Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לנתק את ותרבות osteoclasts במבחנה ממח העצם העכבר, וכדי ללמוד את התפקיד של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin 1 מורכבים במבנה אוסטאוקלסט.

Abstract

Osteoclasts הם ייחודיים עצם-resorbing תאים כי להבדיל מן השושלת מונוציט/מקרופאג של מח העצם. תפקוד לקוי של osteoclasts עלולה לגרום לסדרה של מחלות מטבוליות העצם, כולל אוסטיאופורוזיס. כדי לפתח מטרות תרופות למניעת איבוד מסת העצם פתולוגי, יש להבין את המנגנונים שבאמצעותו osteoclasts להבדיל סימנים מקדימים. היכולת לבודד תרבות מספר גדול של osteoclasts במבחנה הוא קריטי על מנת לקבוע את התפקיד של גנים ספציפיים אוסטאוקלסט בידול. איון של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin מורכבים 1 (TORC1) של osteoclasts יכולים להקטין את מספר אוסטאוקלסט ולהגדיל את מסת העצם; עם זאת, המנגנון הבסיסי דורש מחקר נוסף. במחקר הנוכחי, פרוטוקול מבוסס רנקל לבודד, תרבות osteoclasts ממח העצם העכבר וכדי ללמוד את ההשפעה של איון mTORC1 על היווצרות אוסטאוקלסט מתואר. פרוטוקול זה הביא בהצלחה מספר רב של osteoclasts ענק, בדרך כלל תוך שבוע אחד. מחיקה של Raptor לקוי אוסטאוקלסט היווצרות וירידה הפעילות של הפרשה פוספטאז חומצה tartrate עמידים, המציין שאת mTORC1 הזה הוא קריטי עבור אוסטאוקלסט היווצרות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עצם הוא איבר המשתנה, היא שופצה על ידי תאי העצם osteoclasts לאורך החיים. Osteoclasts אחראים על בסיס מינרלים מן מטריקס resorption ותאי העצם לסנתז להפריש עצם חדש מטריצות1. האיזון בין ספיגת עצם היווצרות העצם היא חיונית לבריאות העצם כולל תחזוקה של העצם מסה ו בתגובה לגירוי ופציעה. אם איזון זה מופרת, סדרה של מחלות מטבוליות העצם עלולה להתרחש, כולל אוסטאופורוזיס ומחלות חניכיים. במחלות אלה, אובדן מסת עצם הנובע ספיגת עצם osteoclastic חורג העצם ויוצרים קיבולת של תאי העצם2,3. לכן, על מנת לפתח מטרות התרופות לטיפול בהפרעות השלד כגון אוסטיאופורוזיס, זה קריטי להבין את הדור ואת הביולוגיה של osteoclasts4.

Osteoclasts הם ייחודיים תאים multinucleated ענק הממוקם ליד או על פני עצם, שייך מונוציט/מקרופאג משפחה1. Ibbotson ק. י. ואח דיווח שיטה ליצירת תאים דמויי אוסטאוקלסט במבחנה בינונית המכיל 1,25-dihydroxy-ויטמין D35. זיהוי גורם מגרה מקרופאג-המושבה (M-CSF), קולטן activator עבור הפקטור הגרעיני-κ B ליגנד (רנקל) כגורמים חיוני היווצרות אוסטאוקלסט גדל באופן דרמטי את היעילות של osteoclastogenesis חוץ גופית בתוך 1 , 6 , 7. יכולת התרבות osteoclasts במבחנה השתפרה ההבנה שלנו של הדור וויסות של osteoclasts.

המטרה מידע יונקים/מכניסטית של פונקציות rapamycin (mTOR) שני מתחמי מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית ברורים, כלומר mTORC1 ו- mTORC28,9. שני מתחמי חלבון רב נפרדים אחד מהשני בשל מרכיבים שונים ותערובות במורד הזרם שלהם. mTORC1 מכיל חלבון רגולטורי הקשורים ייחודי של mTOR (בז), בעוד mTORC2 מכיל ובת לוויתו rapamycin-רגישות של mTOR (Rictor)9. mTORC1 ניתן לשלב ולשדר אותות חשוב לווסת צמיחת תאים, התפשטות ובידול. לאחרונה, להדגים שאת mTORC1 ממלא תפקיד מרכזי ברשת של ספיגת עצם קטבולי על-ידי מחיקה של Raptor בטל mTORC1 osteoclasts10. עם זאת, המנגנון הבסיסי דורש מחקר נוסף. במחקר הנוכחי, שיטה המבוססת על רנקל osteoclastogenic שימש לייצר osteoclasts הנגזרות מח עצם מקרופאגים (BMMs) של פראי-סוג (WT) ועכברים ראפCtsk , כדי לחקור את ההשפעה של איון mTORC1 על אוסטאוקלסט צורה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הנהלים הנוגעים החיות בוצעו לפי הפרוטוקול שאושרו על-ידי הפאנל ניהול סטנפורד על טיפול חיות מעבדה (APLAC), אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של שנגחאי המכון לביוכימיה, תא ביולוגיה.

1. הכנה

  1. צור אוסטאוקלסט ספציפי ראפטור מחיקה עכברים (ראפטורחליל/חליל; Ctsk-cre, מכאן והלאה ראפCtsk) על ידי הזדווגות ראפטורחליל/חליל עכברים עם עכברים Ctsk-cre . השתמש העכברים ראפטורחליל/חליל של הפקד WT במחקר זה.
  2. יש מיכל עם קרח כדי לשמור על העצם המבודד.
  3. להכין את תרבות בינוני.
    1. הכן α-מ תרבות בינוני על ידי שכשהם המינימום חיוני בינוני אלפא (α-מ) עם 1 x גלוטמין פניצילין-סטרפטומיצין, סרום עגל עוברית 10%.
    2. להכין את מח העצם מקרופאג אינדוקציה בינוני בהיקף של 50 מ של α-מ בינוני ו- M-CSF-20 ng/mL.
    3. להכין אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני המורכב מ- CSF ו רנקל ב 20 ng/mL, בהתאמה, ב- 50 מ של α-מ בינוני.
  4. להכין המאגרים הבאים לפני צביעת מלכודת.
    1. להכין פתרון בהיקף של 6.5 מ של אצטון, 2.5 מ של פתרון ציטראט ו- 0.8 מ של 37% פורמלדהיד (vol/כרך) פתרון.
    2. להכין מלכודת מכתים פתרון.
      1. Prewarm מים יונים 37 מעלות צלזיוס.
      2. להוסיף 100 µL של גארנט מהר פתרון בסיס מסויימות, 100 µL של נתרן חנקיתי פתרון microtube 1.5-mL ומערבבים על ידי היפוך עדין רשות ס' 30 לתערובת לעמוד למשך 2 דקות.
      3. Prewarm 9 מ של מים יונים 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 200 µL בפתרון מסויימות diazotized מהיר גארנט בסיס מהשלב 1.4.2.2, µL 100 של פתרון פוספט naphthol AS-BI, µL 400 של אצטט פתרון µL 200 tartrate פתרון.
      4. לשמור את המלכודת מכתים תערובת פתרון באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
  5. הכנת המאגר הבאים לפני מלכודת כימות פעילות של תרבות בינוני.
    1. הכנת מאגר tartrate (50 מ"ל): 2 מ ל חומצה L טרטרית 0.33 מ', מ 48 ל ז 0.33 tartrate נתרן dibasic מייבשים. התאם את ערך ה-pH 4.9.
    2. להכין 4-Nitrophenyl פוספט ניתרן (pNPP) מאגר (200 מ"ל): g 1.502 של גליצין, 41 מ ג של MgCl2, 27.2 מ ג של ZnCl2ו- 180 מ ל מים יונים. להתאים את ערך ה-pH 10.4 עם 3 M NaOH לאמצעי האחסון 200 מ ל מים יונים.
    3. הכנת מאגר pNPP עם סובסטרט פוספטאז (עבור לוח 96-ובכן אחד): מ ג 49.37 פוספטאז המצע ו- 175 µL pNPP מאגר של צעד 1.5.2.
    4. הכנת מאגר המצע (9 מ ל/96-ובכן צלחת): 6.24 מ של מים יונים, μL 360 של אצטט פתרון, mL 2.4 tartrate המאגר. לערבב על ידי מערבולת, מחממים ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    5. להוסיף μL 90 pNPP מאגר עם substrate(1.5.3) פוספטאז 9 מ של טרופה המצע buffer(1.5.4) כדי להפוך את התערובת המצע מערבולת 10 s.

2. ניתוח (יום-1)

  1. המתת חסד 3 בן חודש אחד נקבה WT ו ראפCtsk עכברים ב- CO2 בנפרד. לבצע אינהלציה2 CO עם הציוד המתאים על ידי צוות מיומן.
  2. לטבול 6 עכברים בתוך גביע עם 100 מ של 75% אתנול (vol/כרך) עבור 5 דקות כדי למנוע זיהום חיידקי ולאחר מכן מניחים על קרש חיתוך במצב פרקדן. אעשה חתך-הדיסטלי של עצם השוקה אנכית ומנתחים את העור לאורך האיבר הינד במספריים אופטלמולוגיות.
  3. לחתוך רצועה במפרק של מפרק הירך עם מספריים, לנקוע את הגפיים האחוריות מתא המטען.
  4. לחתוך ברצועה במפרק הברך ולהתנער בקפידה על שוקה ועל עצם הירך של הברך. הסר בעדינות את הרקמות הרכות עם מספריים.
  5. מקום שכל העצמות של גנוטיפ אחד של עכבר אחד כל טוב של שש-ובכן-צלחת עם 2 מ של α-מ על קרח.
    הערה: כדי לשמר את הכדאיות תא, העצם יש לשמור בתנאים אלו עבור פחות מ 1 h.

3. בידוד (יום-1)

  1. למלא אחד טוב של צלחת 6-ובכן עם 75% אתנול (3 מ ל) ואת הבארות אחרים 5 α-מ בינוני (3 מ ל).
  2. לשים בכל עצמות גנוטיפ אחת בכביסה אתנול עצמות s ושטיפת 15 5 פעמים עם α-מ בינוני 10 s בכל פעם.
  3. לחתוך את epiphyses עם מספריים והכנס מחט מזרק 0.45 מ מ לתוך חלל, סומק מח העצם החוצה עם α-מ בינוני לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL.
  4. לשטוף את חלל העצם באמצעות אותה שיטה מהקצה השני של העצם. חזור על פחות פעמיים כדי לשטוף את חלל העצם ביסודיות עד העצם היא חיוורת.
  5. Centrifuge מח העצם כדי להשיג גלולה תא ב 800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע.
  6. להוסיף 3 מ"ל של מאגר פירוק תאי הדם האדומים לתוך צנטריפוגה שפופרת ואת פיפטה בעדינות כדי resuspend מח העצם. שמור את הצינור צנטריפוגה בקרח במשך 8 דקות lyse כדוריות דם אדומות.
  7. להוסיף 6 מ של α-מ בינוני לתוך הצינור צנטריפוגה כדי לעצור את פירוק התא. צנטריפוגה-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
  8. Resuspend ב 3 מ"ל של α-מ תרבות בינוני ומניחים את התאים על פלטה 6-טוב (בדרך כלל אחד עכבר לכל טוב).
  9. דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% בין לילה.

4. ציפוי (יום 0)

  1. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. לאיסוף תאי כעיגולים בצבע למחרת בבוקר.
  2. צנטריפוגה-800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
  3. Resuspend ב 4 מ של α-מ תרבות בינוני.
  4. . קח 20 µL של הפתרון תא ומערבבים עם 20 µL של Trypan Blue. להוסיף 10 µL של התערובת לחדר הספירה והשג את ספירת התאים לכל מ של פתרון.
  5. הוסף אמצעי אחסון המתאים של α-מ בינוני התרבות כדי להשיג פתרון תא של תאים למ"ל 500,000.
  6. להוסיף 500 µL ו- µL 50 של מח העצם מקרופאג אינדוקציה בינוני לבאר כל צלחת 24-טוב ואת צלחת 96-ובכן, בהתאמה.
  7. להוסיף 500 µL ו- µL 50 של פתרון תא לבאר כל צלחת 24-טוב ואת צלחת 96-ובכן, בהתאמה.
  8. דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% במשך 3 ימים.

