Summary
Ett protokoll för karakterisera kemiska sammansättningen av utandningsluften i realtid med hjälp av sekundära nanoelectrospray jonisering kopplat till hög upplösning masspektrometri demonstreras.
Abstract
Utandade flyktiga organiska föreningar (VOC) har väckt stort intresse, eftersom de kan fungera som biomarkörer för sjukdomsdiagnos och miljömässig exponering på ett icke-invasivt sätt. I detta arbete presenterar vi ett protokoll för att karakterisera de utandade flyktiga organiska föreningar i realtid med hjälp av sekundära nanoelectrospray jonisering kopplat till hög upplösning masspektrometri (SEK-nanoESI-HRMS). Hemmagjord Sec-nanoESI källan inrättades lätt baserat på en kommersiell nanoESI källa. Hundratals toppar observerades i de bakgrunden-subtraheras masspektra av utandningsluften, och massa noggrannhet värdena är -4,0-13,5 ppm och -20,3-1,3 ppm i de positiva och negativa jonen upptäckt lägen, respektive. Topparna tilldelades med korrekt elementärt sammansättning enligt korrekt massa och isotopiska mönster. Mindre än 30 s används för en utandning mätning, och det tar ca 7 min för sex replikerade mätningar.
Introduction
Med snabb utveckling av moderna analystekniker, har hundratals flyktiga organiska föreningar (VOC) identifierats i human utandningsluften1. Dessa VOC resultera mestadels från alveolär luft (~ 350 mL för en frisk vuxen) och anatomiska dödvolymen air (~ 150 mL)2, som påverkas av kroppens ämnesomsättning3,4,5,6,7 ,8 och miljöföroreningar9, respektive. Som ett resultat, om identifierade, är dessa flyktiga organiska föreningar lovande att användas som biomarkörer för sjukdomsdiagnos och miljömässig exponering på ett icke-invasivt sätt.
Även om gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) är den mest använda tekniken för kvalitativ och kvantitativ analys av utandad VOC2, direkt MS-tekniker, som har utvecklats för realtid andedräkt analys, har fördelarna med hög tid upplösning och enkel provberedning före. Direkt MS-tekniker, såsom proton överföring reaktion MS (PTR-MS)10, valt ion flöde tube MS (SIFT-MS)11, sekundära elektrospray jonisering MS (SESI-MS)12,13 (också benämn så utvinningsindustrin elektrospray jonisering MS, EESI-MS14,15), spåra atmosfärisk gas analyzer (TAGA)16 och plasma jonisering MS (PI-MS)17 har undersökts i senaste åren.
Bland alla de direkta MS teknikerna är SESI välkänd som en universell mjuk jonisering teknik19,20,21. och källan är lätt att anpassas och kopplat till olika typer av masspektrometrar, t.ex., tidpunkten för flygning masspektrometer8,15, ion trap mass spectrometer14 och orbitrap masspektrometer12 ,18. Hittills SESI-MS har framgångsrikt använts för att diagnostisera sjukdomar i andningsorganen22, mäta dygnsrytmen3,6,23, farmakokinetik7,8, och avslöjande metaboliska vägar4, etc. Nyligen, en kommersiell SESI källa har blivit tillgänglig.
I denna studie en lättköpt och kompakt sekundära nanoelectrospray jonisering källa (Sec-nanoESI) inrättades och kopplad till en högupplöst masspektrometer. Realtids mätningar av utandade flyktiga organiska föreningar i andetag presenterades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Använd lämplig personlig skyddsutrustning, t.ex., labbrock, handskar, full längd byxor, stängd tå skor).
1. Ange källa för Sec-nanoESI
- Ställa in en Sec-nanoESI källa enligt SESI processen, dvsandedräkt gasen för att överlappa en elektrospray plume och joniserat av laddade droppar (figur 1). De källor som byggdes enskilda labs beror på gränssnittet för masspektrometer används24,25. Här, ange Sec-nanoESI källa baserat på en kommersiell nanoESI källa (figur 2) och genomföra till en bänkmonterade quadrupole orbitrap masspektrometer.
Obs: Huvuddelen av källan är en kubik rostfritt stål kammare (längd 25 mm, I.D. 13 mm) (figur 2b) med ett inlopp (I.D. 4 mm) att införa nanoESI kapillären in i kammaren. Kammaren är alltså inte helt tät (figur 2b). - Installera två rostfria rör (längd 8 mm, ytterdiameter 5 mm, innerdiameter 3 mm) på varje sida av kammaren för gas leverans.
- Utrusta två kvartar windows (I.D. 14 mm) på toppen och botten av kammaren för att kontrollera placeringen av spetsen på den nanoESI kapillär och nanoESI spray varken ögon eller en digital Mikroskop.
- Svetsa kammaren att sopa konen av masspektrometer.
Obs: Design kan ändras beroende på lufttrycket gränssnittet för den masspektrometer som används i enskilda labs särskilda geometri.
2. instrument optimering
- Kalibrera masspektrometer i både positiva och negativa jonen upptäckt lägen enligt tillverkarens anvisningar. Genom att tillämpa kalibrering, är masspektrometer parametrar, såsom objektivet potential och upptäcka förhållanden, optimerade för att ge bra känslighet och topp form till en angiven upplösningsvärde. 70000 massa upplösning används här.
- Utföra fullständig Q Exactive kalibreringar med kommersiella ESI källan; massa kalibrering kan dock utföras med alla kompatibla källor, inklusive anpassade sådana.
- Ställa in temperaturen av ion överföringsröret (ITT) av masspektrometer > 100 ° C. Även om den högsta temperaturen kan ställas in vid 350 ° C, kan det resultera i nedbrytning av vissa föreningar. Således är 150° C används i detta experiment.
Obs: För de masspektrometrar med strypmunstycke provtagning i stället för ITT, temperaturen på provtagning öppningen ligger > 100 ° C. - För ESI lösningsmedel och flöde, Välj lämplig ESI lösningsmedlet på grundval av egenskaper av lösningsmedel (t.ex., polaritet och volatilitet) och riktade föreningar (t.ex., proton affinitet). En blandning av vatten och metanol i olika nyckeltal har vanligen använts som ESI lösningsmedel25. I detta experiment, använda vatten innehållande 0,1% (v/v) myrsyra, för hög jonisering effektivitet har varit rapporterade detta lösningsmedel13,19,23. Ställa in flödet klassar av ESI lösningsmedel i intervallet 0-1.5 μL/min och 200 nL/min.
Obs: Degas ESI lösningsmedel för 30 min innan användning. - Optimera Sec-nanoESI källa parametrar, främst nanoESI spänning och nanoESI kapillär tip position. Spänningen varierar vanligen från 2.0 till 4,5 kV. Användning 2,5 kV här.
Obs: Högre ESI spänning som de flödet ökar. Avståndet mellan spetsen och masspektrometer öppningen kan justeras från 1 till 5 mm. Efter optimering, normaliserade intensitetsnivån (NL) observerades i masspektrum bör vara > 1 x 106 och variationen av totala ion kromatogrammet (TIC) bör vara < 10% i både positiva och negativa jonen upptäckt lägen. De masspektrum och TIC erhålls massa mellan m/z 50-750. - Tillämpa ren gas till källan. Detta är ett valfritt steg, som syftar till att minska påverkan av VOC från inomhusluften. Hög renhet kvävgas (N2, 99,99%) eller ren luft kan användas. Med närvaron av ren gas, NL observerats i masspektrum bör vara > 1 x 105 och variationen av TIC bör vara < 10% i både positiva och negativa jonen upptäckt lägen. Hög renhet N2 används här och levereras på 0,8 L/min.
Obs: Det totala flödet av ren gas och andedräkt gas bör vara högre än flödet genom öppningen av masspektrometer.
3. mätning av utandningsluften
- Andas in luften och utföra en normal utandning andas ut all luft i lungorna vid en konstant flödeshastighet. Övervaka utandning flödet antingen genom en manometer eller en flödesmätare som är synliga för ämnet. Använd Teflon (PTFE) slangar för att leverera den andedräkt gas23.
- För att förhindra kondensering av vattenånga inuti slangen, värme slangen vid en temperatur på 80-100 oC7,23,27 eller använda en Nafion torktumlare28,29. I detta experiment utandad föremål vid 0,4 L/min kontrolleras av en flödesmätare.
- Anslut inloppet av flödesmätaren till en Nafion slangar (längd 60 cm) ta bort vattenånga i utandningsluften och Anslut uttaget av flödesmätaren till en PTFE-slangen (längd 13 cm, innerdiameter 4 mm). Det tar < 30 s för en utandning mätning.
- Utföra 4-6 replikerade mätningar28,29.
- För att minimera störande effekter, har deltagare från äta, dricka och borsta deras tänder minst 30 min före den mätningar23.
Obs: För att minimera påverkan av VOC från inomhusluften, det har rapporterats att andas in ren gas istället för inomhusluft26. När en Nafion slangar används, förloras en del polära föreningar. - Under mätningen, hålla kontroll om ion intensiteten överstiger linjär detektionsgränsen instrumentet eller inte. Mättnad av signal kan leda till en artefakt topp som praktiskt taget inte resulterar från föreningen i provet. Genom att andas in genom näsan, tas en del av omgivande flyktiga organiska föreningar och partiklar bort; Det är dock anmärkningsvärt att föreningar i näsgångarna också kan upptäckas.
4. Skaffa ett andetag fingeravtryck och en tid spårning av en förening
- Erhålla kromatogram och masspektrum. Använda programvara (t.ex. Xcalibur) att registrera kromatogrammen och masspektrum. Eftersom detta är direkt MS analys och ingen kromatografisk separation utförs, totala ion kromatogrammet (TIC) faktiskt indikerar tid tracen av alla de signaler som upptäckts i masspektra och extraherade ion kromatogrammet (EIC) visar tid tracen av en angivna förening.
Obs: För andra kommersiella masspektrometrar, kromatogram och masspektrum kan erhållas av programvaran förvärvet motsvarande data. - Skaffa en utandningsluften fingeravtryck genom att välja ett antal skanningar i TIC när utandningsluften mäts. Erhålla masspektrum som representerar ett genomsnitt av dessa skanningar av programvaran.
- För att eliminera bakgrund toppar från andedräkt fingeravtrycket, verktyget subtrahera bakgrunden i programvaran. Vänligen se den bruksanvisning som tillhandahålls av tillverkaren. I korthet, Välj samma antal skanningar när ingen utandningsprov införs och subtrahera bakgrunden massa spektrumet från andedräkt fingeravtrycket.
Obs: Den här metoden tröskeln för att identifiera funktionerna i andedräkt fingeravtrycket definieras som tre gånger standardavvikelsen för bakgrunden signalen. För andra kommersiella masspektrometrar, kan bakgrunden subtraktion utföras av programvaran förvärvet motsvarande data.
- För att eliminera bakgrund toppar från andedräkt fingeravtrycket, verktyget subtrahera bakgrunden i programvaran. Vänligen se den bruksanvisning som tillhandahålls av tillverkaren. I korthet, Välj samma antal skanningar när ingen utandningsprov införs och subtrahera bakgrunden massa spektrumet från andedräkt fingeravtrycket.
- Få en tid spårning av en angiven förening. Markera toppen av en målinriktad förening i andedräkt fingeravtrycket och tid tracen av föreningen förvärvas därefter av programvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar andedräkt fingeravtryck till massa mellan m/z 50-750 registrerats under både positiva och negativa jonen upptäckt lägen. 291 toppar (peak intensitet > 5.0x104) och 173 toppar (peak intensitet > 3.0x104) har observerats i bakgrunden-subtraheras andedräkt fingeravtryck i positiva och negativa jonen upptäckt lägen, respektive. För att identifiera toppar i masspektrum, hänvisas till tidigare publikationer för detaljer12,18,24,29. I korthet, har både flyktiga metaboliter och flyktiga organiska föreningar från inomhusluften upptäckts. Till exempel resultat toppen vid m/z 74.0606 (figur 3a) från utandad N, N-dimetylformamid eller aminoactone enligt mänskliga bröstmjölkssammansättningen databas (HMDB); topparna på m/z 462.1447 och m/z 536.1638 (figur 3a) är från den addukter utandad ammoniak och polysiloxanes (laboratorium föroreningar)12. Typiska massa noggrannhet värdena i positiva och negativa jonen upptäckt lägen är -4,0-13,5 ppm och -20,3-1,3 ppm, respektive. Figur 4 presenterar tid tracen av indol, en typisk endogena förening, som detekteras av sex replikerade mätningar av utandningsluften från ett ämne. Det tar mindre än 7 min för alla sex mätningar.
Figur 1. Principschema för SESI-MS analys av flyktiga organiska föreningar i utandningsluften. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. (a) Schematisk bild och (b) ett foto av Sec-nanoESI källa används i detta experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bakgrund-subtraheras andedräkt fingeravtryck erhållits i (a) positiva och (b) negativ jon upptäckt lägen till massa mellan m/z 50-750. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Tid spår av indol påvisas med sex replikerade mätningar av utandningsluften från ett ämne. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstruera Sec-nanoESI källan utifrån en kommersiell nanoESI källa, är jonisering effektiviteten högre än med en ESI källa30. Dessutom jonisering effektiviteten förbättras ytterligare i en sluten kammare, som det isolerar processen från omgivande bakgrunden luften och vid samma tid underlättar blandning mellan gas urvalet och spray plymen. Genom att använda en Sec-nanoESI, behöver mindre parametrar optimeras jämfört med en ESI källa, vilket gör det lättare för installation, ansökan och underhåll.
Om ingen signal observeras eller känsligheten minskar betydligt när du utför andningen analys av Sec-nanoESI-MS, bör man kontrollera positionen för spray kapillär spets och även bildandet av droppar på spetsen av kapillären. Justera toppen med öppningen av masspektrometer. Ändra spray kapillären till en ny om spray kapillären är blockerad eller spetsen är kontaminerade. Annars, kontrollera om ITT av instrumentet är blockerad eller förorenade. Byt ut eller rengör ITT om det behövs. Stäng av ESI spänning innan Kontrollera sprayen kapillär. Ställa in temperaturen på ITT i rumstemperatur och vänta tills temperaturen sjunker.
SESI-HRMS har visat sig vara en känslig och selektiv teknik för realtid andedräkt analys4,6,12. I de senaste åren, har denna teknik tillämpats framgångsrikt att mäta dygnsrytm variation3,6, övervakning farmakokinetiken7,8, identifierande metaboliska vägar5, etc . Sistone, har aminosyror i människors andetag framgångsrikt kvantifierats genom SESI-MS för första gången, vilket är anmärkningsvärda framsteg i kvantitativ analys5. Med ytterligare utredningar, kunde SESI-HRMS etablera sig som en användbar och effektiv noninvasiv kliniska metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete har fått ekonomiskt stöd av National Natural Science Foundation i Kina (nr. 91543117).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrapure water | Merck Millipore, USA | MPGP04001 | Resistance >18.2 MΩ·cm |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Corrosive to the respiratory tract. |
| Nitrogen gas | Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China | N.A.a | Purity >99.99% |
| Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific, USA | 02634L(S/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| NanoESI source | Thermo Scientific, USA | ES002373(S/N); ES071(P/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| Nano LC pump | Thermo Scientific, USA | 5041.0010A(P/N) | / |
| Xcalibur software (Version 3.0) | Thermo Scientific, USA | BRE0008596 | / |
| Dino-Lite Digital Microscope | Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China | CQ401833R(S/N) | / |
| Nafion tubing | Perma Pure LLC, USA | ME60 | / |
| PTFE tubing (I.D. 4 mm) | Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China | N.A. | Beware of the possible loss of polar compounds |
| Mass flow controller | Line-Tech, Korea | M15122007 (S/N) | / |
| Flow meter | Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China | 40784 | / |
| aN.A.: not available. |
References
- De Lacy Costello, B., et al. A review of the volatiles from the healthy human body. J. Breath Res. 8 (1), 014001-014030 (2014).
- Phillips, M., Greenberg, J. Ion-trap detection of volatile organic compounds in alveolar breath. Clin. Chem. 38 (1), 60-65 (1992).
- Martínez-Lozano Sinues, P., et al. Circadian variation of the human metabolome captured by real-time breath analysis. PLoS One. 9 (12), 0114422-0114438 (2014).
- Garcia-Gomez, D., et al. Secondary electrospray ionization coupled to high-resolution mass spectrometry reveals tryptophan pathway metabolites in exhaled human breath. Chem. Common. 52 (55), 8526-8528 (2016).
- Garcia-Gomez, D., et al. Real-time quantification of amino acids in the exhalome by secondary electrospray ionization-mass spectrometry: A proof-of-principle Study. Clin. Chem. 62 (9), 1230-1237 (2016).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Brown, S. A., Zenobia, R., Dallmann, R. Gauging circadian variation in ketamine metabolism by real-time breath analysis. Chem. Common. 53 (14), 2264-2267 (2017).
- Gamez, G., et al. Real-time, in vivo monitoring and pharmacokinetics of valproic acid via a novel biomarker in exhaled breath. Chem. Common. 47 (17), 4884-4886 (2011).
- Li, X., et al. Drug pharmacokinetics determined by real-time analysis of mouse breath. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (27), 7815-7818 (2015).
- Amorim, L. L. A., Cardeal, Z. L. Breath air analysis and its use as a biomarker in biological monitoring of occupational and environmental exposure to chemical agents. J. Chromatogr. B. 853 (1-2), 1-9 (2007).
- Bajtarevic, A., et al. Noninvasive detection of lung cancer by analysis of exhaled breath. BMC Cancer. 9, 348 (2009).
- Smith, D., Wang, T. S., Pysanenko, A., Španěl, P. A selected ion flow tube mass spectrometry study of ammonia in mouth- and nose-exhaled breath and in the oral cavity. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22 (6), 783-789 (2008).
- Li, X., Huang, L., Zhu, H., Zhou, Z. Direct human breath analysis by secondary nano-electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry: Importance of high mass resolution and mass accuracy. Rapid Commun. Mass Spectrom. 31 (3), 301-308 (2017).
- Martínez-Lozano, P., Fernandez de la Mora, J. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265 (1), 68-72 (2007).
- Zeng, Q., et al. Detection of creatinine in exhaled breath of humans with chronic kidney disease by extractive electrospray ionization mass spectrometry. J. Breath Res. 10 (1), 016008-016015 (2016).
- Chen, H. W., Wortmann, A., Zhang, W. H., Zenobi, R. Rapid in vivo fingerprinting of nonvolatile compounds in breath by extractive electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (4), 580-583 (2007).
- Benoi, F. M., Davldson, W. R., Lovett, A. M., Nacson, S., Ngo, A. Breath analysis by atmospheric pressure ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 55 (4), 805-807 (1983).
- Bregy, L., Martínez-Lozano Sinues, P., Nudnova, M. M., Zenobi, R. Real-time breath analysis with active capillary plasma ionization-ambient mass spectrometry. J. Breath Res. 8 (2), 027102-027110 (2014).
- Gaugg, M. T., et al. Expanding metabolite coverage of real-time breath analysis by coupling a universal secondary electrospray ionization source and high resolution mass spectrometry-a pilot study on tobacco smokers. J. Breath Res. 10 (1), 016010-016020 (2016).
- Martínez-Lozano, P., Zingaro, L., Finiguerra, A., Cristoni, S. Secondary electrospray ionization-mass spectrometry: breath study on a control group. J. Breath Res. 5 (1), 016002-016012 (2011).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Zenobi, R., Kohler, M. Analysis of the exhalome a diagnostic tool of the future. Chest. 144 (3), 746-749 (2013).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Fernandez de la Mora, J. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure Ionization-Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (21), 8210-8215 (2008).
- Martínez-Lozano Sinues, P., et al. Breath analysis in real time by mass spectrometry in chronic obstructive pulmonary disease. Respiration. 87 (4), 301-310 (2014).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Zenobi, R. Monitoring diurnal changes in exhaled human breath. Anal. Chem. 85 (1), 369-373 (2013).
- Chen, H. W., Zenobi, R. Neutral desorption sampling of biological surfaces for rapid chemical characterization by extractive electropray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 3 (9), 1467-1475 (2008).
- Li, X., Hu, B., Ding, J., Chen, H. W. Rapid characterization of complex viscous samples at molecular levels by neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 7 (6), 1010-1025 (2011).
- Gordon, S. M., Szidon, J. P., Krotoszynski, B. K., Gibbons, R. D., O'Neill, H. J. Volatile organic compounds in exhaled air from patients with lung cancer. Clin. Chem. 31 (8), 1278-1282 (1985).
- Ding, J. H., et al. Development of extractive electrospray ionization ion trap mass spectrometry in vivo breath analysis. Analyst. 134 (10), 2040-2050 (2009).
- Basum, G., Dahnke, H., Halmer, D., Hering, P., Mürtz, M. Online recording of ethane trances in human breath via infrared laser spectroscopy. J. Appl. Physiol. 95 (6), 2583-2590 (2003).
- Tøien, Ø Automated open flow respirometry in continuous and long-term measurements: design and principles. J. Appl. Physiol. 114 (8), 1094-1107 (2013).
- Huang, L., Li, X., Xu, M., Huang, Z. X., Zhou, Z. Identification of relatively high molecular weight compounds in human breath using secondary nano electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry. Chem. J. Chinese U. 38 (5), 752-757 (2017).
