Summary
고 분해능 질량 분석 시연 보조 nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간으로 exhaled 호흡의 화학 성분 특성화에 대 한 프로토콜 결합.
Abstract
비-침략 적 방식으로 질병 진단과 환경 노출에 대 한 생체로 사용할 수 있습니다 이후 exhaled 휘발성 유기 화합물 (Voc) 상당한 관심을 자극 했습니다. 이 작품에서 선물이 고 분해능 질량 분석 (초-nanoESI-HRMS)에 결합 하는 보조 nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간으로 exhaled Voc를 특성화 하는 프로토콜. 수 제 초-nanoESI 소스로 쉽게 세워졌다 기반 상용 nanoESI 소스에. 봉우리의 수백 exhaled 호흡의 배경 뺀 질량 스펙트럼에서 관찰 되었다 그리고 대량 정확도 값은-4.0-13.5 ppm와-20.3-긍정적이 고 부정적인 이온 검출 모드에서 1.3 ppm 각각. 봉우리는 정확한 질량 동위 원소 패턴에 따라 정확한 원소 구성으로 할당 되었다. 30 s 한 증발 기 측정에 사용 되 고 6 복제 된 측정에 대 한 약 7 분 소요.
Introduction
현대 분석 기술의 빠른 개발, 휘발성 유기 화합물 (Voc)의 수백 인간의 exhaled 호흡1에서 확인 되었습니다. 이러한 Voc 치경 공기 (건강 한 성인에 대 한 ~ 350 mL)에서 주로 발생 하 고 해부학 죽은 공간 공기 (~ 150 mL)2, 신체 대사3,,45,6,7에 의해 영향을 받는 ,8 , 환경 오염9, 각각. 결과적으로, 식별,이 Voc 질병 진단과 환경 노출에 대 한 비-침략 적 방식으로 생체로 사용 될 것을 약속 하는.
가스 크로마토그래피 질량 분석 (GC-MS)은 가장 널리 사용 되는 기술 exhaled Voc2의 정성 및 정량 분석을 위해, 실시간 호흡 분석을 위해 개발 되었습니다, 직접 MS 기술을의 장점 높은 시간 해상도 및 간단한 샘플 사전 준비입니다. 직접 MS 기술, 양성자 이전 반응 MS (PTR-MS)10, 같은 선택 이온 흐름 관 석사 (선별-석사)11, 보조 분무 이온화 MS (SESI-MS)12,13 (또한 추출 물 분무로 라는 MS, MS EESI14,15이온화) 추적 대기 가스 분석기 (타가)16 및 플라즈마 이온화 MS (PI-MS)17 는 조사에서 최근 몇 년 동안.
모든 직접 MS 기술, 중 SESI 보편적인 부드러운 이온화 기술19,20,21;로 유명 하다 그리고 소스는 쉽게 사용자 지정 하 여 질량 분석기, 예를 들면, 시간의 비행 질량 분 서 계8,15의 다른 종류를 결합, 이온 트랩 질량 분석기14 그리고 orbitrap 질량 분석기12 ,18. 지금까지, SESI MS는 성공적으로 사용 되었다 호흡기 질환22, 진단 circadian 리듬3,,623, 약 동학7,8, 측정 및 대사 경로4, 등을 밝히고 있다. 가장 최근에, 상업 SESI 소스 사용할 수 있게 했다.
이 연구에서 손쉬운 소형 보조 nanoelectrospray 이온화 소스 (초-nanoESI) 설정 하 고 고해상도 질량 분석기를 결합 했다. 호흡에 exhaled Voc의 실시간 측정을 제시 했다.
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Protocol
주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 사용 하십시오 적절 한 개인 보호 장비, 예를 들면, 실험실 외 투, 장갑, 고글, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발).
1. 초-nanoESI 소스를 설정
- SESI 과정, 즉에 따르면 Sec nanoESI 소스를 설정 호흡 가스는 분무 깃털 교차 고 충전된 물방울 (그림 1)에 의해 이온화. 개별 실험실에 내장 된 소스 사용 하는 질량 분석기24,25인터페이스에 따라 다릅니다. 여기, 상용 nanoESI 소스 (그림 2)에 따라 Sec nanoESI 소스를 설정 하 고 벤치탑 4 중 극 orbitrap 질량 분석기를 구현 합니다.
참고: 소스의 본체는 입방 스테인레스 스틸 챔버 (길이 25 m m, 아이디 13 m m) (그림 2b) 챔버로 nanoESI 모 세관을 소개 하는 입구 (아이디 4 m m)와 함께. 따라서, 챔버 하지 않습니다 완전히 봉인 (그림 2b). - 가스 배달에 대 한 챔버의 각 측면에 두 개의 스테인레스 스틸 튜브 (길이 8 m m, 마약 5 m m, 아이디 3 m m)를 설치 합니다.
- NanoESI 모 세관의 눈 또는 디지털 현미경 nanoESI 스프레이 팁의 위치를 확인 하는 챔버의 위아래에 두 석 영 창 (아이디 14 m m)를 장비.
- 질량 분석기의 스윕 콘 챔버 용접.
참고: 디자인 개별 실험실에서 사용 하는 질량 분석기의 대기압 인터페이스의 특정 형상에 따라 변경할 수 있습니다.
2. 악기 최적화
- 제조업체의 지침에 따라 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 검출 모드에서 질량 분 서 계를 보정. 보정을 적용 하 여 렌즈 잠재력 검색 조건과 같은 질량 분석기 매개 변수를 지정 된 해상도 값에 좋은 감도 및 피크 모양에 게 최적화 되어 있다. 70000의 대량 해상도 여기에 사용 됩니다.
- 상업적인 ESI 소스;를 사용 하 여 완전 한 Q Exactive 교정 수행 그러나, 사용자 지정을 포함 하 여 모든 호환 소스와 질량 보정을 수행할 수 있습니다.
- 이온 이동 관 (ITT) 질량 분석기 > 100 ° c의 온도 설정 350 ° C에서 최고 온도 설정할 수 있습니다, 하지만 그것은 몇 가지 화합물의 분해 될 수 있습니다. 따라서, 150 ° C이이 실험에 사용 됩니다.
참고: ITT 대신 샘플링 구멍을 특징으로 하는 질량 분석기에 대 한 샘플링 구멍의 온도 설정 > 100 ° c. - ESI 용 매 및 흐름 속도 대 한 용 매 (예를 들어, 극성 및 변동)과 대상된 화합물 (예를 들어, 양성자 선호도)의 속성에 근거 하 여 적절 한 ESI 용 매를 선택 합니다. 물과 다양 한 비율에서 메탄올의 혼합물은 ESI 용 매25으로 일반적으로 사용 되었습니다. 이 실험에서는 물이 용 매13,,1923보고 위한 높은 이온화 효율은 0.1% (v/v) 포 름 산을 포함 하. ESI 용 매 유량 0-1.5의 범위에서 설정 μ/min와 200 nL/분.
참고: 드가 ESI 사용 하기 전에 30 분 용 매. - 초-nanoESI 소스 매개 변수, 주로 nanoESI 전압 및 nanoESI 모 세관 팁 위치를 최적화 합니다. 전압 일반적으로 범위는 2.0에서 4.5 kV. 여기 사용 2.5 kV입니다.
참고: ESI 전압 높은 흐름 속도 증가으로 적용 됩니다. 팁과 질량 분석기 구멍 사이의 거리는 5 m m 1에서 조정할 수 있습니다. 최적화, 후 질량 스펙트럼에서 관찰 된 정규화 된 강도 수준 (NL) > 1 x 10 해야6 및 총 이온 크로마 (TIC)의 유사 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 검출 모드에서 < 10% 이어야 한다. 질량 스펙트럼 및 TIC m/z 50-750의 질량 범위에서 얻을 수 있습니다. - 가스 소스에 적용 됩니다. 이 실내 공기에서 VOCs의 영향을 줄이는 목표로 단계는 선택적입니다. 고 순도 질소 가스 (N2, 99.99%) 또는 순수한 공기를 사용할 수 있습니다. 순수 가스의 존재와 질량 스펙트럼에서 관찰 하는 NL > 1 x 10 해야5 와 TIC의 변화 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 검출 모드에서 < 10% 이어야 한다. 고 순도 N2 는 여기에 사용 되 고 0.8 L/분 전달.
참고: 순수한 가스와 호흡 가스의 총 유량 질량 분석기의 구멍을 통해 유량 보다 높아야 한다.
3입니다. exhaled 호흡의 측정
- 실내 공기를 흡입 하 고 일정 한 유량에서 폐의 모든 공기를 밖으로 호흡 하는 정상적인 증발 기를 수행 합니다. 증발 기 유량을 압력 계 또는 유량 주제를 볼 수를 모니터링 합니다. 테 프 론 (PTFE) 튜브를 사용 하 여 호흡 가스23제공.
- 튜브 안에 수증기의 응축을 방지 하기 위해, 80-100 oC7,,2327 의 온도에 튜브가 열 하거나29Nafion 드라이어28,사용 합니다. 이 실험에서 주제 exhaled 0.4 L/분의 유량 계에 의해 제어.
- PTFE 튜브 (길이 13 ㎝, 아이디 4 m m)에 exhaled 호흡에서 수증기를 제거 하 고 흐름 미터의 콘센트를 연결 하는 Nafion 튜브 (길이 60 cm)를 유량의 입구를 연결 합니다. 그것은 하나의 증발 기 측정에 대 한 < 30 s를 걸립니다.
- 4-6 복제 측정28,29를 수행 합니다.
- 혼란 효과 최소화 하기 위해 참가자 들이 먹고, 마시고, 그리고 측정23전에 그들의 이빨 적어도 30 분을 솔 질에서 있다.
참고: 실내 공기에서 VOCs의 영향을 최소화 하기 위해 실내 공기26대신 가스를 흡입 보고 되었습니다 그것은. Nafion 튜빙을 사용 하는 경우 일부 극 지 화합물 손실 될 수 있습니다. - 측정, 동안 이온 강도 여부는 악기의 선형 검출 한계를 초과 하는 경우 확인 하십시오. 채도 신호의 샘플에서 화합물에서 실질적으로 발생 하지 않는 한 유물 피크 발생할 수 있습니다. 코를 통해 흡입, 주변 Voc 및 입자의 일부 제거 될 것 이다; 그러나, 그것은 주목할 만한 비 강에 화합물도 검색 될 수 있습니다.
4. 구하는 호흡 지문 및 화합물의 시간 추적
- Chromatograms 및 질량 스펙트럼을 얻을. 소프트웨어 (예: Xcalibur) 기록 chromatograms 및 질량 스펙트럼을 사용 합니다. 때문에 이것이 직접 MS 분석 크로마 분리를 수행, 총 이온 크로마 (TIC) 실제로 질량 스펙트럼에서 검색 된 모든 신호의 시간 추적을 나타냅니다 추출된 이온 크로마 (EIC) 표시의 시간 추적 한 지정 된 화합물입니다.
참고: 다른 상업 질량 분석기에 대 한 chromatograms 및 질량 스펙트럼 얻어질 수 있다 해당 데이터 수집 소프트웨어에 의해. - Exhaled 호흡 지문 exhaled 호흡 측정 때 TIC의 다양 한 검사를 선택 하 여 얻을. 이러한 검사의 평균을 대표 하는 소프트웨어에 의해 질량 스펙트럼을 얻을.
- 호흡 지문에서 배경 봉우리를 제거 하려면 배경 빼기 도구를 사용 하 여 소프트웨어에. 제조업체에서 제공한 설명서를 참조 하십시오. 간단 하 게, 아니 숨 샘플 도입 되어 검사의 동일한 수를 선택 하 고 빼기 호흡 지문에서 배경 질량 스펙트럼.
참고:이 방법에서는, 호흡 지문에 기능을 식별 하기 위해 임계값 세 번 배경 신호의 표준 편차로 정의 됩니다. 다른 상업 질량 분석기에 대 한 해당 데이터 수집 소프트웨어에 의해 배경 빼기를 수행할 수 있습니다.
- 호흡 지문에서 배경 봉우리를 제거 하려면 배경 빼기 도구를 사용 하 여 소프트웨어에. 제조업체에서 제공한 설명서를 참조 하십시오. 간단 하 게, 아니 숨 샘플 도입 되어 검사의 동일한 수를 선택 하 고 빼기 호흡 지문에서 배경 질량 스펙트럼.
- 지정 된 화합물의 시간 추적을 가져옵니다. 호흡 지문에 대상된 화합물의 피크를 선택 하 고 화합물의 시간 추적 소프트웨어에 의해 연속적으로 취득 된다.
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Representative Results
그림 3 m/z 50-750 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 검출 모드에서 기록의 대량 범위에 숨 지를 보여준다. 291 봉우리 (피크 강도 > 5.0x104) 173 봉우리 (피크 강도 > 3.0x104) 긍정적이 고 부정적인 이온 검출 모드에서 배경 빼고 숨 지문에 각각 관찰 되었습니다. 질량 스펙트럼에 봉우리를 식별 하려면 세부 정보12,18,,2429에 대 한 사전 게시를 참조 하십시오. 간단히, 휘발성 대사 산물 및 Voc 실내 공기에서 발견 되었습니다. 예를 들어 (그림 3a) m/z 74.0606에 피크 exhaled N, N-dimethylformamide 또는 aminoactone에는 인간의 대사체 데이터베이스 (HMDB);에서 결과 m/z 462.1447 및 m/z 536.1638 (그림 3a)에서 봉우리는는 adducts exhaled 암모니아와 polysiloxanes (실험실 오염 물질)12. 긍정적이 고 부정적인 이온 검출 모드의 전형적인 대량 정확도 값은-4.0-13.5 ppm와-20.3-1.3 p p m, 각각. 그림 4 indole, 하나의 주제에서 exhaled 호흡의 6 개의 복제 된 측정에 의해 감지 되는 전형적인 내 인 성 화합물의 시간 추적을 제공 합니다. 그것은 모든 6 개 측정 미만 7 분 걸립니다.
그림 1. Exhaled 호흡에 Voc의 SESI MS 분석을 위한 회로도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. (a) 회로도 그리고 (b)이이 실험에 사용 된 초 nanoESI 소스의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. 배경 빼기 호흡 지문 획득 긍정 (a)와 (b)에서 m/z 50-750의 대량 범위에 부정적인 이온 검출 모드 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. 시간 추적 indole exhaled 호흡 한 주제에서 6 복제 된 측정에 의해 감지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Sec-nanoESI 소스 상용 nanoESI 원본을 기반 구축, 이온화 효율 ESI 소스30을 사용 하 여 보다 높은 수준 이다. 또한, 이온화 효율은 더욱 향상 닫힌된 챔버에 프로세스 분리로 주위 배경 공기에서와 같은 시간을 용이 하 게 가스 샘플 스프레이 깃털 사이 혼합. 초-nanoESI를 사용 하 여 덜 매개 변수는 ESI 소스, 쉽게 설치, 응용 프로그램 및 유지 보수에 비해 최적화가 필요 합니다.
신호가 관찰 또는 감도 감소 크게 초-nanoESI-MS에 의해 호흡 분석을 수행할 때, 하나 스프레이 모 세관 팁의 위치와 또한 모 세관의 끝에 물방울의 형성을 확인 해야 합니다. 질량 분석기의 구멍 끝을 맞춥니다. 스프레이 모 세관 차단 또는 팁을 오염 하는 경우 새로운 스프레이 모 세관을 변경 합니다. 그렇지 않으면, 악기의 ITT 차단 되거나 오염 여부를 확인 합니다. 교체 또는 필요한 경우는 ITT 청소. 해제 ESI 전압 스프레이 검사 하기 전에 모 세관. 실내 온도에 ITT의 온도 설정 하 고 온도 떨어질 때까지 기다립니다.
SESI HRMS 실시간 호흡 분석4,,612민감하고 선택적 기술 입증 되었습니다. 지난 몇 년 동안에서이 기술은 성공적으로 적용 된 게이지 circadian 변화3,6, 모니터링 약 동학7,8, 식별 대사 경로5, 등 . 최근에, 인간의 호흡에 아미노산 있다 되었습니다 성공적으로 정량 SESI MS에 의해 정량 분석5놀라운 진행은 처음으로. 추가 조사와 함께 SESI HRMS 유용 하 고 효율적인 비 침 투 적인 임상 방법으로 자신을 설정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (No. 91543117)에 의해 재정적으로 지원 되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrapure water | Merck Millipore, USA | MPGP04001 | Resistance >18.2 MΩ·cm |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Corrosive to the respiratory tract. |
| Nitrogen gas | Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China | N.A.a | Purity >99.99% |
| Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific, USA | 02634L(S/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| NanoESI source | Thermo Scientific, USA | ES002373(S/N); ES071(P/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| Nano LC pump | Thermo Scientific, USA | 5041.0010A(P/N) | / |
| Xcalibur software (Version 3.0) | Thermo Scientific, USA | BRE0008596 | / |
| Dino-Lite Digital Microscope | Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China | CQ401833R(S/N) | / |
| Nafion tubing | Perma Pure LLC, USA | ME60 | / |
| PTFE tubing (I.D. 4 mm) | Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China | N.A. | Beware of the possible loss of polar compounds |
| Mass flow controller | Line-Tech, Korea | M15122007 (S/N) | / |
| Flow meter | Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China | 40784 | / |
| aN.A.: not available. |
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