5. בידול (3-7 ימים)

  1. שלושה ימים לאחר ציפוי, לאסוף 50 בינוני µL מכל קידוח של 96-ובכן-הצלחת להקפיא ב-20 ° C ו ואז האחות המדיום שיורית.
  2. להוסיף 1 מ"ל ו 100 µL אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני לבאר כל צלחת 24-ובכן, צלחת 96-ובכן, בהתאמה.
  3. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
  4. לאסוף 50 µL בינוני מכל קידוח, תשאף המדיום שיורית.
  5. הוסף אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני כל טוב.
  6. דגירה ב 37 ° C עבור יום אחד.
    הערה: בשלב זה הזמן ', osteoclasts גדול, multinucleated צריך ניתן לראות תחת מיקרוסקופ הפוכה (איור 2 א).
  7. אם לא ראיתי את osteoclasts, לשנות את המדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט ולצפות מדי יום עד osteoclasts הם ראו.
  8. לאסוף 50 µL בינוני מכל קידוח של צלחת 96-ובכן אחרי osteoclasts יצרו.

6. tartrate מכתים עמיד חומצה פוספטאז (השמנה)

הערה: בוגרת osteoclasts עשוי להיות נוכח לאחר 6-7 ימים של in vitro לקשרי תרבות (שלב 4).

  1. האחות בינוני, לשטוף בעדינות 3 פעמים עם 1 x PBS.
  2. לתקן את התאים היטב כל צלחת 96-ובכן עם 100 µL של פתרון עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר קיבוע, וארוקן את הפתרון ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם מים יונים prewarmed ל- 37 מעלות צלזיוס. האחות מים יונים.
  4. להוסיף 100 µL של מלכודת כתם לבאר כל צלחת 96-ובכן ולמקם את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, מגן מפני אור.
  5. לאחר צביעת, וארוקן את הכתם מלכודת ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם מים יונים.
  6. התמונה osteoclasts באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ב 40 X הגדלה.

7. מלכודת כימות פעילות של תרבות בינוני

  1. לאסוף את התרבות µL 30 supernatant מכל קידוח של צלחת 96-ובכן משלב 5.1, 5.4 ו- 5.8; השתמש µL 30 שאינו תרבותי אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני של הפקד שלילי. מקם את הדגימות צלחת 96-ובכן חדשה.
  2. הוסף μL 90 של המצע mixture(1.5.5) לבאר כל צלחת 96-ובכן.
  3. מקם את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C 1 h, מגן מפני אור.
  4. לעצור את התגובה על ידי הוספת µL 50 של 3 M NaOH לבאר כל צלחת 96-ובכן.
  5. למדוד את theabsorbance-אורך הגל של 405 ננומטר.

8. המערבי סופג

הערה: על אחרי 6-7 ימים של in vitro לקשרי תרבות בצלחת 24-ובכן, בוגרת osteoclasts צריך להיות גלוי.

  1. האחות של המדיום.
  2. לשטוף בעדינות עם טרום מקורר 1 x PBS 3 פעמים.
  3. האחות PBS.
  4. להוסיף 100 µL 1 x מרחביות פירוק מאגר המכיל פרוטאז מעכב קוקטייל.
  5. חום lysates ב 105 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, צנטריפוגה-12,000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לאסוף את supernatants המכיל חלבונים.
  6. להפריד את lysates המכילה 30 µg של חלבונים על-ידי 10% מרחביות-דף11 ולאחר מכן להעביר את קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene.
  7. לחסום את הקרומים עם 5% חלב דל שומן למשך 30 דקות.
  8. דגירה בקרום עם הראפטור אנטי אנטי-P-S6, אנטי-S6, אנטי-β-אקטין-דילול 1:1,000 בחלב דל שומן 5% ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. לשטוף את הקרומים עם טריס Buffered מלוחים עם Tween-20 (TBST) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. חזור על שלב 8.9 פעמיים.
  11. דגירה בקרום עם חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים IgG אנטי עכבר או ארנב-דילול 1:5,000 בחלב דל שומן 5% לשעה בטמפרטורת החדר.
  12. לשטוף את הקרומים 3 פעמים עם TBST 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. לצורך זיהוי chemiluminescent, להוסיף המצע HRP chemiluminescent המערבי על הממברנות, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. לרוקן את המצע עודף ולחשוף את שהכלים לסרט צילום רנטגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

משתמש בפרוטוקול הנוכחי, מספר גדול של osteoclasts ענק נראו ביום 6; אם osteoclasts ענק לא נראים, יום נוסף של בידול אוסטאוקלסט ייתכן צורך (איור 1). אוסטאוקלסט מוצלחת היווצרות אושר ע י מלכודת מכתים (איור 2 א). Osteoclasts היו ענקיים-יין אדום/סגול תאים עם גרעינים יותר מ 3. יותר מ 250 osteoclasts התקבלו היטב כל צלחת 96-ובכן ב WT BMMs (איור 4A).

מחיקה של Raptor אושר ע י ניתוח סופג המערבי, איון של mTORC1 נקבע על ידי לירידה זירחון חלבונים ribosomal S6 (P-S6), אשר נמצא בשימוש נפוץ כמו המדידה עבור mTORC1 (איור 3).

המספר של osteoclasts השמנה-חיוביות ירד בחודש BMMs ראפCtsk לעומת הקבוצה WT (איור 4A), אשר ציין כי מחסור ראפטור לקוי אוסטאוקלסט היווצרות.

הפעילות של הפרשה ההשמנה חשוב עבור ספיגת עצם, פעילות מלכודת המדיום תרבות נותחו במחקר הנוכחי. כפי שמוצג באיור 4B, מלכודת פעילות מוגברת עקב גירוי של רנקל WT והן BMMs ראפCtsk . בנוסף, פעילות מלכודת ירד בחודש BMMs ראפCtskלעומת הקבוצה WT המתאים (P < 0.05).

Figure 1
איור 1: תרשים סכמטי של פרוטוקול אינדוקציה אוסטאוקלסט. BMMs היו מבודדים ביום 1, מודגרות α בסיסי-מ בינונית למשך הלילה. ביום 0, BMMs היו נאספים, מצופה עלו על 96-ובכן צלחת צלחת 24-ובכן ואחריו הדגירה α-מ בינוני עם 10 ננוגרם למ"ל M-CSF. יום 3, המדיום שונה α-מ בינוני עם 20 ng/mL M-CSF ל-20 ננוגרם למ"ל רנקל עבור אינדוקציה אוסטאוקלסט בידול. יום 5, המדיום בידול אוסטאוקלסט השתנה. יום 6, מספר גדול של osteoclasts היו גלויים, מבחני אוסטאוקלסט בוצעו. אם תאי העצם לא היו גלויים, המדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט השתנה והמשכנו הדגירה עוד יום אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תצוגה נציג של osteoclasts. (א) ענק osteoclasts שנצפו בשדה בהיר ביום 6. הקו האדום המתוארים הגבול של osteoclasts. (B) A בדרך כלל ענק, multinucleated, מלכודת חיובי (יין אדום) אוסטאוקלסט. החץ השחור ציין שני הגרעינים של אוסטאוקלסט multinucleated. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: איון mTORC1 ב BMMs ראפCtsk . המערבי סופג ניתוח של הביטוי ראפטור, P-S6, S6 ב WT ו BMMs ראפCtsk ביום 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: מחיקה של Raptor לקוי אוסטאוקלסט היווצרות. (א) השמנה כתמים BMMs ביום 6. תמונות בהגדלה של הריבועים WT וקבוצות ראפCtsk מוצגים, בהתאמה. היו פחות ענק, מלכודת חיובי osteoclasts שהוקמה ב BMMs ראפCtsk בהשוואה WT קבוצה. (B) השמנה הפעילות של תרבותי WT, ראפCtsk BMMs. הנתונים ייצגו אומר ± S.D.* P < 0.05, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הבדיקה osteoclastogenic היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לבודד את תרבות osteoclasts במבחנה12,13. בעוד מספר inductions מבוססי רנקל אוסטאוקלסט כבר מתואר13,14,15, המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול עם כמה שיפורים בהתבסס על השיטות הקודמות.

במחקר הקודם, BMMs היו יופיצ מיד לאחר בידוד14,15. אנו ממליצים כי BMMs היו תרבותי בסיסי בינונית למשך הלילה לפני ציפוי כדי לבודד BMMs גזע mesenchymal ו fibroblasts אשר מיד לדבוק המנה. M-CSF יכול לקדם את התפשטות ומונוציטים כדי אוסטאוקלסט מבשרי ולעורר אוסטאוקלסט מבשרי לבטא הדרגה נקשר רנקל ומשרה ואז היווצרות של osteoclasts בוגרת6,16,17. לפיכך, במחקר שלנו, BMMs היו המושרה עם 10 ננוגרם למ"ל M-CSF 3 ימים לפני אוסטאוקלסט אינדוקציה, במקום עבור אינדוקציה אוסטאוקלסט ביום השני לאחר ציפוי15. צפיפות התאים הוא קריטי עבור אוסטאוקלסט היווצרות בתוך חוץ גופית. מומלץ כי 25,000 BMMs היו זרועה ב כל טוב של קהל מעריצים 96-ובכן צלחת על-ידי 3 ימים דגירה עם 10 ננוגרם למ"ל M-CSF. לאחר המפגש תא הגיעה 80-90%, זה זמן מתאים אוסטאוקלסט אינדוקציה של רנקל בדרך כלל, בוגרת osteoclasts טופס על יום 6. הסיבה הנפוצה ביותר osteoclasts כמה היא שיוצרת תא צפיפות, אשר יכול להיות התוצאה של צפיפות נמוכה זריעה או הכדאיות תא נמוך. BMMs עדין ראשי תאים, עליך לטפל בעדינות. שמירה על עצם בקרח במשך זמן רב או resuspending נמרצות פוחתת הכדאיות של BMMs, לאחר מכן מחליש היווצרות של osteoclasts. לפיכך, הצפיפות זריעה אופטימלית של קיימא BMMs חיוני להשגת מספר גדול של osteoclasts.

הפעילות של מלכודת הפרשה הוא קריטי עבור ספיגת עצם osteoclastic. במחקר זה, אנו מתארים שיטה לנתח באופן כמותי את הפעילות מלכודת הפרשה המדיום תרבות. השינוי של פעילות מלכודת המדיום תרבות יכול לנבוע שינויים מספר אוסטאוקלסט או מלכודת הפרשה אוסטאוקלסט או שילוב של שניהם. לכן, זה עשוי להיות שיטה שימושית עבור ניתוח אוסטאוקלסט פונקציה במבחנה יחד עם וזמינותו resorption אוסטאוקלסט שתוארה לעיל18.

mTOR הוא והתפאורה אבולוציונית קינאז זה יכול לווסת את חילוף החומרים, התמיינות תאים9. במחקר זה, מצאנו שאת mTORC1 שיחק תפקיד חשוב ספיגת עצם על ידי ויסות אוסטאוקלסט היווצרות. mTORC1 עשוי להיות יעד פוטנציאליים תרופתי לטיפול של הפרעות מטבוליות העצם כגון אוסטיאופורוזיס בעתיד.

לסיכום, פרוטוקול שלנו עבור אינדוקציה אוסטאוקלסט הביא בהצלחה מספר רב של osteoclasts ענק במבחנה , הנתונים שלנו מציע ש-mtorc1 הזה הוא קריטי עבור אוסטאוקלסט היווצרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים המדינה שיש להם שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים מודים טונג minghan ב ר ו ס קאטו על ריאגנטים מתן בחביבות ועכברים. אנו מודים חברי המעבדה Zou לדיונים שימושי. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים מ- 973 תוכנית משרד המדע הסיני, טכנולוגיה (רובם) [2014CB964704, 2015CB964503], מחקר קליני, במגמה של 9 אנשים חולים, שנגחאי ג'יאו טונג הספר לרפואה של אוניברסיטת. תודה על העזרה של מתקן הליבה ביולוגיה של התא, מתקן הליבה עבור ביולוגיה כימית, CAS מרכז למצוינות מולקולרית תא המדע, שנגחאי מכון של ביוכימיה, ביולוגיה של התא, האקדמיה הסינית למדעים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter