Summary
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å isolere og kultur osteoklast i vitro fra musen benmargen, og å studere rollen av pattedyr/mekanistisk målet på rapamycin komplekse 1 i osteoclast-formasjonen.
Abstract
Osteoklast er unik bein-resorbing celler som skiller fra monocytt/macrophage slektslinje benmarg. Dysfunksjon av osteoklast kan resultere i en rekke bein metabolske sykdommer, inkludert osteoporose. For å utvikle farmasøytiske mål for forebygging av patologisk masse bentap, må mekanismer som skiller osteoklast fra forløpere forstås. Isolere og kultur mange osteoklast i vitro er kritiske for å bestemme rollen til bestemte gener i osteoclast differensiering. Deaktivering av pattedyr/mekanistisk målet på rapamycin komplekse 1 (TORC1) i osteoklast kan redusere osteoclast nummer og økt beinmasse; men krever de underliggende mekanismene videre studier. Studien, er en RANKL-basert protokoll å isolere og kultur osteoklast fra musen benmargen og studere påvirkning av mTORC1 inaktivering på osteoclast formasjon beskrevet. Denne protokollen resulterte vellykket i et stort antall gigantiske osteoklast, vanligvis innen en uke. Sletting av Raptor svekket osteoclast formasjon og redusert aktiviteten til sekretoriske tartrate-resistente sure fosfatase, indikerer at mTORC1 er avgjørende for osteoclast-formasjonen.
Introduction
Bein er en stadig skiftende organ og er ombygd av osteoblasts og osteoklast gjennom hele livet. Osteoklast er ansvarlig for mineralholdig matrix benresorpsjon og osteoblasts å syntetisere og utsondre nye bein matriser1. Balansen mellom benresorpsjon og bein formasjon er avgjørende for beinhelse inkludert vedlikehold av bein massen og respons på stimulering og skade. Hvis saldoen er forstyrret, oppstår en rekke bein metabolske sykdommer, inkludert osteoporose og periodontal sykdommen. Disse sykdommer overskrider masse bentap skyldes osteoclastic benresorpsjon Ben danner kapasitet osteoblasts2,3. Derfor, for å utvikle farmasøytiske mål for å behandle skjelettlidelser sykdommer som osteoporose, er det avgjørende å forstå generasjon og biologi osteoklast4.
Osteoklast er unik gigantiske multinucleated celler som er plassert på eller nær bein overflaten, og tilhører monocytt/macrophage familie1. Ibbotson K. J. et al. rapportert en metode for å generere osteoclast som celler i vitro med medium som inneholder 1,25-dihydroxy-vitamin D35. Identifikasjon av macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) og reseptor aktivator for kjernefysiske faktor-κ B ligand (RANKL) som viktige faktorer for osteoclast formasjon økt dramatisk effektiviteten av osteoclastogenesis i vitro 1 , 6 , 7. muligheten til å kultur osteoklast i vitro har forbedret vår forståelse av generasjon og regulering av osteoklast.
Pattedyr/mekanistisk målet på rapamycin (mTOR) funksjoner i to strukturelt og funksjonelt forskjellige komplekser, nemlig mTORC1 og mTORC28,9. To flere protein komplekser er atskilt fra hverandre sine ulike komponenter og nedstrøms underlag. mTORC1 inneholder unike regulatoriske-assosiert protein av mTOR (Raptor), mens mTORC2 inneholder den rapamycin tittelen følgesvennen mTOR (Rictor)9. mTORC1 kan integrere og overføre viktig signaler å regulere cellevekst, spredning og differensiering. Nylig viste vi at mTORC1 spiller en nøkkelrolle i nettverket av katabolske benresorpsjon ved sletting av Raptor å deaktivere mTORC1 i osteoklast10. Men krever de underliggende mekanismene videre studier. Studien, ble en RANKL-baserte osteoclastogenic metode brukt til å generere osteoklast fra Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs) av vill-type (WT) og RapCtsk mus, og å studere påvirkning av mTORC1 inaktivering på osteoclast formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer for dyrene ble utført i henhold til protokollen godkjent av Stanford Administrative Panel på laboratoriet Animal Care (APLAC) og ble godkjent av Animal Care og bruk komité Shanghai Institutt for biokjemi og celle Biologi.
1. forberedelse
- Generere osteoclast bestemt Raptor sletting mus (Raptorfl/fl; Ctsk-grobunn, heretter RapCtsk) av parring Raptorfl/fl mus med Ctsk-grobunn mus. Bruke Raptorfl/fl musene som kontrollen WT i denne studien.
- Har en beholder med is for å holde isolert bein.
-
Forberede kultur medium.
- Klargjør α-MEM kultur medium ved supplere minimum viktig middels alfa (α-MEM) med 1 x glutamin, penicillin-streptomycin og 10% fosterets kalv serum.
- Forberede benmarg macrophage induksjon medium som består av 50 mL av α-MEM medium og M-CSF på 20 ng/mL.
- Forberede osteoclast induksjon medium bestående av M-CSF og RANKL på 20 ng/mL, henholdsvis i 50 mL av α-MEM medium.
-
Klargjør følgende bufferne før FELLE farging.
- Forberede fastsette løsning med 6,5 mL aceton, 2,5 mL av citrate løsning og 0,8 mL 37% (vol/vol) formaldehyd løsning.
- Forberede FELLE flekker løsning.
- Prewarm deionisert vann til 37 ° C.
- Legg 100 µL av rask garnet GBC base løsning og 100 µL av natrium nitritt løsning til en 1.5-mL microtube og bland ved mild inversjon for 30 s. la blandingen stå i 2 min.
- Prewarm 9 mL deionisert vann til 37 ° C. Legge til 200 µL diazotized rask garnet GBC base løsning fra trinn 1.4.2.2, 100 µL naphthol AS-BI fosfat løsning, 400 µL acetate løsning og 200 µL tartrate løsning.
- Holde FELLEN flekker blanding løsning i et vannbad på 37 ° C.
-
Klargjør følgende bufferen før FELLE aktivitet kvantifisering av kultur medium.
- Forberede tartrate buffer (50 mL): 2 mL 0,33 M L-tartaric syre, 48 mL 0,33 M natrium tartrate dibasic tørke. Justere pH verdien til 4.9.
- Forberede 4-Nitrophenyl disodium (pNPP)-fosfatbuffer (200 mL): 1.502 g glysin, 41 mg av MgCl2, 27.2 mg av ZnCl2og 180 mL deionisert vann. Justere pH verdien 10.4 med 3 M NaOH og volum til 200 mL med deionisert vann.
- Forberede pNPP buffer med fosfatase substrat (for en 96-brønns plate): 49.37 mg fosfatase substrat og 175 µL pNPP bufferen trinn 1.5.2.
- Forberede Substratbufferen (9 mL/96-brønns plate): 6.24 mL deionisert vann, 360 μL acetate løsning og 2,4 mL tartrate bufferen. Blande av vortex og Forvarm på 37 ° C før bruk.
- Legge til 90 μL pNPP buffer med fosfatase substrate(1.5.3) 9ml forvarmet substrat buffer(1.5.4) å lage en substrat blanding og vortex for 10 s.
2. disseksjon (dag -1)
- Euthanize 3 en måneder gamle kvinnelige WT og RapCtsk mus av CO2 separat. Utføre CO2 Inhalasjon med egnet utstyr av opplært personale.
- Fordype 6 mus i et beaker med 100 mL 75% etanol (vol/vol) i 5 min å hindre bakteriell forurensning og plasser på et disseksjon bord i supine posisjon. Gjør en snitt på den distale av tibia vertikalt og dissekere huden langs hind lem med ophthalmica saks.
- Klipp av articular ligament av hofteleddet med saks og dislocate bakbeina fra stammen.
- Klipp av articular ligament av kneleddet og nøye fjerne tibia og femur fra kneleddet. Fjern bløtvev med saks.
- Sett alle bein av en genotype i en mus i hver brønn av en seks-vel-plate med 2 mL α-MEM på is.
Merk: Hvis du vil beholde celle levedyktighet, benet burde være holdt under disse forholdene i mindre enn 1 time.
3. isolering (dag -1)
- Fyll en brønn av en seks-vel plate med 75% etanol (3 mL) og andre 5 brønnene med α-MEM medium (3 mL).
- Putte alle bein av en genotype i etanol vask for 15 s og vask Ben 5 ganger med α-MEM medium for 10 s hver gang.
- Klipp av epiphyses med saks og en 0.45 mm sprøyte nål inn hulrom og flush benmargen ut med α-MEM medium i en 50-mL sentrifuge rør.
- Tømme bein hulrommet med samme fra den andre enden av benet. Gjenta minst to ganger for å vaske bein hulrommet grundig til benet er blek.
- Sentrifuge benmargen for å få celle pellets 800 x g og 4 ° C i 5 min. leveringstanken nedbryting.
- Legge 3 mL røde blodlegemer lyseringsbuffer i sentrifuge rør og Pipetter forsiktig å resuspend benmargen. Holde sentrifuge røret på is 8 min å lyse røde blodlegemer.
- Legge til 6 mL av α-MEM medium i sentrifuge røret å stoppe celle lysis. Sentrifuge på 500 x g og 4 ° C i 10 min og Sug opp nedbryting.
- Resuspend i 3 mL α-MEM kultur medium og plasser cellene i en seks-vel plate (vanligvis en mus per brønn).
- Ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator over natten.
4. plating (dag 0)
- Overføre nedbryting slik 15 mL sentrifuge samle fristilt cellene neste morgen.
- Sentrifuge på 800 x g og 4 ° C i 5 min og Sug opp nedbryting.
- Resuspend i 4 mL α-MEM kultur medium.
- Ta 20 µL av cellen løsningen og bland med 20 µL Trypan blå. Legg til 10 µL av blandingen til telling chamber og få celletall per mL løsning.
- Legge til en passende mengde α-MEM kultur medium å få en celle løsning av 500.000 celler/mL.
- Legg 500 µL og 50 µL av benmarg macrophage induksjon medium i hver brønn 24-vel plate og 96-brønns plate, henholdsvis.
- Legg 500 µL og 50 µL av cellen løsning i hver brønn 24-vel plate og 96-brønns plate, henholdsvis.
- Ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 3 dager.
5. differensiering (3-7 dager)
- Tre dager etter plating, samle 50 µL medium fra hver brønn av 96-brønnen-plate og fryse på 20 ° C, og deretter Sug opp den gjenværende mediet.
- Legge 1 mL og 100 µL osteoclast induksjon medium i hver brønn av en 24-vel plate og en 96-brønns plate, henholdsvis.
- Ruge på 37 ° C i 2 dager.
- Samle 50 µL av medium fra hver brønn og Sug opp den gjenværende mediet.
- Legge til osteoclast induksjon medium i hver brønn.
- Ruge på 37 ° C for en dag.
Merk: På dette tidspunkt, store, multinucleated osteoklast bør bli sett under en invertert mikroskop (figur 2A). - Hvis osteoklast ikke sett, endre osteoclast induksjon mediet og observere daglig før osteoklast vises.
- Samle 50 µL av medium fra hver brønn av 96-brønns platen etter osteoklast har dannet.
6. tartrate motstandsdyktig sure fosfatase (TRAP) flekker
Merk: Eldre osteoklast kan være til stede etter 6-7 dager i vitro kultur (trinn 4).
- Sug opp medium og vaskes forsiktig 3 ganger med 1 x PBS.
- Fikse cellene i hver brønn av 96-brønns plate med 100 µL av hurtigreparasjon løsning for 30 s ved romtemperatur.
- Fiksering, Sug opp fastsette løsningen og vaskes forsiktig 3 ganger med deionisert vann prewarmed til 37 ° C. Sug opp deionisert vann.
- Legg 100 µL av FELLE flekken i hver brønn av 96-brønns plate og Plasser platen i en inkubator på 37 ° C for 30 min og skjold fra lys.
- Etter Sug opp FELLE flekken og forsiktig vaske 3 ganger med deionisert vann.
- Bilde osteoklast bruker en invertert mikroskopet på 40 X forstørrelse.
7. FELLE aktivitet kvantifisering av kultur Medium
- Samle 30 µL kultur supernatant fra hver brønn av 96-brønns plate fra trinn 5.1, 5.4 og 5,8; Bruke 30 µL av ikke-kulturperler osteoclast induksjon medium som kontrollen negative. Sett prøvene i en ny 96-brønns plate.
- Legge til 90 μL substrat mixture(1.5.5) i hver brønn av 96-brønns plate.
- Plass platen i en inkubator på 37 ° C for 1 h og skjold fra lys.
- Stoppe reaksjonen ved å legge til 50 µL av 3 M NaOH i hver brønn av 96-brønns plate.
- Måle theabsorbance på bølgelengden til 405 nm.
8. vestlige Blotting
Merk: Etter 6-7 dager i vitro kultur i 24-vel plate, moden osteoklast skal vises.
- Sug opp mediet.
- Vask forsiktig med pre-avkjølt 1 x PBS 3 ganger.
- Sug opp PBS.
- Legg 100 µL av 1 x SDS lysis buffer med protease hemmer cocktail.
- Varme lysates ved 105 ° C i 10 min og sentrifuge på 12.000 × g og 4 ° C for 10 min. samle supernatants som inneholder proteiner.
- Separate lysates som inneholder 30 µg protein ved 10% SDS-side11 og deretter overføre til en polyvinylidene fluor (PVDF) membran.
- Blokkere membraner med 5% nonfat melk i 30 min.
- Inkuber membraner med anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-utgangen på 1:1,000 fortynning i 5% nonfat melk på 4 ° C over natten.
- Vask membraner med Tris bufret Saline med Tween-20 (TBST) i 10 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 8,9 to ganger.
- Inkuber membraner med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert anti-mus eller kanin IgG-antistoffer i 1:5,000 fortynning i 5% melk nonfat 1t ved romtemperatur.
- Vask membraner 3 ganger med TBST i 10 min ved romtemperatur.
- For chemiluminescent deteksjon, Legg vestlige chemiluminescent HRP substrat på membraner og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Avløp overskytende underlaget og utsette blots X-ray film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker stede protokollen, ble et stort antall gigantiske osteoklast sett på dag 6; Hvis gigantiske osteoklast ikke sett, en dag av osteoclast differensiering kan være nødvendig (figur 1). Vellykket osteoclast formasjon bekrefter FELLE flekker (figur 2A). Osteoklast var gigantiske vin rød/lilla celler med mer enn 3 kjerner. Mer enn 250 osteoklast ble oppnådd i hver brønn av 96-brønns plate i WT BMMs (figur 4A).
Sletting av Raptor ble bekreftet av vestlige blotting analyse og inaktivering av mTORC1 ble bestemt av en nedgang i ribosomal protein S6 fosforylering (P-S6), som er mye brukt som er avlesning for mTORC1 (Figur 3).
Antall FELLE-positive osteoklast ned i RapCtsk BMMs sammenlignet med WT gruppen (figur 4A), noe som indikerte at Raptor mangel svekket osteoclast formasjon.
Aktiviteten av sekretoriske TRAP er viktig for benresorpsjon FELLE aktivitet i kultur medium ble analysert studien. Som vist i figur 4B, økt FELLE aktivitet på grunn av stimulering av RANKL i både WT og RapCtsk BMMs. I tillegg FELLE aktivitet redusert i RapCtskBMMs sammenlignet med tilsvarende WT gruppen (P < 0,05).
Figur 1: skjematisk diagram av osteoclast induksjon protokollen. BMMs ble isolert på dag 1, og inkubert med grunnleggende α-MEM medium over natten. På dag 0, var BMMs samlet og belagt på en 96-brønns plate og 24-vel platen etterfulgt av inkubasjon i α-MEM medium med 10 ng/mL M-CSF. Dag 3, ble mediet endret til α-MEM medium med 20 ng/mL M-CSF og 20 ng/mL RANKL for induksjon av osteoclast differensiering. På dag 5, ble osteoclast differensiering mediet endret. På dag 6, et stort antall osteoklast var synlig og osteoclast analyser ble utført. Hvis osteoblasts ikke var synlig, osteoclast induksjon mediet ble endret og inkubasjon fortsatte en dag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant synspunkt osteoklast. (A) giganten osteoklast observert i lyse feltet på dag 6. Den røde linjen skissert grensen av osteoklast. (B) en vanligvis gigant, multinucleated, TRAP positive (vinrød) osteoclast. Den svarte pilen angitt to kjerner i den multinucleated osteoclast. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mTORC1 inaktivering i RapCtsk BMMs. Western blotting analyse av Raptor, P-S6 og S6 uttrykk i WT og RapCtsk BMMs på dag 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sletting av Raptor svekket osteoclast formasjon. (A) FELLE farging av BMMs på dag 6. Forstørring bilder av rutene i WT og RapCtsk vises, henholdsvis. Det var mindre giganten, TRAP positiv osteoklast dannet i RapCtsk BMMs med WT gruppe. (B) FELLE aktivitet av kultivert WT og RapCtsk BMMs. Data representerer betyr ± S.D.* P < 0,05, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoclastogenic analysen er den mest brukte metoden for å isolere og kultur osteoklast i vitro12,13. Mens flere RANKL-baserte osteoclast inductions har vært beskrevet13,14,15, beskrevet studien en protokoll med noen modifikasjoner basert på metodene.
I den tidligere studien, var BMMs plating umiddelbart etter isolasjon14,15. Det anbefales at BMMs ble kultivert med grunnleggende medium natten før plating å isolere BMMs fra mesenchymal stamceller og fibroblaster som umiddelbart følger parabolen. M-CSF kan fremme spredning av monocytter til osteoclast prekursorer og stimulere osteoclast forløpere for å uttrykke rang som binder RANKL og deretter induserer dannelsen av eldre osteoklast6,16,17. Derfor, i vår studie av BMMs ble indusert med 10 ng/mL M-CSF for 3 dager før osteoclast induksjon, i stedet for osteoclast induksjon på den andre dagen etter plating15. Cellen tetthet er avgjørende for osteoclast formasjon i vitro. Det anbefales at 25.000 BMMs var frø inne hver brønn en 96-brønns plate følge av 3 dager inkubasjon med 10 ng/mL M-CSF. Når cellen der 80-90%, er det en passende tid for osteoclast induksjon av RANKL. Vanligvis eldre osteoklast skjemaet på dag 6. Den vanligste årsaken til noen osteoklast er suboptimal celle tetthet, som kan være et resultat av en lav seeding tetthet eller lav celle levedyktighet. BMMs er delikat primære celler og må behandles forsiktig. Å holde beinet på is for lenge eller resuspending kraftig avtar levedyktigheten til BMMs og senere svekker dannelsen av osteoklast. Dermed er optimal seeding tettheten av levedyktig BMMs avgjørende for å få et stort antall osteoklast.
Aktiviteten av sekretoriske TRAP er avgjørende for osteoclastic benresorpsjon. I denne studien beskriver vi en metode for å analysere kvantitativt sekretoriske FELLE aktivitet i kultur medium. Endring av FELLE aktivitet i kultur medium skyldes endringer av osteoclast eller sekretoriske FELLEN av osteoclast eller en kombinasjon av begge. Dermed kan dette være en nyttig metode for analyse osteoclast funksjon i vitro sammen med osteoclast benresorpsjon analysen beskrevet tidligere18.
mTOR er et evolusjonært bevart protein kinase som kan regulere celle metabolisme og differensiering9. I denne studien fant vi at mTORC1 spilte en viktig rolle i benresorpsjon ved å regulere osteoclast formasjon. mTORC1 kan være et mulig farmakologiske mål for behandling av bein metabolske sykdommer som osteoporose i fremtiden.
Oppsummert våre Protokoll for osteoclast induksjon resulterte vellykket i et stort antall av gigantiske osteoklast i vitro og våre data tyder på at mTORC1 er avgjørende for osteoclast-formasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere sier at de har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Minghan Tong og S. Kato for vennlige gi reagenser og mus. Vi takker medlemmer av laboratoriet Zou nyttig diskusjoner. Dette arbeidet var støttes delvis av tilskudd fra 973 Program fra det kinesiske departementet for vitenskap og teknologi (mest) [2014CB964704 og 2015CB964503], klinisk forskningsprogram for 9 personer Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Takk for hjelp av Core anlegget for Cell Biology og kjernen anlegg for kjemiske biologi, CAS senter for fremragende molekylær celle vitenskap, Shanghai Institutt for biokjemi og cellebiologi, kinesiske Academy of Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
- Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
- Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
- Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
- Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
- Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
- Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
- Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
- Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).
