Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.

Abstract

Mutanten zijn onschatbare waarde genetische hulpbronnen voor gene functie studies. Voor het genereren van mutant collecties, kunnen drie soorten mutagene agentia worden gebruikt, met inbegrip van biologische zoals T-DNA of transposon, zoals ethyl methanesulfonate (EMS) chemische of fysische zoals ionisatie straling. Het soort mutatie waargenomen varieert afhankelijk van de mutagene stof gebruikt. Mutaties omvatten ionisatie straling geïnduceerde mutanten, verwijdering, duplicatie of omlegging. Terwijl T-DNA of op basis van transposon mutagenese beperkt tot de soorten die vatbaar voor transformatie is zijn, kan chemische of fysische mutagenese worden toegepast op een breed scala van soorten. De karakterisering van mutaties afgeleid van chemische of fysische mutagenese traditioneel is echter afhankelijk van een kaart-gebaseerde klonen benadering die arbeid intensief en tijdrovend is. Hier, laten we zien dat een high-density genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (aCGH) platform kan worden toegepast om efficiënt detecteren en karakteriseren van kopie aantal variaties (CNVs) in mutanten afgeleid van snelle neutronen bombardement (FNB) mutagenese in Medicago truncatula, een peulvrucht soorten. Volledige genoomanalyse van de reeks toont aan dat er meer dan 50.000 genen of gene modellen in M. truncatula. Bij de huidige, FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula zijn afgeleid van meer dan 150.000 M1 lijnen, die van onschatbare waarde plantgenetische hulpbronnen voor functionele studies van genen in de genoom. Het platform van de aCGH hier beschreven is een doeltreffend instrument voor het karakteriseren van FNB-geïnduceerde mutanten in M. truncatula.

Introduction

Peulvruchten (Fabaceae) is de derde grootste familie van tweezaadlobbige planten, met vele economisch belangrijke soorten zoals sojabonen (Glycine max) en luzerne (Medicago sativa). Peulvruchten planten kunnen communiceren met stikstof-vaststelling bodem bacteriën, Rhizobium om root knobbeltjes waarin de atmosferische dinitrogen is gereduceerd tot ammoniak voor gebruik door de waardplant genoemd. Als zodanig, teelt van peulvruchten gewassen vereist weinig inbreng van stikstof meststoffen en draagt aldus bij aan duurzame landbouw. Peulvruchten gewassen produceren bladeren en zaden met een hoog eiwitgehalte, bijeenkomen uitstekend ruwvoer en graan gewassen. Gecultiveerde peulvrucht soorten hebben echter over het algemeen complex genoom structuren, functionele studies van genen die spelen een sleutelrol in peulvruchten-specifieke processen omslachtig maken. Medicago truncatula is wijd goedgekeurd als een soort model voor peulvruchten studies vooral omdat (1) het heeft een diploïde genoom met een relatief kleine haploïde genoom grootte (~ 550 Mbp); (2) planten kunnen stabiel worden omgezet voor gene functionele studies; en (3) het is nauw verwant aan alfalfa (M. sativa), de koningin van voedergewassen en vele andere economisch belangrijke gewassen voor translationeel onderzoek. Onlangs, het genoom van M. truncatula cv Jemalong A17 geweest vrijgegeven1,2. Annotatie van het genoom laat zien dat er meer dan 50.000 voorspelde genen of modellen van het gen in het genoom. Om te bepalen van de functie van de meeste van de genen in de M. truncatula is genoom een uitdagende taak. Ter vergemakkelijking van functionele studies van genen, een uitgebreide verzameling van mutanten in het bereik van meer dan 150.000 M1 lijnen is gegenereerd met behulp van snelle neutronen bombardement (FNB) mutagenese in M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Snelle neutronen, een energierijke ionisatie mutageen, is gebruikt bij het genereren van mutanten in vele plantensoorten met inbegrip van Arabidopsis5,6, rijst (Oryza sativa)7, tomaat (Solanum lycopersicum), sojabonen (Glycine soja; G. max)8,9, gerst (Hordeum vulgare), en Lotus japonicus10. Een groot deel van mutaties afgeleid van FNB mutagenese zijn als gevolg van DNA deleties die variëren in grootte van een paar basenparen op mega basenpaar9,11. Vele fenotype-geassocieerde genen met succes zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. eerder, moleculaire klonen van de onderliggende genen van FNB mutanten vertrouwd op een kaart gebaseerde benadering, die is tijdrovend en beperkt het aantal mutanten te worden gekenmerkt op moleculair niveau. Onlangs, verscheidene gratis benaderingen, met inbegrip van transcriptie gebaseerde methoden, genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) voor DNA kopie nummer variatie detectie, en hele genoom sequencing, plavuizen zijn tewerkgesteld te vergemakkelijken de karakterisering van schrapping mutanten in verschillende organismen, met inbegrip van dieren en planten20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

Om te vergemakkelijken de karakterisatie van FNB mutanten in M. truncatula, een geheel-genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) is platform ontwikkeld en gevalideerd. Zoals gemeld in dierlijke systemen, maakt het platform CGH arraygebaseerd de ontdekking van kopie aantal variaties (CNVs) op het niveau van de hele genoom in M. truncatula FNB mutanten. Bovendien, letsels kunnen worden bevestigd door PCR en schrapping grenzen kunnen worden geïdentificeerd door sequentiebepaling. Over het geheel genomen is de matrix CGH platform een efficiënte en effectieve hulpmiddel bij het identificeren van de laesies in M. truncatula FNB mutanten. Hier, worden de matrix CGH procedure en PCR karakterisering van schrapping grenzen in een M. truncatula FNB mutant geïllustreerd.

Het volgende protocol voorziet experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van volledige genoomanalyse arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) van exemplaaraantal variaties in planten. Als voorbeeld, werd Medicago truncatula FN6191 mutant gebruikt om te identificeren schrapping regio's en de kandidaat-genen mutant fenotypen is gekoppeld. M. truncatula FN6191 mutant, oorspronkelijk geïsoleerd van een snelle neutronen schrapping bombardement-geïnduceerde gemuteerde collectie32 (Zie Tabel of Materials), een hyper-nodulatie fenotype tentoongesteld na inoculatie met de bodem bacterie, Sihorhizobium meliloti heeft Sm1021, in tegenstelling tot wild type planten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: afbeelding 1 ziet u de vijf stappen voor de array CGH protocol. Ze zijn: 1) voorbereiding van plantaardig materiaal; 2) isolatie van DNA-monsters van hoge kwaliteit; 3) labelen en zuivering van DNA-monsters; 4) hybridisatie, wassen, en scannen van gehele genoom arrays; en 5) CGH data-analyse. M. truncatula hele genoom betegeling matrices bevatten een totaal 971,041 unieke oligo sondes gericht op meer dan 50.000 genen of modellen van het gen in het genoom (Zie tabel van materialen). De unieke sondes worden verdeeld ongeveer elke 150 basenparen (bp) in de exonic regio's en 261 bp in intronic gebieden van het genoom van M. truncatula.

1. voorbereiding van plantaardig materiaal

  1. Scarify wild type (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) en mutant zaden van de FN6191 met geconcentreerd zwavelzuur gedurende 8 minuten (Zie Tabel van materialen). Verwijderen en verwijderen van zwavelzuur aan een vloeibaar afval container.
  2. Zaden met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water Spoel driemaal.
  3. Oppervlak steriliseren zaden met 20% bleekwater oplossing gedurende 10 minuten
  4. Zaden met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water Spoel driemaal.
  5. Winkel zaden bij 4 ° C gedurende 3 dagen. Na vernalisatie, overdracht en ontkiemen van zaden in de bodem voor een week in de zaal van een groei met 16/8 uur licht/donker cyclus en 150 µE/m 2/s intensiteit licht.
  6. Overplanten zaailingen aan 1 gallon potten en ze groeien in een kas met 16/8 uur licht/donker cyclus, 150 µE/m 2/s lichtintensiteit voor drie tot vier weken. Verzamelen van monsters van het jonge blad van de planten voor DNA isolatie.

2. Isolatie van hoge kwaliteit DNA-monsters

  1. 1 g van het jonge blad weefsel van een enkele plant nemen en het in vloeibare stikstof onmiddellijk bevriezen.
  2. Bevroren blad weefsel in vloeibare stikstof met een mortier en een stamper aan fijne poeder vermalen.
  3. Isoleren van genomic DNA met een DNA-isolatie kit (Zie Tabel of Materials).
  4. Resuspendeer gezuiverd DNA-monsters in 50 µL van gesteriliseerde met autoclaaf dubbele gedeïoniseerd H 2 O (ddH 2 van O) of 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).
  5. Maatregel DNA concentraties met een spectrofotometer (Zie Tabel of Materials).
  6. Evalueren 260 nm/280 nm en 260 nm/230 nm ratio's van de DNA-monsters.
    Opmerking: Hoge kwaliteit DNA-monsters moeten een 260 nm/280 nm verhouding ≥ 1.8 en een 260 nm/230 nm verhouding ≥ 2.0.
  7. Verder evalueren DNA-monsters door draait ze in 1% agarose gel.
    Opmerking: Hoge kwaliteit DNA-monsters moeten ultrahoog moleculair gewicht en moeten niet worden besmet door RNA. Idealiter moet de uiteindelijke concentratie van DNA-monsters ~ 150 ng/µL.

3. DNA Labeling en zuivering

  1. verdunnen 1 µg genomic DNA monsters met ddH 2 O tot een eindvolume van 20 µL in een centrifugebuis 500 µL.
  2. Toevoegen 5 µL van een willekeurige primer (Zie Tabel van materialen) aan de buis.
  3. Vortex kort de buis en leg het in een thermocycler Incubeer te denatureren van DNA bij 98 ° C gedurende 10 minuten
  4. De slang uit de thermocycler en zet het meteen op ijswater om te relaxen gedurende 5 minuten
  5. Voorbereiden twee labeling mixen zoals aangegeven in tabel 1.
  6. Voeg toe 25 µL van labeling mixen 1 en 2 op verwijzing DNA en monster DNA-buizen, respectievelijk.
  7. Meng de labeling mix en DNA door pipetteren driemaal en draai de buizen kort.
  8. Zet de buizen in een thermocycler te incuberen bij 37 ° C gedurende 2 uur, waarna bij 65 ° C gedurende 20 min naar de inactivering van de exo-Klenow enzym (Zie Tabel of Materials).
  9. Toevoegen 430 µL 1 x TE buffer aan elke buis.
  10. Mix van de inhoud en de buizen kort draaien.
  11. Overdracht de oplossing in de buis in een kolom van de zuivering met een verzameling van 2 mL tube (Zie Tabel of Materials).
  12. Centrifuge de zuivering kolom 14.000 x g gedurende 10 minuten
  13. Negeren van de pass through-oplossing.
  14. Toevoegen 480 µL 1 x TE buffer aan elke kolom.
  15. Centrifuge de kolom opnieuw 14.000 x g gedurende 10 minuten
  16. Negeren van de Pass Through-oplossing.
  17. Overbrengen van de gelabelde DNA-monster, dat op het onderste gedeelte van de kolom naar een nieuwe centrifugebuis blijft.
  18. Meten van de omvang van de gelabelde DNA-monster met behulp van een precisiepipet en het eindvolume brengen 80 µL met 1 x TE buffer.
  19. Meten van de concentratie van de gelabelde DNA-monster met behulp van een spectrofotometer (Zie Tabel of Materials).
  20. Mengen van een gelijke hoeveelheid van gelabelde monster DNA en verwijst naar DNA en brengen het eindvolume 160 µL met 1 x TE buffer.
  21. Toevoegen 256 µL van 2 x kruising buffer, 50 µL van menselijk DNA van het Cot-1 en 50 µL van 10 × aCGH blokkerende agent (Zie Tabel van materialen) en meng ze door goed voor driemaal pipetteren.
  22. Draai de buizen kort en leg ze in een thermocycler aan Incubeer bij 98 ° C gedurende 10 minuten
  23. Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 20 minuten

4. Hybridisatie, wassen, en scannen van de genoom matrices

  1. vooraf warm de oven hybridisatie 67 ° C ten minste 4 uur vóór de aanvang van de hybridisatie.
  2. Plaats een pakking dia op de basis van een hybridisatie kamer.
  3. Load 490 µL van hybridisatie oplossing van stap 3.23 op de dia die pakking.
  4. Dekking van de dia van de pakking met een Medicago truncatula genoom microarray chip te vormen een hybridisatie kamer.
  5. Zetten de hybridisatie kamer covers en draai de kamer stevig met klemmen.
  6. Zet de geassembleerde hybridisatie kamer in de kruising oven en Incubeer bij 67 ° C voor 40-48 h.
  7. Voorbereiden drie dia afwas: twee met 250 mL buffer wassen ik bewaard bij kamertemperatuur en één met het wassen van de buffer II bewaard bij 37 ° C.
  8. Voorbereiden twee dia wassen van kruiken: één met 70 mL acetonitril en één met 70 mL stabilisatie en drogen oplossing; Bewaar beide in een zuurkast bij kamertemperatuur (Zie Tabel of Materials).
  9. De hybridisatie kamer Verwijder uit de oven en verwijder de kamer klemmen en cover.
  10. Verplaatsen de microarray chip- en pakking Schuif naar een schotel dia wassen met wash buffer ik en scheiden van de spaander van de dia deksel.
  11. Zet de microarray chip bij de tweede dia wassen schotel met was buffer ik en zachtjes circuleren de oplossing met een roer-bar op een plaat van de magnetische roer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten
  12. Overdracht de microarray chip naar de derde dia wassen met voorverwarmde wassen buffer II schotel en wassen het zachtjes met een roer-bar op een plaat van de magnetische roer bij 37 ° C gedurende 1 min.
  13. De microarray chip overbrengen in een dia pot met acetonitril in een zuurkast te wassen en wassen voor 30 s.
  14. De microarray chip overbrengen in een dia pot met stabilisatie wassen en drogen van de oplossing en wassen voor 30 s.
  15. Neem de chip langzaam en droog het voor 1 min.
  16. Scan de microarray chip met behulp van een scanner (Zie Tabel van materialen) onder 2 µm resolutie. Instellen van de parameters wilt opslaan meerdere afbeeldingen en hele dia scans. Kanalen 1 en 2 winsten op 100% instelt en annuleren van de automatische winst.

5. CGH gegevensanalyse

  1. Extract de Cy3 en Cy5 fluorescentie intensiteiten voor elke sonde op de array gebruikmakend van scansoftware (Zie Tabel of Materials).
  2. Gebruik segmentatie analyse van de software te detecteren kopie aantal variaties (CNVs) tussen het monster DNA en DNA van de referentie. Een drempel van het segment gemiddelde log 2 monster/verwijzing verhouding ± 2,5 standaarddeviaties gebruiken voor het bepalen van CNVs.
  3. Inspecteren van de verdeling van de log 2 monster/verwijzing ratio's over het hele genoom gebruikend een signaal mapping software (Zie Tabel of Materials).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 2 geeft de distributie van genormaliseerde log2 verhoudingen van mutant versus WT signalen over het hele genoom. Analyse van CGH gegevens bleek benaderend 22 kb schrapping op chromosoom 4, die de gehele SUNN gene33 en diverse andere omvat geannoteerde genen in de mutant FN6191 (Figuur 2, Figuur 3). De kandidaat-verwijderde regio werd gecoverd door 73 opeenvolgende sondes op de array met de gemiddelde genormaliseerde log2 ratio's minder dan -2,5 (aanvullende tabel 1). Een inspectie van de grenzen van de schrapping voorgesteld dat de vermeende verwijdering in deze mutant wordt geflankeerd door sondes gelegen tussen coördinaten 22,313,168 en 22,334,934 op chromosoom 4 (Figuur 3). Om te bevestigen de schrapping grenzen, PCR inleidingen werden ontworpen om ongeveer 1.500 bp afgezien van de voorspelde schrapping grenzen (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) en PCR versterking werd uitgevoerd met deze inleidingen en de volgende parameters: 94 ° C, 5 min; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 1.5 min; voor 35 cycli; 72 ° C, 10 min en dan 10 ° C voor onbepaalde tijd. Zoals verwacht, werd met succes een één PCR-product van ongeveer 1,5 kb versterkt uit de FN6191 mutant, maar niet WT (figuur 4A). Op basis van de M. truncatula genoom Uitgave v3.5, werd de grootte van de schrapping in FN 6191 geschat op 26.67 kb (figuur 4B). De CGH resultaten toonden aan dat geen andere abnormale segmenten aanwezig in de FN6191 mutant genoom (Figuur 2 zijn).

Figure 1
Figuur 1: Workflow van matrix vergelijkende genomic hybridisatie (aCGH) analyse van M. truncatula mutant. (A) voorbereiding van plantaardig materiaal: M. truncatula wild type (Jemalong A17) en FN6191 mutant werden geteeld voor drie tot vier weken in kas. (B) isolatie van hoge kwaliteit genomic DNA: één gram jonge bladeren uit enkele planten werd gebruikt voor het isoleren van genomic DNA. Kwaliteit van het DNA werd bepaald met behulp van een spectrofotometer en gel elektroforese. (C) DNA labeling en zuivering. Genomic DNAs-systeem van de referentie- en experimentele monsters werden aangeduid met Cyanine 3 (Cy3) en Cy5 met behulp van een DNA-labeling kit en gezuiverd met behulp van een zuivering kolom. (D) hybridisatie, wassen, en scannen van 1 x 1 M M. truncatula CGH matrix. (E) CGH analyse:2 ratio's van experimentele/verwijzing signalen die kleiner is dan of gelijk is aan -2,5 Log of groter is dan of gelijk aan 2,5 worden beschouwd als vermeende deleties en duplicaties, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Array gebaseerde vergelijkende genomic hybridisatie analyse van kopie nummer variaties in M. truncatula hyper nodulatie mutant FN6191. Weergegeven zijn log2 mutant/wild type verhoudingen van sondes op alle acht chromosomen. Een opeenvolgende 73-sonde-regio op chromosoom 4 werd aangeduid als de verwijderde regio in de mutant (pijl). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Identificatie van de verwijderde regio M. truncatula FN6191 mutant. Een vergrote weergave van de regio op chromosoom 4, waarin 73 sondes voor microarray tentoongesteld aanzienlijk verminderd log2 mutant/wild type ratio's, en zes toegewezen genen met inbegrip van SUNN (Medtr4g070970). Pijlen geven aan dat de locatie en richting van inleidingen voor PCR versterking van schrapping grenzen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Bevestiging van verwijdering grenst aan in M. truncatula FN6191 mutant. (A) PCR versterking van schrapping grenzen: een 1.5 kb product werd versterkt uit de FN6191 mutant gebruikend inleidingen flankerend de schrapping grenzen (lane 1; MU). De dezelfde reeks inleidingen deed niet versterken van alle producten van WT (M. truncatula Jemalong A17) als gevolg van een beperking van de grootte van de PCR (lane 2; WT). Lane M, 1 kb ladder. (B) sequenties van het kruispunt van de schrapping in de mutant FN6191. Een pijl geeft de kruising van de verwijdering. (C) Sequencing resultaten toonde aan dat de verwijdering grenzen (pijlen) zich op de coördinaten 22309163 en 22335836 op chromosoom 4 bevinden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Labelen van mix 1 Per reactie x proeven # (l) Mix 2 labeling Per reactie x verwijst naar # (l)
ddH2O 6.0 x ddH2O 6.0 x
5 x Buffer 10.0 x 5 x Buffer 10.0 x
10 x dNTPs 5.0 x 10 x dNTPs 5.0 x
Cyanine 5 3.0 x Cyanine 3 3.0 x
Exo-Klenow 1.0 x Exo-Klenow 1.0 x
Totaal 25 x Totaal 25 x

Tabel 1: Labelen mixen.

Aanvullende tabel 1: Sonde sequenties verwijderd in M. truncatula FN6191 mutant.
Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben een arraygebaseerd CGH platform ontwikkeld voor de detectie en karakterisatie van snelle neutronen bombardement (FNB)-geïnduceerde mutanten in M. truncatula cv. Jemalong A17. Om aan te tonen het gebruik van de array CGH methode voor het opsporen van genmutaties, we aCGH analyse van de mutant FN6191, die tentoongesteld van een hyper-nodulatie fenotype in tegenstelling tot wild type planten, wanneer geënt met S. meliloti Sm1021uitgevoerd. Voor segmentatie analyse, werd een segment beschouwd als de verhouding van de2 log betekenen van de sondes binnen het segment was boven de bovenste grenswaarde of de lagere drempel voor die vergelijking van de gegeven array. De bovenste drempel voor elke vergelijking was vastbesloten om de log2 verhouding waarde van het 95e percentiel van alle gegevenspunten. De lagere drempel voor elke vergelijking was vastbesloten om de log2 verhouding waarde van het 5e percentiel van alle gegevens punten24.

Onze analyse toonde aan dat belangrijke kopie nummer wijzigingen kunnen worden bepaald door het ophalen van segmenten met een gemiddelde genormaliseerde log2 verhouding groter is dan het gemiddelde van 2.5 SD (dubbel) of kleiner is dan het gemiddelde van 2.5 SD (schrapping). Op basis van CGH analyse, ontdekt we een schrapping regio met een geschatte omvang van 22 kb op chromosoom 4, omvat de SUNN gene33. Sequencing resultaten bevestigd dat de verwijdering grootte 26.67 kb op basis van M. truncatula genoom Uitgave v3.5. Het is aangetoond dat SUNN codeert een CLV1-achtige leucine-rijke herhalen receptor kinase waarmee het nummer van de knobbel in M. truncatula33. Onze CGH resultaten suggereren dat FN6191 een nieuwe SUNN allel is. Op basis van deze resultaten, redeneerde we dat de methode CGH gepaard met fenotypische en genetische analyse kan met succes worden gebruikt snel kandidaat om genen te identificeren in FNB schrapping mutanten. In de afgelopen jaren, hebben we dit platform in de identificatie en karakterisering van talrijke FNB mutanten voor gene functionele studies in M. truncatula34,35gebruikt. We hebben een database van kopie aantal variaties (CNVs) die zijn gekoppeld aan FNB mutant lijnen36gegenereerd. In deze database bevestigd verwijderde sequenties van CGH analyses van meer dan 100 symbiotische nodulatie mutanten zijn toegewezen aan het genoom M. truncatula . Een blast server opgezet ter vergemakkelijking van het zoeken naar verwijderde sequenties in de mutant collectie. De ontwikkeling en de verdere expansie van de schrapping database zou zeer waardevol voor functionele genomica-onderzoek met behulp van M. truncatula FNB mutant middelen.

Het aCGH-protocol heeft vijf hoofdstappen. Hoewel alle stappen belangrijk zijn en moeten worden uitgevoerd zorgvuldig zoals eerder beschreven, de achterban zijn vooral kritisch: (1) DNA-monsters moeten niet worden gedegradeerd en moet niet worden besmet door RNA tijdens de bereiding stap; (2) test- en referentiestoffen DNA-monsters moet even goed voorbereid zijn zodat de gelabelde monsters van dezelfde hoge kwaliteit zijn; (3) gelabelde DNA-monsters mag niet worden blootgesteld aan een hoge intensiteit van licht en een hoog niveau van ozon; en (4) het is belangrijk om te wassen Buffer II bij 37 ° C te houden tijdens het wassen stap.

De dekking van de huidige M. truncatula genoom matrix is voornamelijk op de exonic van de regio's en minder op de intronic van de regio's, en helemaal niet in de intergenic regio's. De berichtgeving in de laatste regio's kan worden verbeterd als laesies in deze regio's belangrijk voor mutant fenotypen zijn. Aan de andere kant, heeft het huidige ontwerp van de sonde minder macht in kleine mutaties en één nucleotidepolymorfisme (SNPs) te identificeren. Deze beperking kan worden overwonnen met behulp van CGH + SNP microarray ontwerp37. Over het geheel genomen is het genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (aCGH) platform een krachtig hulpmiddel voor de analyse van exemplaaraantal en structurele variaties in M. truncatula FNB mutanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Financiering van dit werk wordt geleverd ten dele door een subsidie van NSF plantenonderzoek genoom (IOS-1127155).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

Tags

Genetica kwestie 129 Medicago truncatula snelle neutronen bombardement mutanten arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie kopiëren nummer variatie mutatie detectie mutatie
Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde <em>Medicago truncatula</em> mutanten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang,… More

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter