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Genetics

तेज़ न्यूट्रॉन-प्रेरित मेडिकागो truncatula म्यूटेंट में प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों के कुशल डिटेक्शन के लिए एक सरणी-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण प्लेटफ़ॉर्म

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रायोगिक कदम और रिएजेंट, उपकरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और विश्लेषण उपकरण शोधकर्ताओं जो बाहर ले जाने में रुचि रखते है के लिए पूरी जीनोम ऐरे-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) विश्लेषण में प्रतिलिपि संख्या में भिंनता पौधे.

Abstract

म्यूटेंट जीन फंक्शन स्टडीज के लिए अमूल्य आनुवंशिक संसाधन हैं. उत्परिवर्ती संग्रह उत्पन्न करने के लिए, तीन प्रकार के mutagens का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें जैविक जैसे टी-डीएनए या transposon, केमिकल जैसे एथिल methanesulfonate (ईएमएस), या ionization विकिरण जैसे भौतिक शामिल हैं । उत्परिवर्तन के प्रकार मनाया mutagen इस्तेमाल के आधार पर बदलता रहता है । ionization विकिरण प्रेरित म्यूटेंट के लिए, उत्परिवर्तनों विलोपन, दोहराव, या पुनर्व्यवस्था शामिल हैं । जबकि T-डीएनए या transposon आधारित mutagenesis प्रजातियों कि परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं करने के लिए सीमित है, रासायनिक या भौतिक mutagenesis प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, रासायनिक या शारीरिक mutagenesis से व्युत्पंन उत्परिवर्तनों के लक्षण पारंपरिक रूप से एक नक्शा आधारित क्लोनिंग दृष्टिकोण है, जो श्रम गहन और समय लेने पर निर्भर करता है । यहां, हम बताते है कि एक उच्च घनत्व जीनोम सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (aCGH) मंच पर लागू किया जा सकता है कुशलता से पता लगाने और प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों (CNVs) में तेजी से न्यूट्रॉन बमबारी (म्यूटेंट) एफएनबी से व्युत्पंन mutagenesis में की विशेषता मेडिकागो truncatula, एक फली प्रजाति । पूरे जीनोम अनुक्रम विश्लेषण से पता चलता है कि एम. truncatulaमें ५०,००० से अधिक जीन या जीन मॉडल हैं । वर्तमान में, एम. truncatula में एफएनबी-प्रेरित म्यूटेंट १५०,००० M1 से अधिक लाइनों से व्युत्पंन हैं, जीनोम में जीन के कार्यात्मक अध्ययन के लिए अमूल्य आनुवंशिक संसाधनों का प्रतिनिधित्व । aCGH मंच यहां वर्णित है निस्र्पक एफएनबी में प्रेरित म्यूटेंट के लिए एक कुशल उपकरण है एम. truncatula।

Introduction

फलियां (फैबेसी) फूलों के पौधों का तीसरा सबसे बड़ा परिवार हैं, जैसे सोयाबीन (Glycine max) और अल्फला (मेडिकागो sativa) के रूप में कई आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के साथ । फली पौधों नाइट्रोजन के साथ बातचीत कर सकते है मिट्टी के बैक्टीरिया फिक्सिंग, आम तौर पर कहा जाता है कि जड़ पिंड जिसमें वायुमंडलीय dinitrogen मेजबान संयंत्र द्वारा उपयोग के लिए अमोनिया के लिए कम है विकसित करने के लिए Rhizobia । जैसे, फली फसलों की खेती नाइट्रोजन उर्वरकों के थोड़ा इनपुट की आवश्यकता है और इस तरह टिकाऊ कृषि के लिए योगदान देता है । फली फसलें उच्च प्रोटीन सामग्री के साथ पत्तियों और बीजों का उत्पादन, उत्कृष्ट चारा और अनाज फसलों के रूप में सेवारत । हालांकि, खेती फली प्रजातियों आम तौर पर जटिल जीनोम संरचनाओं है, जीन है कि फली-विशिष्ट प्रक्रियाओं बोझिल में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के कार्यात्मक अध्ययन कर रही है । मेडिकागो truncatula व्यापक रूप से फली अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रजातियों के रूप में अपनाया गया है मुख्यतः क्योंकि (1) यह एक अपेक्षाकृत छोटे अगुणित जीनोम आकार (~ ५५० Mbp) के साथ एक द्विगुणित जीनोम है; (२) पौधों को छुरा जीन कार्यात्मक अध्ययन के लिए रूपांतरित किया जा सकता है; और (3) यह बारीकी से अल्फला (एम. sativa), चारा की रानी, और कई अंय अनुवाद अध्ययन के लिए आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों से संबंधित है । हाल ही में, एम truncatula सीवी Jemalong A17 के जीनोम अनुक्रम1,2जारी किया गया है । जीनोम के एनोटेशन से पता चलता है कि वहां से अधिक ५०,००० की भविष्यवाणी की जीन या जीनोम में जीन मॉडल हैं । एम. truncatula जीनोम में अधिकांश जीनों का कार्य निर्धारित करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य है. जीन के कार्यात्मक अध्ययन की सुविधा के लिए, १५०,००० मीटर से अधिक1 लाइनों की सीमा में म्यूटेंट का एक व्यापक संग्रह एम truncatula में तेजी से न्यूट्रॉन बमबारी (एफएनबी) mutagenesis का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है ,4. तेज न्यूट्रॉन, एक उच्च ऊर्जा ionization mutagen, म्यूटेंट पैदा करने में प्रयोग किया गया है जिनमें कई पादप प्रजातियों में Arabidopsis5,6, चावल (धान्य sativa)7, टमाटर (मकोय lycopersicum), सोयाबीन (Glycine सोज़; G. max)8,9, जौ (Hordeum अश्लीलता), और लोटस japonicus10. एफएनबी mutagenesis से व्युत्पंन परिवर्तन का एक बड़ा हिस्सा डीएनए विलोपन कि कुछ आधार जोड़े से आकार में मेगा आधार जोड़े9,11के लिए सीमा के कारण हैं । कई phenotype-जुड़े जीनों को सफलतापूर्वक पहचाना गया है और4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. पहले, एफएनबी म्यूटेंट से अंतर्निहित जीन के आणविक क्लोनिंग एक नक्शे पर भरोसा आधारित दृष्टिकोण है, जो समय लगता है और म्यूटेंट की संख्या सीमा को आणविक स्तर पर विशेषता है । हाल ही में, प्रतिलिपि सहित कई मानार्थ दृष्टिकोण आधारित तरीकों, जीनोम छत सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) डीएनए की प्रतिलिपि संख्या भिन्नता का पता लगाने के लिए, और पूरे जीनोम अनुक्रमण, की सुविधा के लिए नियोजित किया गया है पशुओं और पौधों सहित विविध जीवों में विलोपन म्यूटेंट का लक्षण वर्णन20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

एम. truncatulaमें एफएनबी म्यूटेंट के लक्षण वर्णन की सुविधा के लिए, एक पूरे जीनोम सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) मंच विकसित और मांय किया गया है । के रूप में पशु प्रणालियों में बताया, सरणी आधारित CGH मंच की नकल की खोज की अनुमति देता है संख्या रूपांतरों (CNVs) में पूरे जीनोम के स्तर पर एम. truncatula एफएनबी म्यूटेंट । इसके अलावा, घावों पीसीआर द्वारा पुष्टि की जा सकती है और विलोपन सीमाओं अनुक्रमण द्वारा पहचाना जा सकता है । कुल मिलाकर, सरणी CGH मंच एम. truncatula एफएनबी म्यूटेंट में घावों की पहचान करने में एक कुशल और प्रभावी उपकरण है । यहां, सरणी CGH प्रक्रिया और एक एम. truncatula एफएनबी उत्परिवर्ती में हटाने की सीमाओं की पीसीआर लक्षण सचित्र हैं ।

निंनलिखित प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक कदम और रिएजेंट के बारे में जानकारी प्रदान करता है, उपकरणों और विश्लेषण उपकरण शोधकर्ताओं जो बाहर ले जाने में रुचि रखते है के लिए पूरी जीनोम ऐरे-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) प्रतिलिपि संख्या का विश्लेषण पौधों में भिन्नता । एक उदाहरण के रूप में, मेडिकागो truncatula FN6191 उत्परिवर्ती विलोपन क्षेत्रों और उंमीदवार उत्परिवर्ती phenotypes के साथ जुड़े जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । एम. truncatula FN6191 उत्परिवर्ती, मूल रूप से एक तेज न्यूट्रॉन बमबारी से पृथक-प्रेरित विलोपन उत्परिवर्ती संग्रह३२ ( सामग्री की तालिकादेखें), मिट्टी के साथ टीका के बाद एक हाइपर-nodulation phenotype का प्रदर्शन जीवाणु, Sihorhizobium meliloti Sm1021, जंगली प्रकार के पौधों के विपरीत ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 सरणी CGH प्रोटोकॉल के लिए पांच चरणों का पता चलता है. वे हैं: 1) संयंत्र सामग्री की तैयारी; 2) उच्च गुणवत्ता डीएनए नमूनों की अलगाव; 3) लेबलिंग और डीएनए नमूनों की शुद्धि; 4) संकरण, धुलाई, और पूरे जीनोम arrays के स्कैनिंग; और 5) CGH डेटा विश्लेषण । M. truncatula पूरे जीनोम छत arrays ९७१,०४१ अद्वितीय oligo के जीनोम में ५०,००० से अधिक जीन या जीन मॉडल को लक्षित जांच की कुल होते है ( सामग्री की मेज देखें) । अद्वितीय जांच exonic क्षेत्रों में लगभग हर १५० आधार जोड़े (बीपी) स्थान रहे है और २६१ एम. truncatula जीनोम के intronic क्षेत्रों में बीपी ।

< p class = "jove_title" > 1. पौध सामग्री की तैयारी

  1. Scarify जंगली प्रकार (WT; एम truncatula cv Jemalong A17) और 8 मिनट के लिए केंद्रित सल्फर एसिड के साथ FN6191 उत्परिवर्ती बीज ( सामग्री की तालिका देखें) । एक तरल अपशिष्ट कंटेनर के लिए सल्फर एसिड निकालें और छोड़ें ।
  2. autoclaved पानी के साथ तीन बार कुल्ला बीज ।
  3. सतह 10 min.
    4. के लिए 20% ब्लीच समाधान के साथ बीज निष्फल
  4. autoclaved पानी के साथ तीन बार कुल्ला बीज ।
  5. 3 दिन के लिए 4 & #176; C पर भंडार बीज । vernalization के बाद, स्थानांतरण और एक सप्ताह के लिए मिट्टी में अंकुरित बीज 16 एच के साथ एक विकास कक्ष में/8 एच प्रकाश/डार्क साइकिल और १५० & #181; E/m 2 /प्रकाश तीव्रता ।
  6. प्रत्यारोपण 1 गैलन बर्तन करने के लिए अंकुर और उन्हें 16 घंटे के साथ एक ग्रीनहाउस में विकसित/8 ज प्रकाश/डार्क साइकिल, १५० & #181; E/एम 2 /तीन से चार सप्ताह के लिए प्रकाश की तीव्रता । डीएनए अलगाव के लिए पौधों से युवा पत्ती के नमूने लीजिए ।
< p class = "jove_title" > 2. उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए नमूनों की अलगाव

  1. एक एकल संयंत्र से युवा पत्ती ऊतक के 1 जी ले और यह तरल नाइट्रोजन में तुरंत फ्रीज ।
  2. एक मोर्टार और ठीक पाउडर के लिए मूसल के साथ तरल नाइट्रोजन में जमे हुए पत्ती ऊतक पीस ।
  3. डीएनए अलगाव किट के साथ जीनोमिक डीएनए अलग ( सामग्री की मेज देखें) ।
  4. reसस्पेंड ५० में शुद्ध डीएनए नमूने & #181; L के autoclaved डबल की ज 2 ओ (ddH 2 ओ) या 1x ते बफर (10 एमएम Tris-एचसीएल, 1 एमएम EDTA, पीएच ७.०).
  5. एक spectrophotometer के साथ डीएनए सांद्रता उपाय ( सामग्री की मेज देखें) ।
  6. का मूल्यांकन २६० एनएम/280 एनएम और २६० एनएम/230 एनएम अनुपात डीएनए नमूनों की ।
    नोट: उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए नमूने एक २६० एनएम होना चाहिए/280 एनएम अनुपात & #8805; १.८ और एक २६० एनएम/230 एनएम अनुपात & #8805; २.०.
  7. आगे उन्हें 1% agarose जैल में चलाकर डीएनए नमूनों का मूल्यांकन करें ।
    नोट: उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए नमूने उच्च आणविक वजन होना चाहिए और आरएनए द्वारा प्रदूषित नहीं किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, डीएनए नमूनों की अंतिम एकाग्रता होनी चाहिए ~ १५० एनजी/& #181; L.
< p class = "jove_title" > 3. डीएनए लेबलिंग और शुद्धि

  1. पतला 1 & #181; छ जीनोमिक डीएनए नमूनों की ddH 2 O के साथ एक अंतिम खंड को 20 & #181; l in a ५०० & #181; l केंद्रापसारक tube.
  2. Add 5 & #181; एक यादृच्छिक प्राइमरी के एल (देखें टेबल सामग्री के लिए) ट्यूब.
  3. भंवर ट्यूब संक्षेप में और यह एक thermocycler में डाल करने के लिए मशीन और ९८ & #176 पर डीएनए स्वभाव 10 मिनट के लिए सी.
  4. thermocycler से बाहर ट्यूब ले और बर्फ के पानी पर तुरंत डाल करने के लिए ठंडा करने के लिए 5 min.
  5. तालिका 1 .
    6. में दिखाए गए के रूप में दो लेबलिंग घोला जा सकता तैयार
  6. Add 25 & #181; लेबलिंग के एल घोला जा सकता है 1 और 2 के लिए संदर्भ डीएनए और नमूना डीएनए ट्यूबों, क्रमशः.
  7. मिश्रण तीन बार pipetting द्वारा लेबलिंग मिश्रण और डीएनए और ट्यूबों संक्षेप में स्पिन ।
  8. एक thermocycler में ट्यूबों डाल करने के लिए ३७ पर मशीन & #176; ग के लिए 2 ज और उसके बाद ६५ & #176 पर, exo-Klenow एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए 20 मिनट के लिए सी ( सामग्री की तालिका देखें).
  9. Add ४३० & #181; L of 1x & #160; ते प्रत्येक ट्यूब के लिए बफर.
  10. सामग्री मिश्रण और ट्यूबों संक्षेप में स्पिन ।
  11. एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब के साथ एक शुद्धि कॉलम में ट्यूब में समाधान हस्तांतरण ( सामग्री की मेज देखें) ।
  12. 10 min.
    13. के लिए १४,००० x g पर शुद्धि कॉलम केंद्रापसारक
  13. समाधान के माध्यम से दर्रा त्यागें ।
  14. Add ४८० & #181; L 1x & #160; ते प्रत्येक कॉलम के लिए बफर.
  15. 10 मिनट के लिए १४,००० x g पर कॉलम फिर से केंद्रापसारक
  16. -थ्रू समाधान छोड़ें ।
  17. लेबल डीएनए नमूना है कि कॉलम के नीचे भाग में एक नया केंद्रापसारक ट्यूब के लिए रहता है हस्तांतरण ।
  18. एक पिपेट का उपयोग कर लेबल डीएनए नमूने की मात्रा को मापने और ८० & #181 के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए, 1x ते बफर के साथ L.
  19. एक spectrophotometer का उपयोग कर लेबल डीएनए नमूना की एकाग्रता को मापने (सामग्री की तालिका देखें).
  20. नमूना डीएनए और संदर्भ डीएनए लेबल की एक बराबर राशि मिश्रण और १६० & #181 के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए; L with & #160; 1x ते बफर.
  21. Add २५६ & #181; 2x संकरण बफर, ५० & #181; l के मानव खाट-1 डीएनए और ५० & #181; l के 10 & #215; aCGH ब्लॉकिंग एजेंट (सामग्री के तालिका देखें) और उंहें अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए pipetting द्वारा तीन बार ।
  22. ट्यूबों संक्षेप में स्पिन और उंहें एक thermocycler में ९८ & #176 में डाल दिया, 10 मिनट के लिए सी.
  23. पर ट्यूब ३७ & #176; ग के लिए 20 min.
< p class = "jove_title" > 4. संकरण, धुलाई, और जीनोम arrays की स्कैनिंग

  1. पूर्व-गर्म करने के लिए संकरण ओवन ६७ & #176; ग से कम 4 ज पहले संकरण शुरू होता है ।
  2. एक संकरण चैंबर के आधार पर एक गैसकेट स्लाइड प्लेस ।
  3. लोड ४९० & #181; L के संकरण समाधान से चरण ३.२३ गैसकेट स्लाइड पर.
  4. एक मेडिकागो truncatula जीनोम microarray चिप के साथ गैसकेट स्लाइड कवर के लिए एक संकरण चैंबर के रूप में ।
  5. संकरण चैंबर पर डाल कवर और clamps के साथ मजबूती से चैंबर कस ।
  6. संकरण ओवन में इकट्ठे संकरण चैंबर डाल दिया और ६७ & #176; C के लिए ४०-४८ h.
    7. पर मशीन
  7. तीन स्लाइड वाशिंग व्यंजन तैयार: २५० एमएल धोने बफर के साथ दो मैं कमरे के तापमान पर रखा, और एक धोने बफर द्वितीय के साथ ३७ पर रखा & #176; C.
  8. दो स्लाइड वाशिंग जार तैयार करें: ७० मिलीलीटर acetonitrile के साथ एक और ७० मिलीलीटर स्थिरीकरण और सुखाने समाधान के साथ एक; कमरे के तापमान पर एक धुएं डाकू में दोनों रखें (सामग्री की तालिका देखें) ।
  9. ओवन से संकरण चैंबर निकालें और चैंबर clamps हटाने और कवर.
  10. microarray चिप और धोने बफर मैं और कवर स्लाइड से चिप अलग से एक स्लाइड वाशिंग डिश के लिए स्लाइड गैसकेट हटो ।
  11. धोने बफर के साथ दूसरी स्लाइड धोने डिश के लिए microarray चिप चाल मैं और धीरे से 5 min.
    12. के लिए कमरे के तापमान पर एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर एक हलचल बार के साथ समाधान प्रसारित
  12. पूर्व गर्म धोने बफर द्वितीय के साथ तीसरी स्लाइड वॉशिंग डिश के लिए microarray चिप हस्तांतरण और इसे धीरे से धो ३७ & #176 पर एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर एक हलचल पट्टी के साथ 1 मिनट के लिए सी.
  13. एक धुएं हूड में acetonitrile के साथ एक स्लाइड वाशिंग जार के लिए microarray चिप हस्तांतरण और यह 30 एस के लिए धो
  14. स्थिरीकरण और सुखाने समाधान के साथ एक स्लाइड वाशिंग जार के लिए microarray चिप हस्तांतरण और 30 एस
    15. के लिए धो
  15. बाहर चिप धीरे ले और 1 min.
    16. के लिए सूखी
  16. स्कैन microarray चिप का उपयोग कर एक स्कैनर (देखें तालिका सामग्री ) के तहत 2 & #181; मी संकल्प. एकाधिक छवियां और पूरी स्लाइड स्कैन को सहेजने के लिए पैरामीटर्स सेट करें । सेट चैनलों 1 और 2 १००% को लाभ और ऑटो लाभ रद्द करें ।
< p class = "jove_title" > 5. CGH डेटा विश्लेषण

  1. निकालें Cy3 और Cy5 प्रतिदीप्ति सरणी स्कैनिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पर प्रत्येक जांच के लिए तीव्रता (सामग्री के तालिका देखें) ।
  2. नमूना डीएनए और संदर्भ डीएनए के बीच कॉपी संख्या रूपांतरों (CNVs) का पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर के फॉल्ट विश्लेषण का उपयोग करें । सेगमेंट के थ्रेशोल्ड का उपयोग करें माध्य लॉग 2 नमूना/संदर्भ अनुपात & #177; २.५ निर्धारित करने के लिए मानक विचलन CNVs.
  3. एक संकेत मानचित्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरे जीनोम में लॉग 2 नमूना/संदर्भ अनुपात के वितरण का निरीक्षण (सामग्री के तालिका देखें) ।

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Representative Results

चित्रा 2 पूरे जीनोम भर में WT सिग्नल के उत्परिवर्ती बनाम सामान्यीकृत लॉग2 अनुपात के वितरण से पता चलता है । CGH डेटा का विश्लेषण 4 गुणसूत्र है कि पूरे SUNN जीन३३ और FN6191 उत्परिवर्ती (चित्रा 2, चित्रा 3) में कई अंय व्याख्या की जीन शामिल पर एक लगभग 22 kb विलोपन से पता चला । हटाए गए क्षेत्र के उंमीदवार ७३ लगातार जांच से कवर किया गया मतलब सामान्यीकृत लॉग2 अनुपात से कम-२.५ (पूरक तालिका 1) के साथ सरणी पर । विलोपन सीमाओं के एक निरीक्षण का सुझाव दिया है कि इस उत्परिवर्ती में ख्यात विलोपन २२,३१३,१६८ और २२,३३४,९३४ गुणसूत्र 4 पर (चित्रा 3) के बीच स्थित जांच द्वारा बाजू है । हटाने की सीमाओं की पुष्टि करने के लिए, पीसीआर प्राइमरों अनुमानित विलोपन सीमाओं के अलावा लगभग १,५०० बीपी होना करने के लिए डिजाइन किए गए थे (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) और पीसीआर प्रवर्धन इन प्राइमरों और निम्नलिखित मापदंडों के साथ प्रदर्शन किया गया था: ९४ ° c, 5 min; ९४ ° c, ४५ एस, ५५ ° c, 30 एस, ७२ ° c, १.५ मिनट; ३५ चक्र के लिए; ७२ ° c, 10 मिनट और फिर 10 ° c अनिश्चित काल तक । जैसा कि उंमीद थी, लगभग १.५ kb की एक एकल पीसीआर उत्पाद सफलतापूर्वक FN6191 उत्परिवर्ती से परिवर्धित किया गया था, लेकिन नहीं WT (चित्र 4a) । एम. truncatula जीनोम रिलीज v 3.5 के आधार पर, एफ एन ६१९१ में विलोपन के आकार २६.६७ kb (चित्रा 4B) होने का अनुमान था । CGH परिणाम से पता चला है कि कोई अंय असामांय क्षेत्रों FN6191 उत्परिवर्ती जीनोम में मौजूद है (चित्रा 2) ।

Figure 1
चित्रा 1: सरणी के कार्यप्रवाह तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (aCGH) विश्लेषण के एम. truncatula उत्परिवर्ती । (क) पौध सामग्रियों की तैयारी: M. truncatula वंय प्रकार (Jemalong A17) और FN6191 उत्परिवर्ती ग्रीनहाउस में तीन से चार सप्ताह के लिए उगाया गया । (ख) उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए के अलगाव: एकल पौधों से युवा पत्तियों के एक ग्राम जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । डीएनए गुणवत्ता एक spectrophotometer और जेल ट्रो का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । (ग) डीएनए लेबलिंग और शुद्धि । संदर्भ और प्रयोगात्मक नमूनों की जीनोमिक DNAs Cyanine 3 (Cy3) के साथ लेबल और एक डीएनए लेबलिंग किट का उपयोग कर Cy5 और शुद्ध एक शुद्धि कॉलम का उपयोग कर रहे थे । (घ) संकरण, धुलाई, और 1 x 1 एम एम truncatula CGH सरणी की स्कैनिंग । (ङ) CGH विश्लेषण: २.५ या इससे बड़ा या बराबर करने के लिए २.५ से कम या बराबर है प्रयोगात्मक/संदर्भ संकेतों के लॉग2 अनुपात क्रमशः ख्यात विलोपन और दोहराव के रूप में माना जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण विश्लेषण की प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों में M. truncatula हाइपर nodulation उत्परिवर्ती FN6191 । दिखाया गया है2 उत्परिवर्ती लॉग/सभी आठ गुणसूत्रों पर जांच के जंगली प्रकार अनुपात । गुणसूत्र 4 पर एक लगातार ७३-जांच क्षेत्र उत्परिवर्ती (तीर) में हटाए गए क्षेत्र के रूप में पहचाना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. एम. truncatula FN6191 उत्परिवर्ती में हटाए गए क्षेत्र की पहचान । 4 गुणसूत्र, जिसमें ७३ microarray जांच प्रदर्शित काफी कम2 उत्परिवर्ती/जंगली प्रकार के अनुपात, और SUNN (Medtr4g070970) सहित छह मैप किए गए जीनों पर क्षेत्र के एक बंद-अप देखें । तीर हटाने सीमाओं की पीसीआर प्रवर्धन के लिए स्थान और प्राइमरों की दिशा से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एम. truncatula FN6191 उत्परिवर्ती में विलोपन सीमाओं की पुष्टि । (क) विलोपन सीमाओं के पीसीआर प्रवर्धन: एक १.५ kb उत्पाद FN6191 उत्परिवर्ती विलोपन सीमाओं (लेन 1 के अस्तर प्राइमरों का उपयोग करने से परिलक्षित किया गया था; म्यूर). प्राइमरों के ही सेट WT (एम. truncatula Jemalong A17) से कोई उत्पाद नहीं बढ़ाना था कारण पीसीआर का आकार सीमा (लेन 2; Wt) । लेन एम, 1 केबी सीढ़ी । (ख) FN6191 उत्परिवर्ती में विलोपन जंक्शन का अनुक्रम । एक तीर हटाने जंक्शन का अर्थ है । (ग) अनुक्रमण परिणाम से पता चला है कि विलोपन सीमाओं (तीर) निर्देशांक २२३०९१६३ और २२३३५८३६ गुणसूत्र 4 पर स्थित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लेबलिंग मिश्रण 1 प्रति प्रतिक्रिया x नमूना # (μL) लेबल मिश्रण 2 प्रति प्रतिक्रिया x संदर्भ # (μL)
ddH२हे ६.० x ddH२हे ६.० x
5x बफर १०.० x 5x बफर १०.० x
10x dNTPs ५.० x 10x dNTPs ५.० x
Cyanine 5 ३.० x Cyanine ३ ३.० x
Exo-Klenow १.० x Exo-Klenow १.० x
कुल 25 x कुल 25 x

तालिका 1: लेबलिंग घोला जा सकता है ।

पूरक तालिका 1: जांच अनुक्रम एम. truncatula FN6191 उत्परिवर्ती में नष्ट कर दिया ।
कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

हम एक सरणी आधारित CGH मंच का पता लगाने और तेज न्यूट्रॉन बमबारी (एफएनबी) के लक्षण वर्णन के लिए विकसित किया है-प्रेरित म्यूटेंट M. truncatula cv. Jemalong A17 में । जीन उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सरणी CGH विधि के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हम उत्परिवर्ती FN6191, जो जंगली प्रकार के पौधों के विपरीत में एक हाइपर-nodulation phenotype प्रदर्शन के aCGH विश्लेषण प्रदर्शन किया, जब एस inoculated melilotiके साथ Sm1021 । सेगमेंट के विश्लेषण के लिए, एक सेगमेंट को महत्वपूर्ण समझा गया था, अगर सेगमेंट में जांचों के लॉग2 अनुपात का मतलब ऊपरी सीमा से ऊपर या उस दी गई सरणी तुलना के लिए निचली सीमा के नीचे था. प्रत्येक तुलना के लिए ऊपरी थ्रेशोल्ड सभी डेटा बिंदुओं के 95th शतमक का लॉग2 अनुपात मान होना निर्धारित किया गया था । प्रत्येक तुलना के लिए निचली सीमा का निर्धारण सभी डेटा बिंदुओं24के 5वें शतमक के लॉग2 अनुपात मान के लिए किया गया था ।

हमारे विश्लेषण से पता चला कि महत्वपूर्ण प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन एक औसत सामान्यीकृत लॉग2 अनुपात औसत से २.५ एसडी (दोहराव) या २.५ एसडी (विलोपन) द्वारा औसत से अधिक से अधिक के साथ क्षेत्रों को पुनः प्राप्त करने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । CGH विश्लेषण के आधार पर, हम 4 गुणसूत्र पर 22 केबी के एक अनुमानित आकार के साथ एक विलोपन क्षेत्र का पता चला, SUNN जीन३३शामिल । sequencing परिणाम की पुष्टि की कि हटाने का आकार २६.६७ kb M. truncatula जीनोम रिलीज़ v 3.5 के आधार पर किया गया था । यह दिखाया गया है कि SUNN encodes एक CLV1 की तरह leucine-रिच दोहराने रिसेप्टर कळेनासे कि एम. truncatulaमें पिंड नंबर नियंत्रण३३। हमारे CGH परिणाम सुझाते है कि FN6191 एक नया SUNN एलील है । इन परिणामों के आधार पर, हम CGH विधि phenotypic और आनुवंशिक विश्लेषण के साथ मिलकर सफलतापूर्वक एफएनबी विलोपन म्यूटेंट में उंमीदवार जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कारण । पिछले कई वर्षों में, हम की पहचान करने में इस मंच का इस्तेमाल किया है और निस्र्पक में जीन कार्यात्मक अध्ययन के लिए कई एफएनबी म्यूटेंट एम. truncatula३४,३५। हम एफएनबी उत्परिवर्ती लाइनों३६के साथ जुड़े प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों (CNVs) का एक डाटाबेस तैयार किया है । इस डेटाबेस में, १०० से अधिक की CGH विश्लेषणों से हटाए गए अनुक्रम पुष्टि सहजीवी nodulation म्यूटेंट M. truncatula जीनोम के लिए मैप किया गया है । एक विस्फोट सर्वर स्थापित किया गया है उत्परिवर्ती संग्रह में हटाए गए दृश्यों के लिए खोज की सुविधा । विलोपन डाटाबेस के विकास और आगे विस्तार कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान के लिए अत्यधिक मूल्यवान होगा M. truncatula एफएनबी उत्परिवर्ती संसाधनों का उपयोग कर ।

aCGH प्रोटोकॉल पांच प्रमुख कदम है । हालांकि सभी कदम महत्वपूर्ण है और ध्यान से बाहर किया जाना चाहिए के रूप में पहले वर्णित है, निंनलिखित विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं: (1) डीएनए नमूनों नीचा नहीं होना चाहिए और तैयारी कदम के दौरान आरएनए से प्रदूषित नहीं किया जाना चाहिए; (2) परीक्षण और संदर्भ डीएनए नमूने समान रूप से अच्छी तरह से तैयार किया जाना चाहिए ताकि लेबल नमूने एक ही उच्च गुणवत्ता के हैं; (3) लेबल डीएनए नमूने प्रकाश की एक उच्च तीव्रता और ओजोन के एक उच्च स्तर को उजागर नहीं किया जाना चाहिए; और (4) यह धोने के कदम के दौरान ३७ ° c पर वाशिंग बफर द्वितीय रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।

वर्तमान M. truncatula जीनोम सरणी का कवरेज मुख्य रूप से exonic क्षेत्रों पर और intronic क्षेत्रों पर कम है, और intergenic क्षेत्रों में बिल्कुल नहीं है । बाद के क्षेत्रों में कवरेज में सुधार किया जा सकता है अगर इन क्षेत्रों में घावों उत्परिवर्ती phenotypes के लिए महत्वपूर्ण हैं । दूसरी ओर, वर्तमान जांच डिजाइन छोटे उत्परिवर्तनों और एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) की पहचान करने में कम शक्ति है । इस सीमा को CGH + SNP microarray डिज़ाइन३७का उपयोग कर दूर किया जा सकता है । कुल मिलाकर, जीनोम सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (aCGH) मंच कॉपी संख्या और एम. truncatula एफएनबी म्यूटेंट में संरचनात्मक रूपांतरों के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

इस काम के वित्तपोषण NSF संयंत्र जीनोम अनुसंधान (IOS-११२७१५५) से एक अनुदान द्वारा भाग में प्रदान की जाती है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

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आनुवंशिकी अंक १२९ मेडिकागो truncatula तेज न्यूट्रॉन बमबारी म्यूटेंट सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण प्रतिलिपि संख्या भिन्नता उत्परिवर्तन का पता लगाने उत्परिवर्तन
तेज़ न्यूट्रॉन-प्रेरित <em>मेडिकागो truncatula</em> म्यूटेंट में प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों के कुशल डिटेक्शन के लिए एक सरणी-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण प्लेटफ़ॉर्म
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