Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

En RANKL-baserade Osteoclast kultur analys av mus benmärgen att undersöka betydelsen av mTORC1 Osteoclast bildandet

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript beskriver ett protokoll till isolat och kultur osteoklaster i vitro från mus benmärg, och att studera rollen däggdjur/mekanistiska målet på rapamycin komplexa 1 i osteoclast formation.

Abstract

Osteoklaster är unika ben-resorbing celler som skiljer från benmärgen monocyt/makrofag släktlinje. Dysfunktion av osteoklaster kan resultera i en serie av metaboliska skelettsjukdomar, inklusive osteoporos. För att utveckla farmaceutiska mål för förebyggande av patologiska massa benförlust, måste de mekanismer genom vilka osteoklaster skilja från prekursorer förstås. Möjligheten att isolera och kultur ett stort antal osteoklaster i vitro är avgörande för att fastställa specifika gener hos osteoklasterna differentieringen i roll. Inaktivering av däggdjur/mekanistiska målet för rapamycin komplexa 1 (TORC1) i osteoklaster kan minska osteoclast nummer och öka benmassan; de bakomliggande mekanismerna kräver dock ytterligare studier. I den aktuella studien beskrivs ett RANKL-baserat protokoll att isolera och kultur osteoklaster från mus benmärg och att studera påverkan av mTORC1 inaktivering på osteoclast bildas. Detta protokoll resulterade framgångsrikt i ett stort antal giant osteoklaster, vanligtvis inom en vecka. Radering av Raptor nedsatt osteoclast bildandet och minskade aktiviteten av sekretoriska tartrat-resistenta syra fosfatas, som anger att mTORC1 är kritiska för osteoclast bildandet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ben är ett ständigt organ och är ombyggda av osteoblaster och osteoklaster under hela livet. Osteoklaster är ansvarig för mineraliserade matrix resorption och osteoblaster syntetisera och utsöndra nya ben matriser1. Balansen mellan benresorption och benbildning är avgörande för benhälsa inklusive underhåll av ben massa och svar på stimulering och skada. Om denna balans störs, kan det uppstå en rad metabola bensjukdomar, inklusive osteoporos och parodontala sjukdomar. I dessa sjukdomar överskrider massa benförlust som följd osteoklastisk benresorption de ben som bildar kapacitet av osteoblaster2,3. Således, för att utveckla farmaceutiska mål för behandling av skelettsjukdomar som osteoporos, är det viktigt att förstå generation och biologi av osteoklaster4.

Osteoklaster är unika Multinucleära jätteceller ligger på eller nära benytan och tillhör monocyt/makrofag familj1. Ibbotson K. J. et al. rapporterade en metod för att generera osteoclast-liknande celler in vitro- med mediet som innehåller 1,25-dihydroxi-vitamin D35. Identifiering av makrofag-koloni stimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator för nuclear factor-κ B ligand (RANKL) som viktiga faktorer av osteoclast bildande har dramatiskt ökat effektiviteten i osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. möjlighet att kultur osteoklaster i vitro har förbättrat vår förståelse av generationen och reglering av osteoklaster.

Däggdjur/mekanistiska målet av rapamycin (mTOR) funktioner i två strukturellt och funktionellt distinkta komplex, nämligen mTORC1 och mTORC28,9. De två multi proteinkomplex är skilda från varandra på grund av deras olika komponenter och nedströms substrat. mTORC1 innehåller unik föreskrivande-associerade proteinet av mTOR (Raptor), medan mTORC2 innehåller okänsliga för rapamycin följet av mTOR (Rictor)9. mTORC1 kan integrera och överföra viktiga signaler som reglerar celltillväxt, proliferation och differentiering. Nyligen har visat vi att mTORC1 spelar en nyckelroll i nätverket av katabola benresorption genom borttagande av Raptor att inaktivera mTORC1 i osteoklaster10. De bakomliggande mekanismerna kräver dock ytterligare studier. I den aktuella studien användes en RANKL-baserade osteoclastogenic metod för att generera osteoklaster från benmärgen-derived makrofager (BMMs) av vildtyp (WT) och RapCtsk möss och att studera påverkan av mTORC1 inaktivering på hos osteoklasterna bildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla förfaranden för djuren utfördes enligt de protokoll som godkänts av den administrativa panelen för Stanford på laboratorium djur vård (APLAC) och godkändes av djur vård och användning kommittén av Shanghai Institute för biokemi och Cell Biologi.

1. beredning

  1. Generera osteoclast specifika Raptor radering möss (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, härefter RapCtsk) genom parning Raptorfl/fl möss med Ctsk-cre möss. Använd Raptorfl/fl mössen som WT kontroll i denna studie.
  2. Har en behållare med is att hålla isolerade ben.
  3. Förbereda odlingsmedium.
    1. Förbereda α-MEM odlingsmedium genom att komplettera minsta viktigt medium alpha (α-MEM) med 1 x glutamin, penicillin-streptomycin och 10% fetalt kalvserum.
    2. Förbereda benmärgen makrofag induktion medium bestående av 50 mL av α-MEM medium och M-CSF vid 20 ng/mL.
    3. Förbereda osteoclast induktion medium bestående av M-CSF och RANKL på 20 ng/mL, respektive i 50 mL av α-MEM medium.
  4. Förbered följande buffertar innan TRAP färgning.
    1. Förbereda fix-lösning bestående av 6,5 mL aceton, 2,5 mL citratlösning och 0,8 mL 37% (vol/vol) formaldehydlösning.
    2. Förbereda fälla färgning lösning.
      1. Prewarm avjoniserat vatten till 37 ° C.
      2. Tillsätt 100 µL av snabbt garnet GBC baslösning och 100 µL av natrium nitrit lösning i en 1,5 mL mikrorör och blanda genom varsam inversion för 30 s. Låt blandningen stå i 2 min.
      3. Prewarm 9 mL avjoniserat vatten till 37 ° C. Tillsätt 200 µL av förening snabbt garnet GBC baslösning från steg 1.4.2.2, 100 µL av naftol AS-BI fosfat lösning, 400 µL Acetat lösning och 200 µL tartratlösning.
      4. Hålla FÄLLAN färgning blandning lösning i ett vattenbad vid 37 ° C.
  5. Förbered följande bufferten innan TRAP aktivitet kvantifiering av odlingsmedium.
    1. Förbereda tartrat buffert (50 mL): 2 mL 0,33 M L-vinsyra, 48 mL 0,33 M natrium tartrat dibasiskt torkar. Justera pH-värdet till 4,9.
    2. Förbered 4-nitrofenyl dinatrium (pNPP) fosfatbuffert (200 mL): 1.502 g av glycin, 41 mg av MgCl2, 27,2 mg ZnCl2och 180 mL avjoniserat vatten. Justera pH-värdet till 10,4 med 3 M NaOH och volymen till 200 mL med avjoniserat vatten.
    3. Förbereda pNPP buffert med fosfatas substrat (för en plattan med 96 brunnar): 49.37 mg fosfatas substrat och 175 µL av pNPP buffert av steg 1.5.2.
    4. Förbereda substratbuffert (9 mL/96 brunnar plattan): 6.24 mL avjoniserat vatten, 360 μL av acetat lösning, och 2,4 mL tartratlösning buffert. Blanda av virvel och förvärma vid 37 ° C före användning.
    5. Tillsätt 90 μl av pNPP buffert med fosfatas substrate(1.5.3) till 9ml av förvärmd substrat buffer(1.5.4) att göra en substrat blandning och virvel för 10 s.

2. dissektion (dag -1)

  1. Avliva 3 en månad gamla WT och RapCtsk honmöss av CO2 separat. Utföra CO2 inandning med lämplig utrustning av utbildad personal.
  2. Sänk ner 6 möss i en bägare med 100 mL 75% etanol (vol/vol) för 5 min att förebygga bakteriell kontaminering och sedan placera en dissekering styrelsen i ryggläge. Gör ett snitt på den distala av skenbenet vertikalt och dissekera huden längs bakbenen med oftalmologiska sax.
  3. Skär den artikulära ligamentet i höftleden med sax och rubba bakbenen från stammen.
  4. Skär den artikulära ligamentet i knäleden och noggrant avassociera skenbenet och lårbenet från knäleden. Ta försiktigt bort den mjuka vävnaden med sax.
  5. Placera alla ben från en genotyp i en mus i varje brunn sex-brunn-platta med 2 mL av α-MEM på is.
    Obs: För att bevara cellernas viabilitet, benet hållas i dessa villkor för mindre än 1 h.

3. isolering (dag -1)

  1. Fyll en väl sex-well platta med 75% etanol (3 mL) och de andra 5 brunnarna med α-MEM medium (3 mL).
  2. Sätta alla ben från en genotyp i etanol tvätten för 15 s och tvätta benen 5 gånger med α-MEM medium för 10 s varje gång.
  3. Skär av epifyser med en sax och infoga en 0,45 mm sprutans nål i hålrum och flush benmärgen ut med α-MEM medium i ett 50 mL centrifugrör.
  4. Spola ben hålrummet med samma metod från andra änden av benet. Upprepa minst två gånger för att tvätta benet hålrummet tills benet är blek.
  5. Centrifugera benmärgen för att erhålla en cellpelleten vid 800 x g och 4 ° C i 5 min. Aspirera supernatanten.
  6. Tillsätt 3 mL röda blodkroppar lyseringsbuffert in i centrifugröret och pipetten försiktigt för att resuspendera benmärgen. Hålla centrifugröret på is i 8 min att lysera röda blodkroppar.
  7. Tillsätt 6 mL α-MEM medium i centrifugröret att stoppa cellys. Centrifugera vid 500 x g- och 4 ° C i 10 min och Aspirera supernatanten.
  8. Återsuspendera i 3 mL av α-MEM odlingsmedium och placera cellerna till en sex-well platta (allmänt en mus per brunn).
  9. Inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.

4. plätering (dag 0)

  1. Överför supernatanten till ett 15 mL centrifugrör att samla okopplade cellerna nästa morgon.
  2. Centrifugera vid 800 x g- och 4 ° C i 5 min och Aspirera supernatanten.
  3. Återsuspendera i 4 mL av α-MEM odlingsmedium.
  4. Ta 20 µL av den cell lösningen och blanda med 20 µL av Trypan blå. Tillsätt 10 µL av blandningen till räknande kammaren och få celltalet per mL lösning.
  5. Lägga till en lämplig volym av α-MEM odlingssubstrat att erhålla en cell lösning 500 000 celler/ml.
  6. Tillsätt 500 µL och 50 µL av benmärgen makrofag induktion medium i varje brunn för en 24-väl tallrik och plattan med 96 brunnar, respektive.
  7. Tillsätt 500 µL och 50 µL av cell lösning i varje brunn för en 24-väl tallrik och plattan med 96 brunnar, respektive.
  8. Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 3 dagar.

5. differentiering (3-7 dagar)

  1. Tre dagar efter plätering, samla 50 µL medium från varje brunn av 96-brunn-plattan och frysa vid-20 ° C och sug sedan upp resterande medium.
  2. Tillsätt 1 mL och 100 µL osteoclast induktion medium i varje brunn för en 24-bra platta och ett plattan med 96 brunnar, respektive.
  3. Inkubera vid 37 ° C i 2 dagar.
  4. Samla 50 µL av medium från varje brunn och aspirera kvarstående medlet.
  5. Tillsätt osteoclast induktion medium i varje brunn.
  6. Inkubera vid 37 ° C i 1 dag.
    Obs: Vid denna tidpunkt, stor, Multinucleära osteoklaster bör ses under en inverterade Mikroskop (figur 2A).
  7. Om osteoklaster inte ses, ändra osteoclast induktion medium och observera dagligen tills osteoklaster ses.
  8. Samla 50 µL av medium från varje brunn plattan med 96 brunnar efter osteoklaster har bildats.

6. tartrat resistenta syra fosfatas (TRAP) färgning

Obs: Mogna osteoklaster kan förekomma efter 6-7 dagar av in vitro- kultur (steg 4).

  1. Aspirera medium och tvätta försiktigt 3 gånger med 1 x PBS.
  2. Fixa cellerna i varje brunn plattan med 96 brunnar med 100 µL av fix-lösning för 30 s vid rumstemperatur.
  3. Efter fixering, sug ut den rätta lösningen och tvätta försiktigt 3 gånger med avjoniserat vatten föruppvärmd till 37 ° C. Aspirera avjoniserat vatten.
  4. Tillsätt 100 µL av TRAP fläcken i varje brunn av plattan med 96 brunnar och placera plattan i en inkubator vid 37 ° C för 30 min och sköld från ljus.
  5. Efter färgning, sug ut FÄLLAN fläcken och tvätta försiktigt 3 gånger med avjoniserat vatten.
  6. Bild osteoklaster använder ett inverterat Mikroskop med 40 X förstoring.

7. TRAP aktivitet kvantifiering av odlingsmedium

  1. Samla 30 µL kultur supernatant från varje brunn plattan med 96 brunnar från steg 5.1, 5.4 och 5,8; Använd 30 µL av icke-odlade osteoclast induktion medium som negativ kontroll. Placera proverna i en nya plattan med 96 brunnar.
  2. Tillsätt 90 μL substrat mixture(1.5.5) i varje brunn plattan med 96 brunnar.
  3. Placera plattan i en inkubator vid 37 ° C för 1 h och sköld från ljus.
  4. Stoppa reaktionen genom att lägga 50 µL av 3 M NaOH i varje brunn plattan med 96 brunnar.
  5. Mäta theabsorbance vid våglängden av 405 nm.

8. Western Blotting

Obs: Efter 6-7 dagar av in vitro- kultur i 24-väl plattan, mogna osteoklaster ska synas.

  1. Aspirera medium.
  2. Tvätta försiktigt med nedkylda 1 x PBS 3 gånger.
  3. Aspirera PBS.
  4. Tillsätt 100 µL av 1 x SDS lysis buffert innehållande proteashämmare cocktail.
  5. Värme lysates vid 105 ° C i 10 minuter och centrifugera vid 12.000 × g och 4 ° C i 10 min. samla supernatanterna som innehåller protein.
  6. Separera den lysates innehållande 30 µg av protein med 10% SDS-PAGE11 och sedan överföra till ett polyvinylidene fluor (PVDF) membran.
  7. Blockera membran med 5% nonfat mjölk i 30 min.
  8. Inkubera membran med anti Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-aktin på 1:1,000 spädning med 5% nonfat mjölk vid 4 ° C över natten.
  9. Tvätta membran med Tris buffrad koksaltlösning med Tween-20 (TBST) under 10 minuter vid rumstemperatur.
  10. Upprepa steg 8,9 två gånger.
  11. Inkubera membran med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad antimus eller kanin IgG-antikroppar vid 1:5,000 spädning med 5% nonfat mjölk för 1 h i rumstemperatur.
  12. Tvätta membranen 3 gånger med TBST i 10 min i rumstemperatur.
  13. För kemiluminiscent detektion, lägga till västra Kemiluminiscens HRP substrat på membranen och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Dränera överflödig substratet och exponera blopparna till röntgenfilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Använder detta protokoll, sågs ett stort antal giant osteoklaster på dag 6; om giant osteoklaster inte ses, en dag av osteoclast differentiering kan vara behövs (figur 1). Framgångsrika osteoclast bildandet bekräftades av TRAP färgning (figur 2A). Osteoklaster var jätte vin röd/lila celler med mer än 3 kärnor. Mer än 250 osteoklaster erhölls i varje brunn plattan med 96 brunnar i WT BMMs (figur 4A).

Radering av Raptor bekräftades av western blotting analys och inaktivering av mTORC1 bestämdes genom en minskning av ribosomala proteinet S6 fosforylering (P-S6), som används allmänt som avläsningen för mTORC1 (figur 3).

Det minskade antalet TRAP-positiv osteoklaster i RapCtsk BMMs jämfört med gruppen WT (figur 4A), som visade att Raptor brist försämras hos osteoklasterna bildandet.

Aktiviteten av sekretoriska FÄLLAN är viktigt för benresorption och TRAP-aktivitet i odlingsmediet analyserades i den aktuella studien. Som visas i figur 4B, TRAP-aktivitet ökade på grund av stimulering av RANKL både WT och RapCtsk BMMs. Dessutom TRAP-aktivitet minskade i RapCtskBMMs jämfört med motsvarande WT grupp (P < 0,05).

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av protokollet hos osteoklasterna induktion. BMMs var isolerad på dag 1 och inkuberas med grundläggande α-MEM medium över natten. Dag 0, BMMs samlades och pläterade på en 96 brunnar och 24-väl plåt följt av inkubation i α-MEM medium med 10 ng/mL M-CSF. Dag 3, har på medellång ändrats till α-MEM medium med 20 ng/mL M-CSF och 20 ng/mL RANKL för induktion av osteoclast differentiering. Dag 5 bytte osteoclast differentiering medium. På dag 6, ett stort antal osteoklaster var synliga och osteoclast analyser utfördes. Om osteoblaster inte var synlig, osteoclast induktion mediet har ändrats och inkubation fortsatte under en dag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: rättvisande bild av osteoklaster. (A) jätte osteoklaster observeras i ljusa fält på dag 6. Den röda linjen beskrivs gränsa av osteoklaster. (B), en vanligtvis jätte, Multinucleära, fälla positiva (vinröd) hos osteoklasterna. Den svarta pilen anges två kärnor av den Multinucleära osteoclast. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: mTORC1 inaktivering i RapCtsk BMMs. Western blotting analys av Raptor, P-S6 och S6 uttryck i WT och RapCtsk BMMs på dag 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Strykningen av Raptor nedsatt osteoclast bildandet. (A), fälla färgning av BMMs på dag 6. Hög förstoring bilder av torg WT och RapCtsk grupper visas, respektive. Det fanns mindre jätte, fälla positiva osteoklaster bildades de RapCtsk BMMs jämfört med WT-gruppen. (B), TRAP aktivitet av odlade WT och RapCtsk BMMs. Data representerar betyder ± S.D.* P < 0,05, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Osteoclastogenic analysen är den mest använda metoden för att isolera och kultur osteoklaster in vitro-12,13. Medan flera RANKL-baserade osteoclast induktioner har varit beskrivs13,14,15, beskrivs föreliggande studie ett protokoll med några ändringar baserat på föregående metoder.

I den tidigare studien BMMs plätering omedelbart efter isolering14,15. Vi rekommenderas att BMMs odlades med bassubstratet över natten före plätering att isolera BMMs från mesenkymala stamceller och fibroblaster som omedelbart följer till skålen. M-CSF kan främja spridningen av monocyter till osteoclast prekursorer och stimulera osteoclast prekursorer för att uttrycka rang som binder RANKL och sedan inducerar bildandet av mogna osteoklaster6,16,17. Därför, i vår studie, BMMs förmåddes med 10 ng/mL M-CSF i 3 dagar innan osteoclast induktion, istället för hos osteoklasterna induktion på den andra dagen efter plätering15. Cell densiteten är kritisk för osteoclast bildande in vitro. Det rekommenderas att 25.000 BMMs var seedad i varje brunn ett plattan med 96 brunnar efter av 3 dagars inkubation med 10 ng/mL M-CSF. När cellen sammanflödet nått 80-90%, är det en lämplig tid för osteoclast induktion av RANKL. Vanligtvis, mogna osteoklaster form på dag 6. Den vanligaste orsaken till några osteoklaster är suboptimal cell densiteten, som kan vara resultatet av en låg sådd densitet eller låg cellernas viabilitet. BMMs är delikat primärceller och måste behandlas varsamt. Att hålla benet på is under en lång tid eller omblandning kraftigt minskar lönsamheten för BMMs och därefter försämrar bildandet av osteoklaster. Således, optimal seeding tätheten av livskraftiga BMMs är kritiska för att få ett stort antal osteoklaster.

Aktiviteten av sekretoriska FÄLLAN är kritisk för osteoklastisk benresorption. I denna studie beskriver vi en metod för att kvantitativt analysera sekretoriska TRAP-aktivitet i odlingssubstratet. Ändringen av TRAP-aktivitet i odlingsmediet kan bero på ändringar av osteoclast nummer eller sekretoriska FÄLLAN av osteoclast eller en kombination av båda. Detta kan således vara en användbar metod för analysera osteoclast funktion i vitro tillsammans med osteoclast resorption analysen beskrivs tidigare18.

mTOR är ett evolutionärt bevarade proteinkinas som kan reglera cell metabolism och differentiering9. I denna studie fann vi att mTORC1 spelade en viktig roll i benresorption genom att reglera osteoclast bildandet. mTORC1 kan vara ett potentiellt farmakologiska mål för behandling av metaboliska skelettsjukdomar som osteoporos i framtiden.

Sammanfattningsvis, våra protokoll för osteoclast induktion resulterade framgångsrikt i ett stort antal giant osteoklaster in vitro- och våra data tyder på att mTORC1 är avgörande för osteoclast bildandet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författarna uppger att de har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr. Minghan Tong och S. Kato för vänligt ge reagenser och möss. Vi tacka medlemmarna i Zou lab för användbar diskussioner. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från 973 Program från den kinesiska ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta) [2014CB964704 och 2015CB964503], kliniska forskningsprogrammet 9 Peoples Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Tack för hjälp av Core faciliteten för Cellbiologi och Core facilitet för kemisk biologi, CAS Center for Excellence i molekylär Cell vetenskap, Shanghai Institute of biokemi och cellbiologi, kinesiska vetenskapsakademin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
En RANKL-baserade Osteoclast kultur analys av mus benmärgen att undersöka betydelsen av mTORC1 Osteoclast bildandet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter