्टेनलेस स्टील चैंबर (लंबाई 25 मिमी, आईडी 13 मिमी) (चित्रा 2 बी) एक प्रवेश (आईडी 4 मिमी) के साथ चैंबर में nanoESI केशिका परिचय है । इस प्रकार, चैंबर पूरी तरह से सील नहीं है (चित्र बी) ।
  2. दो स्टेनलेस स्टील ट्यूब (लंबाई 8 मिमी, ओडी 5 मिमी, आईडी 3 मिमी) गैस वितरण के लिए चैंबर के प्रत्येक पक्ष पर स्थापित करें ।
  3. दो क्वार्ट्ज खिड़कियां (आईडी 14 मिमी) के ऊपर और नीचे चैंबर के nanoESI केशिका और nanoESI स्प्रे की नोक की स्थिति की जांच करने के लिए या तो आंखों या एक डिजिटल माइक्रोस्कोप से लैस ।
  4. जन स्पेक्ट्रोमीटर के झाडू शंकु को चैंबर वेल्ड ।
    नोट: डिजाइन जन स्पेक्ट्रोमीटर के वायुमंडलीय दबाव अंतरफलक के विशेष ज्यामिति के आधार पर बदल सकते है व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया ।

2. साधन अनुकूलन

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सकारात्मक और नकारात्मक आयन का पता लगाने दोनों मोड में जन स्पेक्ट्रोमीटर जांचना । अंशांकन, मास स्पेक्ट्रोमीटर पैरामीटर, जैसे लेंस क्षमता और पता लगाने की स्थिति के रूप में लागू करके, एक निर्दिष्ट संकल्प मूल्य पर अच्छी संवेदनशीलता और चोटी आकार देने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । यहां पर 70000 का जन संकल्प किया जाता है ।
    1. वाणिज्यिक ईएसआई स्रोत का उपयोग करके पूरा Q सटीक अंशांकन प्रदर्शन; हालांकि, बड़े पैमाने पर अंशांकन अनुकूलित लोगों सहित किसी भी संगत स्रोतों, के साथ किया जा सकता है ।
  2. मास स्पेक्ट्रोमीटर > 100 ° c के आयन स्थानांतरण ट्यूब (ITT) के तापमान सेट करें । हालांकि उच्चतम तापमान 350 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया जा सकता है, यह कुछ यौगिकों के अपघटन में परिणाम हो सकता है । इस प्रकार, 150 ° c इस प्रयोग में प्रयोग किया जाता है ।
    नोट: ITT के बजाय एक नमूना छिद्र की विशेषता जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए, नमूना छिद्र के तापमान > 100 ° c सेट है ।
  3. ईएसआई विलायक और प्रवाह दर के लिए, विलायक के गुणों के आधार पर उपयुक्त ईएसआई विलायक का चयन करें (उदा, ध्रुवीकरण और अस्थिरता) और लक्षित यौगिकों (उदा, प्रोटॉन संबध) । विभिंन अनुपात में पानी और मेथनॉल का एक मिश्रण सामांयतः ईएसआई विलायक25के रूप में इस्तेमाल किया गया है । इस प्रयोग में, 0.1% युक्त पानी का उपयोग करें (वी/वी) फार्मिक एसिड, उच्च ionization दक्षता के लिए इस विलायक13,19,23बताया गया है । 0-1.5 μL/min और 200 nL/min की सीमा में ईएसआई विलायक की प्रवाह दर निर्धारित करें ।
    नोट: उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए Degas ईएसआई विलायक ।
  4. ऑप्टिमाइज़ सेकंड-nanoESI स्रोत पैरामीटर्स, मुख्यतः nanoESI वोल्टेज और nanoESI केशिका टिप स्थिति । वोल्टेज सामांयतः 2.0 से 4.5 केवी पर्वतमाला । यहां 2.5 केवी का उपयोग करें ।
    नोट: उच्च ईएसआई वोल्टेज प्रवाह की दर बढ़ जाती है के रूप में लागू किया जाता है । टिप और मास स्पेक्ट्रोमीटर छिद्र के बीच की दूरी 1 से 5 मिमी समायोजित किया जा सकता है । अनुकूलन के बाद, एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम में मनाया सामान्यीकृत तीव्रता स्तर (NL) होना चाहिए > 1x106 और कुल आयन वर्णलेख की भिन्नता (टिक) दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन का पता लगाने मोड में < 10% होना चाहिए. जन स्पेक्ट्रम और टिक के जन रेंज में प्राप्त कर रहे है m/z 50-750 ।
  5. स्रोत पर शुद्ध गैस लागू करें । यह एक वैकल्पिक कदम है, इनडोर हवा से VOCs के प्रभाव को कम करने पर लक्ष्य है । उच्च शुद्धता नाइट्रोजन गैस (एन2, 99.99%) या शुद्ध हवा का उपयोग किया जा सकता है । शुद्ध गैस की उपस्थिति के साथ, एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम में मनाया NL > 1x105 होना चाहिए और टिक के रूपांतर दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन का पता लगाने मोड में < 10% होना चाहिए । उच्च शुद्धता N2 यहां उपयोग किया जाता है और 0.8 L/
    नोट: शुद्ध गैस और सांस गैस की कुल प्रवाह दर मास स्पेक्ट्रोमीटर के छिद्र के माध्यम से प्रवाह की दर से अधिक होना चाहिए ।

3. exhaled सांस की माप

  1. इनडोर हवा श्वास और एक सामांय समाप्ति प्रदर्शन करने के लिए एक निरंतर प्रवाह की दर पर फेफड़ों में सभी हवा बाहर सांस । मॉनिटर समाप्ति प्रवाह दर या तो एक manometer या एक प्रवाह मीटर से विषय को दिखाई । Teflon (PTFE) टयूबिंग का उपयोग करने के लिए सांस गैस23उद्धार ।
    1. टयूबिंग के अंदर पानी भाप के संघनित्र को रोकने के लिए, $30 के तापमान पर टयूबिंग गर्मी सी7,23,27 या एक Nafion ड्रायर28,29का उपयोग करें । इस प्रयोग में, एक प्रवाह मीटर द्वारा नियंत्रित 0.4 L/मिनट पर विषय exhaled ।
    2. एक Nafion टयूबिंग (लंबाई 60 सेमी) के प्रवाह मीटर के प्रवेश कनेक्ट करने के लिए exhaled सांस में पानी भाप को हटाने और एक PTFE ट्यूबिंग (लंबाई 13 सेमी, आईडी 4 मिमी) के प्रवाह मीटर के आउटलेट से कनेक्ट । यह एक समाप्ति माप के लिए < 30 s लेता है ।
    3. 4-6 दोहराया माप28,29प्रदर्शन ।
    4. reफाउंड्री प्रभाव को कम करने के लिए, खाने, पीने से प्रतिभागियों है, और अपने दांत ब्रश करने के लिए ंयूनतम 30 माप से पहले मिनट23
      नोट: इनडोर हवा से VOCs के प्रभाव को कम करने के लिए, यह इनडोर हवा के बजाय26शुद्ध गैस श्वास की सूचना दी गई है । जब एक Nafion टयूबिंग प्रयोग किया जाता है, कुछ ध्रुवीय यौगिकों खो सकता है ।
    5. माप के दौरान, यदि आयन तीव्रता साधन की रैखिक पहचान सीमा से अधिक है या नहीं की जाँच रखें. संकेत के संतृप्ति नमूना में यौगिक से व्यावहारिक रूप से परिणाम नहीं करता है कि एक विरूपण साक्ष्य के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. नाक के माध्यम से श्वास, परिवेश VOCs और कणों का हिस्सा निकाल दिया जाएगा; हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि नाक के मार्ग में यौगिकों का भी पता लगाया जा सकता है ।

4. एक सांस फिंगरप्रिंट प्राप्त करने और एक यौगिक के एक समय का पता लगाने

  1. chromatograms और मास स्पेक्ट्रा प्राप्त करें । chromatograms और मास स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए सॉफ़्टवेयर (उदा., Xcalibur) का उपयोग करें । क्योंकि यह प्रत्यक्ष एमएस विश्लेषण और कोई क्रोमेटोग्राफिक जुदाई किया जाता है, कुल आयन वर्णलेख (टिक) वास्तव में सभी मास स्पेक्ट्रा में पाया संकेतों और निकाले आयन वर्णलेख (EIC) के समय का पता लगाने का संकेत समय का पता चलता है एक निर्दिष्ट यौगिक ।
    नोट: अन्य वाणिज्यिक मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए, chromatograms और मास स्पेक्ट्रा इसी डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
  2. exhaled सांस मापा जाता है जब टिक में स्कैन के एक नंबर का चयन करके एक exhaled सांस फिंगरप्रिंट प्राप्त करें । एक बड़े पैमाने पर सॉफ्टवेयर द्वारा इन स्कैन के एक औसत का प्रतिनिधित्व स्पेक्ट्रम प्राप्त करें ।
    1. सांस फिंगरप्रिंट से पृष्ठभूमि चोटियों को खत्म करने के लिए, सॉफ्टवेयर में घटाना पृष्ठभूमि उपकरण का उपयोग करें । कृपया निर्माता द्वारा प्रदत्त उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका देखें । संक्षेप में, जब कोई सांस नमूना पेश किया है स्कैन की एक ही संख्या का चयन करें, और सांस फिंगरप्रिंट से पृष्ठभूमि जन स्पेक्ट्रम घटाना ।
      नोट: इस विधि में, सांस फ़िंगरप्रिंट में सुविधाओं की पहचान करने के लिए थ्रेशोल्ड तीन बार पृष्ठभूमि संकेत के मानक विचलन के रूप में परिभाषित किया गया है । अंय वाणिज्यिक जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए, पृष्ठभूमि घटाव इसी डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के द्वारा किया जा सकता है ।
  3. निर्दिष्ट यौगिक का समय ट्रेस प्राप्त करें । सांस फिंगरप्रिंट में एक लक्षित यौगिक के शिखर का चयन करें, और यौगिक के समय का पता लगाने के बाद सॉफ्टवेयर द्वारा अधिग्रहण कर लिया है ।

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Representative Results

चित्रा 3 एम/जेड 50-750 दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन का पता लगाने मोड के तहत दर्ज की जन रेंज में सांस उंगलियों के निशान दिखाता है । 291 चोटियों (पीक तीव्रता > 5.0 x104) और 173 चोटियों (पीक तीव्रता > 3.0 x104), क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक आयन का पता लगाने मोड में पृष्ठभूमि-घटाई सांस उंगलियों के निशान में देखा गया है । मास स्पेक्ट्रा में चोटियों की पहचान करने के लिए, विवरण12,18,24,29के लिए पूर्व प्रकाशनों का उल्लेख करें । संक्षेप में, दोनों अस्थिर चयापचयों और इनडोर हवा से VOCs का पता लगाया गया है । उदाहरण के लिए, m/z ७४.०६०६ (चित्रा 3) पर पीक exhaled n, n-dimethylformamide या aminoactone से मानव Metabolome डेटाबेस (HMDB) के अनुसार परिणाम; m/z ४६२.१४४७ और m/z ५३६.१६३८ (आंकड़ा 3ए) में चोटियों exhaled अमोनिया और polysiloxanes (प्रयोगशाला संदूषण)12के adducts से हैं । सकारात्मक और नकारात्मक आयन का पता लगाने मोड में ठेठ जन सटीकता मूल्यों-4.0-13.5 पीपीएम और-20.3-1.3 पीपीएम, क्रमशः कर रहे हैं । चित्रा 4 इण्डोल के समय का पता लगाने, एक ठेठ अंतर्जात यौगिक है, जो एक विषय से exhaled सांस की छह प्रतिरूपित माप द्वारा पता चला है प्रस्तुत करता है । यह सभी छह माप के लिए कम से 7 मिनट लेता है ।

Figure 1
चित्र 1. exhaled सांस में VOCs के सेसि एमएस विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. (क) एक योजनाबद्ध आरेख और (ख) सेकंड-nanoESI इस प्रयोग में प्रयुक्त स्रोत की एक तस्वीर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. पृष्ठभूमि-घटाया सांस उंगलियों में प्राप्त (a) सकारात्मक और (ख) नकारात्मक आयन का पता लगाने मोड m/z 50-750 की मास रेंज में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एक विषय से exhaled सांस की छह प्रतिरूपित माप द्वारा पता लगाया इण्डोल का समय ट्रेस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक वाणिज्यिक nanoESI स्रोत के आधार पर सेकंड-nanoESI स्रोत का निर्माण, ionization क्षमता है कि एक ईएसआई स्रोत का उपयोग कर की तुलना में अधिक है30. इसके अलावा, ionization दक्षता आगे एक बंद चैंबर में सुधार हुआ है, क्योंकि यह परिवेश पृष्ठभूमि हवा से इस प्रक्रिया को अलग, और एक ही समय में गैस के नमूने और स्प्रे बेर के बीच मिश्रण की सुविधा । एक एसईसी-nanoESI का उपयोग करके, कम मापदंडों के लिए एक ईएसआई स्रोत की तुलना में अनुकूलित करने की आवश्यकता है, यह आसान स्थापना, आवेदन और रखरखाव के लिए बना ।

यदि कोई संकेत नहीं देखा है या संवेदनशीलता काफी कम हो जाती है जब सेकंड-nanoESI-MS द्वारा सांस विश्लेषण प्रदर्शन, एक स्प्रे केशिका टिप की स्थिति की जांच और भी केशिका की नोक पर बूंदों के गठन करना चाहिए । टिप को मास स्पेक्ट्रोमीटर के छिद्र से संरेखित करें । स्प्रे केशिका एक नया एक करने के लिए बदलें यदि छिड़काव और अवरुद्ध टिप दूषित है । अंयथा, जांच करें कि क्या साधन के ITT ब्लॉक या दूषित है । यदि आवश्यक हो तो ITT को बदलें या साफ़ करें । स्प्रे केशिका की जाँच से पहले ईएसआई वोल्टेज बंद कर दें । कमरे के तापमान पर ITT के तापमान सेट और इंतजार जब तक तापमान नीचे चला जाता है ।

सेसि-HRMS को वास्तविक समय सांस विश्लेषण4,6,12के लिए एक संवेदनशील और चयनात्मक तकनीक का प्रदर्शन किया गया है । पिछले कुछ वर्षों में, इस तकनीक को सफलतापूर्वक gauging circadian भिंनता3,6, निगरानी फार्माकोकाइनेटिक्स7,8, चयापचय मार्ग की पहचान5, आदि के लिए लागू किया गया है . हाल ही में, मानव सांस में अमीनो एसिड सफलतापूर्वक किया गया है सेसि द्वारा quantified-MS पहली बार के लिए, जो मात्रात्मक विश्लेषण में उल्लेखनीय प्रगति है5. आगे की जांच के साथ, सेसि-HRMS खुद को एक उपयोगी और कुशल इनवेसिव नैदानिक पद्धति के रूप में स्थापित कर सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (No. ९१५४३११७) ने आर्थिक रूप से समर्थन दिया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultrapure water Merck Millipore, USA MPGP04001 Resistance >18.2 MΩ·cm
Formic acid Sigma-Aldrich, USA F0507 Corrosive to the respiratory tract.
Nitrogen gas Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China N.A.a Purity >99.99%
Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific, USA 02634L(S/N) Beware of high voltage and high temperature
NanoESI source Thermo Scientific, USA ES002373(S/N); ES071(P/N) Beware of high voltage and high temperature
Nano LC pump Thermo Scientific, USA 5041.0010A(P/N) /
Xcalibur software (Version 3.0) Thermo Scientific, USA BRE0008596 /
Dino-Lite Digital Microscope Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China CQ401833R(S/N) /
Nafion tubing Perma Pure LLC, USA ME60 /
PTFE tubing (I.D. 4 mm) Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China N.A. Beware of the possible loss of polar compounds
Mass flow controller Line-Tech, Korea M15122007 (S/N) /
Flow meter Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China 40784 /
aN.A.: not available.

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Li, X., Huang, D. D., Du, R., Zhang, More

Li, X., Huang, D. D., Du, R., Zhang, Z. J., Chan, C. K., Huang, Z. X., Zhou, Z. Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (133), e56465, doi:10.3791/56465 (2018).

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