Summary
该协议提供了实验步骤和有关试剂、设备和分析工具的信息, 这些研究人员有兴趣执行整个基因组阵列的比较基因组杂交 (计算全息) 对拷贝数变化的分析植物.
Abstract
突变体是基因功能研究的宝贵的遗传资源。为了产生突变体集合, 可利用三种诱变, 包括生物如 T-脱氧核糖核酸或转, 化学物质如甲基磺酸乙酯 (EMS), 或物理如电离辐射。所观察到的突变类型因所使用的诱变而异。对于电离辐射诱发突变体, 突变包括删除, 重复, 或重排。虽然 T-DNA 或 transposon-based 诱变仅限于易受转化的物种, 但化学或物理诱变可应用于种类繁多的物种。然而, 从化学或物理诱变衍生的突变的定性传统上依赖于地图的克隆方法, 这是劳动密集型和耗时。在这里, 我们表明, 一个高密度基因组阵列的比较基因组杂交 (aCGH) 平台可用于有效地检测和表征拷贝数变异 (cnv) 的突变从快中子轰击 (FNB) 突变中获得的苜蓿蒺藜, 豆科植物。整个基因组序列分析显示, 在m 蒺藜中有超过5万基因或基因模型。目前, FNB 诱发突变体的m. 蒺藜是从超过 15万 M1 线, 代表了宝贵的基因资源的功能研究的基因组。这里描述的 aCGH 平台是一个有效的工具, 用于表征 FNB 诱导突变体在m 蒺藜。
Introduction
豆类 (豆科) 是第三大家族的开花植物, 与许多经济上重要的物种, 如大豆 (甘氨酸 max) 和苜蓿 (苜蓿)。豆科植物可以与固氮土壤细菌相互作用, 通常称为根瘤菌来发展根结节, 将大气氮减少到氨供寄主植物使用。因此, 种植豆类作物需要很少的氮肥投入, 从而有助于可持续农业。豆类作物生产的叶子和种子的高蛋白含量, 作为优良的饲料和谷物作物。然而, 种植豆科植物通常有复杂的基因组结构, 使功能研究的基因发挥关键作用在豆类特定的过程繁琐。苜蓿蒺藜已被广泛采用为豆科植物的模型, 主要是因为 (1) 它有一个相对较小的单倍体基因组大小 (~ 550) 的二倍体基因组;(2) 植物可稳定转化为基因功能研究;和 (3) 它与紫花苜蓿 (m), 牧草皇后, 和许多其他经济重要的农作物的转化研究密切相关。最近, m 蒺藜cv Jemalong A17 的基因组序列已被释放12。对基因组的诠释显示, 基因组中有超过5万预测基因或基因模型。要确定m 蒺藜基因组中大多数基因的功能是一项具有挑战性的任务。为了促进基因的功能研究, 在 15万 M1线范围内, 利用快中子轰击 (FNB) 诱变, 在m. 蒺藜cv Jemalong A173中生成了一组突变体的综合集合.,4。快中子, 高能电离诱变, 已被用于在许多植物物种中生成突变体, 包括拟南芥5,6, 大米 (水稻品种)7, 西红柿 (茄汁番茄), 黄豆 (甘氨酸大豆;G. max)8,9, 大麦 (大麦大麦), 和莲花日本人10。从 FNB 诱变衍生出的很大一部分突变是由于 DNA 的缺失, 其范围从几个碱基对到巨型碱基对9,11。许多表型相关基因已被成功识别并具有特征4、12、13、14、15、16、17,18,19. 以前, FNB 突变体的潜在基因的分子克隆依赖于地图的方法, 这是时间消耗和限制分子水平的突变体数量。最近, 一些免费的方法, 包括 transcript-based 方法, 基因组平铺阵列的比较基因组杂交 (计算全息) 的 DNA 拷贝数变异检测, 和整个基因组测序, 已被用来促进不同生物体 (包括动植物) 中缺失突变体的特征20,21,22,2324,25 26,27,28,29,30,31。
为了便于在m. 蒺藜中对 FNB 突变体的定性, 开发并验证了基于基因组的整体比较基因组杂交 (计算全息) 平台。正如在动物系统中报告的那样, 基于阵列的全息计算平台允许在m. 蒺藜FNB 突变体的整个基因组水平检测拷贝数变体 (cnv)。此外, 病变可以通过 PCR 确认和删除边界可以确定的排序。总的来说, 阵列全息计算平台是一个有效的工具, 以识别病变的m 蒺藜FNB 突变体。本文对m 蒺藜FNB 突变体的阵列全息程序和删除边界的 PCR 特征进行了说明。
以下协议提供了实验步骤和有关试剂、设备和分析工具的信息, 这些研究人员有兴趣执行整个基因组阵列的比较基因组杂交 (计算全息) 拷贝数分析植物的变异。例如,苜蓿蒺藜FN6191 突变体用于识别与突变表型相关的缺失区域和候选基因。m 蒺藜FN6191 突变体, 最初是从快中子轰击引发的删除突变的集合中分离出来的32 (参见材料表), 在接种后用土壤展示了一个超级结瘤表型细菌, Sihorhizobium 根瘤菌Sm1021, 与野生型植物形成对比。
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Protocol
注意: 图 1 显示了数组计算全息协议的五步骤。它们是: 1) 制备植物材料;2) 分离高质量的 DNA 样本;3) DNA 样品的标记和纯化;4) 对整个基因组阵列进行杂交、冲洗和扫描;和 5) 计算全息数据分析。 m 蒺藜 整个基因组平铺阵列包含总共971041种独特的低聚体探针, 其目标是基因组中超过5万基因或基因模型 (参见 材料表 )。独特的探针间隔约每150基对 (bp) 在 exonic 地区和 261 bp 在子地区的 m 蒺藜 基因组.
1. 植物材料的制备
- 划破野生类型 (重量; m 蒺藜 cv Jemalong A17) 和 FN6191 突变种子, 浓缩硫酸为8分钟 (参见 材料表 )。将硫酸移至废液容器中.
- 用蒸压去离子水冲洗种子三次.
- 表面消毒20% 漂液的种子10分钟
- 用蒸压去离子水冲洗种子三次.
- 将种子储存在4和 #176; C 为3天。在春后, 在土壤中将种子在 16 h/8 h 光/暗循环和150和 #181 的生长腔中迁移和发芽一周; 电子/m 2 /秒的光照强度.
- 将幼苗移植到1加仑的花盆中, 在一个温室中生长 16 h/8 h 光/暗循环, 150 和 #181; 电子/m 2 /s 光强度为三周至四星期。收集来自植物的幼叶样本进行 DNA 分离.
2。高质量 DNA 样品的分离
- 从一株植物中提取1克幼叶组织, 并立即将其冷冻在液氮中.
- 在液氮中用砂浆和杵将冷冻叶组织研磨成细粉.
- 使用 dna 隔离套件分离基因组 dna (请参阅 材料表 ).
- 重50和 #181 纯化的 DNA 样品; 高压蒸双去离子 H 2 O (ddH 2 o) 或 1x TE 缓冲器 (10 毫米三盐酸, 1 毫米 EDTA, pH 7.0).
- 用分光光度计测量 DNA 浓度 (请参阅 材料表 ).
- 评估 260 nm/280 nm 和 260 nm/230 纳米 DNA 样本的比值.
注: 高质量的 DNA 样品应具有 260 nm/280 纳米比和 #8805; 1.8 和 260 nm/230 nm 比值和 #8805; 2.0. - 通过在1% 琼脂糖凝胶中运行, 进一步评估 DNA 样本.
注: 高质量的 DNA 样品应具有较高的分子量, 不应被 RNA 污染。理想的情况下, DNA 样本的最终浓度应该是 150 ng/和 #181; L.
3。DNA 标记和纯化
- 稀释1和 #181; g 基因组 DNA 样品与 ddH 2 O 到最后的容量20和 #181; l 在500和 #181; l 离心管。
- 添加5和 #181; L 随机入门 (请参阅 材料表 ) 到管道.
- 涡流管短暂, 并把它放入一个 thermocycler 孵化和变性 DNA 在98和 #176; C 为 10 min.
- 把管子从 thermocycler 中取出, 立即放在冰水上, 冷却5分钟.
- 准备两个标记混合, 如下所示 表 1 .
- 添加25和 #181; 标记混合1和 2, 分别引用 dna 和取样 dna 管.
- 将标签混合和 DNA 混合移三倍, 然后简单地旋转试管.
- 将管子放入 thermocycler, 在37和 #176 孵育; c 为2小时, 然后在65和 #176; c 为20分钟, 使外克莱诺酶钝化 (请参阅 材料表 ).
- 添加430和 #181; 1x 和 #160 的 L; 每根管子的缓冲器.
- 混合内容并简单地旋转管子.
- 将管道中的溶液转换为2毫升收集管的净化柱 (请参阅 材料表 ).
- 离心纯化柱在 1.4万 x g 为10分钟.
- 放弃传递解决方案.
- 在每列中添加480和 #181; L 1x 和 #160; TE 缓冲区.
- 在 1.4万 x g 上再次离心该列10分钟.
- 丢弃 pass-through 解决方案.
- 将残留在柱底部的标记 DNA 样本转移到新的离心管上.
- 使用吸管测量标记的 DNA 样本的体积, 并将最后的体积带到80和 #181; L 带有 1x TE 缓冲区.
- 使用分光光度计测量标记的 DNA 样本的浓度 (请参见 材料表 ).
- 混合等量的标记样本 dna 和参考 dna, 并将最终的体积带到160和 #181; L 与 #160; 1x TE 缓冲区.
- 添加256和 #181; l 2x 杂交缓冲, 50 和 #181; 人类 Cot-1 DNA 和50和 #181; l 10 和 #215; aCGH 阻塞代理 (请参阅 材料表 ), 并将它们移为三次.
- 旋转导管并将其放入 thermocycler, 在98和 #176 中孵育; C 为 10 min.
- 在37和 #176 孵育试管; C 为20分钟.
4。基因组阵列的杂交、洗涤和扫描
- 将杂交烤箱预热到67和 #176; 在杂交开始前至少4小时.
- 将垫片滑动到杂交室的底部.
- 从步骤3.23 中加载490和 #181; L 的杂交溶液到垫片滑动.
- 用一条 苜蓿蒺藜 基因芯片芯片来覆盖衬垫滑动, 形成杂交室.
- 投入杂交室盖子和紧固用夹子的房间.
- 将组装的杂交室放入杂交烤箱, 孵育67和 #176; C 为 40-48 h.
- 准备三滑动洗碗碟: 两个与250毫升洗涤缓冲区, 我保持在室温下, 一个与洗涤缓冲器 II 保持在37和 #176; C.
- 准备两个滑动洗涤罐: 一个带有70毫升乙腈, 一个带有70毫升稳定和干燥溶液; 在室温下保持通风罩 (请参阅 材料表 ).
- 将杂交室从烤箱中取出, 取出箱夹和盖子.
- 将微阵列芯片和垫片滑动到带洗涤缓冲器的滑动洗涤盘中, 并将芯片与盖板分开.
- 将微阵列芯片移动到第二个带洗涤缓冲的滑动洗涤盘中, 然后在室温下用搅拌板轻轻地将溶液循环到5分钟.
- 将微阵列芯片转移到第三个滑动洗涤盘上, 用5ml 洗涤缓冲器 II, 在37和 #176 的磁性搅拌板上轻轻地用搅拌棒冲洗; C 为 1 min.
- 将微阵列芯片转移到一个通风柜中, 并将其洗净三十年代.
- 将微阵列芯片转移到带有稳定和干燥溶液的滑动洗涤罐中, 并将其洗净三十年代.
- 慢慢取出芯片, 晾干1分钟.
- 使用扫描仪扫描微阵列芯片 (请参阅 2 和 #181; m 分辨率下的材料表 )。设置参数以保存多个图像和整个幻灯片扫描。将通道1和2的增益设置为 100%, 并取消自动增益.
5。计算全息数据分析
- 提取 Cy3 和 Cy5 荧光使用扫描软件对阵列上每个探测器的强度 (请参见 材料表 ).
- 使用软件的分段分析来检测样本 dna 和参考 dna 之间的拷贝数变化 (cnv)。使用段的阈值意味着日志 2 采样/参考比和 #177; 2.5 标准偏差用于确定 cnv.
- 使用信号映射软件 (请参阅 材料表 ) 在整个基因组中检查日志的分布情况 2 样本/参考比率.
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Representative Results
图 2显示了在整个基因组中, 突变体与重量信号的归一化对数2比值的分布。对计算全息数据的分析显示, 4 号染色体上大约有 22 kb 的删除, 它包含了整个SUNN基因33和 FN6191 突变体中的其他一些注释基因 (图 2,图 3)。候选删除区域被73连续探针覆盖, 该阵列的平均正常化日志2比小于-2.5 (补充表 1)。对删除边界的检查表明, 该突变体中的假定删除是由位于坐标22313168和22334934号染色体 4 (图 3) 之间的探针所左右。为了确认删除边界, PCR 引物被设计为大约 1500 bp 除预测的删除边界之外 (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT;FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) 和 PCR 扩增进行了这些引物和以下参数:94 ° c, 5 分钟;94° c, 四十五年代, 55 ° c, 三十年代, 72 ° c, 1.5 min;35周期;72° c, 10 分钟, 然后10° c 无限期。正如所料, 一个单一的 PCR 产品大约 1.5 kb 成功地从 FN6191 突变体, 但不是小波 (图 4A)。基于m 蒺藜基因组释放 v3.5, FN 6191 中的删除大小估计为 26.67 kb (图 4B)。计算结果显示, FN6191 突变基因组中没有其他异常片段 (图 2)。
图 1: 阵列比较基因组杂交 (aCGH) 分析m 蒺藜突变体的工作流.(A) 制备植物材料: m 蒺藜野生型 (Jemalong A17) 和 FN6191 突变体在温室中生长了三周至四星期。(B) 分离高质量的基因组 dna: 从单一植物中提取一克幼叶用于分离基因组 dna。用分光光度计和凝胶电泳法测定 DNA 质量。(C) DNA 标记和纯化。参考基因组 dna 和实验样品被标记为青菁 3 (Cy3) 和 Cy5 使用 DNA 标记试剂盒和纯化使用的纯化柱。(D)杂交、洗涤和扫描 1 x 1 m m 蒺藜计算全息阵列。(E) 计算全息分析: Log2实验/参考信号的比值小于或等于-2.5 或大于或等于 2.5, 分别被视为假定的删除和重复。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 基于阵列的比较基因组杂交分析m 蒺藜超结瘤突变体 FN6191 的复制数变化.显示的是日志2变种/野生类型的探测器在所有八染色体上的比率。4号染色体上的连续73探针区域被确定为突变体 (箭头) 中的被删除区域。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。m 蒺藜FN6191 变种的已删除区域的标识.在4号染色体上的近距离观察, 其中73微阵列探针显著减少了日志2突变/野生类型比值, 以及六映射基因, 包括SUNN (Medtr4g070970)。箭头指示了用于 PCR 放大删除边界的引物的位置和方向。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: m 蒺藜FN6191 变种的删除边框确认.(a) 删除边界的 PCR 放大: 1.5 kb 产品从 FN6191 突变体使用引物侧翼删除边界 (车道 1;亩)。同一组引物没有放大任何产品从重量 (m 蒺藜Jemalong A17) 由于一个大小限制 PCR (车道 2;重量)。车道 M, 1 kb 梯子。(B) FN6191 突变体中删除结点的序列。箭头表示删除连接。(C) 测序结果表明, 删除边界 (箭头) 位于4号染色体上的坐标22309163和22335836上。请单击此处查看此图的较大版本.
| 标签组合1 | 每反应 x 样品 # (μ l) | 标签组合2 | 每反应 x 参考 # (μ l) |
| ddH2O | 6.0 x | ddH2O | 6.0 x |
| 5x 缓冲器 | 10.0 x | 5x 缓冲器 | 10.0 x |
| 10x dNTPs | 5.0 x | 10x dNTPs | 5.0 x |
| 菁5 | 3.0 x | 菁3 | 3.0 x |
| 外克莱诺 | 1.0 x | 外克莱诺 | 1.0 x |
| 总 | 25 x | 总 | 25 x |
表 1: 标签混合。
补充表 1: 在 m 蒺藜 FN6191 突变体中删除的探针序列。
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Discussion
我们已经开发了一个基于阵列的计算全息平台, 用于检测和表征快中子轰击 (FNB) 诱发突变体的m 蒺藜cv Jemalong A17。为了证明阵列全息计算方法在检测基因突变中的应用, 我们对突变 FN6191 进行了 aCGH 分析, 并与野生型植物形成了高结瘤表型, 并与S. 根瘤菌 Sm1021进行了接种。对于分段分析, 如果段中的探测器的日志2比率的平均值高于上限阈值或低于该给定数组比较的下限阈值, 则认为该段是很重要的。每个比较的上限阈值都被确定为所有数据点第九十五百分点的日志2比值。每个比较的较低阈值被确定为所有数据点的第五百分点的日志2比值值24。
我们的分析表明, 可以通过检索具有平均规范化日志2比平均值大于 2.5 sd (重复) 或小于平均 2.5 sd (删除) 的段来确定显著的拷贝数变化。基于计算全息分析, 我们检测到一个在4号染色体上估计大小为 22 kb 的删除区域, 包含SUNN基因33。排序结果确认删除大小为 26.67 kb, 基于m 蒺藜基因组释放 v3.5。已经表明, SUNN对 CLV1-like 亮氨酸重复受体激酶进行编码, 控制m 蒺藜33中的结核数。我们的计算全息结果表明, FN6191 是一个新的SUNN等位基因。基于这些结果, 我们认为, 与表型和遗传分析相结合的全息方法可以成功地用于快速识别 FNB 缺失突变体中的候选基因。在过去的几年中, 我们使用这个平台来识别和表征许多 FNB 突变体的基因功能研究在m 蒺藜34,35。我们生成了与 FNB 突变线36相关的拷贝数变体 (cnv) 的数据库。在这个数据库中, 从计算全息分析中删除的序列超过100证实共生结瘤突变体已被映射到m 蒺藜基因组。已设置了一个爆炸服务器, 以便在突变集合中搜索已删除的序列。开发和进一步扩展删除数据库将是非常宝贵的功能基因组研究使用m 蒺藜FNB 突变资源。
aCGH 协议有五主要步骤。虽然所有步骤都是重要的, 应该按照前面所描述的那样仔细地进行, 以下是特别重要的: (1) DNA 样本不应退化, 不应被 RNA 污染的准备步骤;(2) 测试和参考 DNA 样本应同样做好准备, 使标记的样品具有相同的高质量;(3) 标记的 DNA 样本不应暴露在高强度的光和高水平的臭氧;(4) 在洗涤过程中, 保持洗涤缓冲液 II 在37° c 是重要的。
当前m 蒺藜基因组阵列的覆盖范围主要在 exonic 区域, 而在子区域较少, 而在基因区域则不是。如果这些区域的病灶对突变表型有重要的作用, 则后区域的覆盖范围可以改善。另一方面, 目前的探针设计在识别小突变和单核苷酸多态性 (snp) 方面的能力较低。这一限制可以通过使用计算全息 + SNP 芯片设计37来克服。总的来说, 基于基因组的比较基因组杂交 (aCGH) 平台是一个强大的工具, 分析复制数量和结构变化的m. 蒺藜FNB 突变体。
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Disclosures
作者声明没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作的经费部分是由 NSF 植物基因组研究 (IOS-1127155) 的赠款提供的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
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