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Genetics

Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

Questo protocollo fornisce la procedura sperimentale e informazioni su reagenti, attrezzature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di variazioni del numeri di copie in piante.

Abstract

I mutanti sono risorse inestimabili genetiche per gli studi di funzione del gene. Per generare collezioni mutante, tre tipi di agenti mutageni possono essere utilizzati, tra cui biologico come T-DNA o trasposoni, chimiche quali methanesulfonate etilico (EMS) o fisici come le radiazioni di ionizzazione. Il tipo di mutazione osservata varia a seconda del mutageno utilizzato. Per ionizzazione indotta da radiazioni mutanti, mutazioni includono l'eliminazione, la duplicazione o la riorganizzazione. Mentre è limitata alle specie che sono suscettibili di trasformazione T-DNA o basati su trasposone mutagenesi, mutagenesi chimica o fisica può essere applicata a una vasta gamma di specie. Tuttavia, la caratterizzazione delle mutazioni derivato da mutagenesi chimica o fisica tradizionalmente si basa su un approccio di clonazione sulla mappa, che è lavoro intensivo e richiede tempo. Qui, indichiamo che una piattaforma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) genoma ad alta densità può essere applicata per rilevare e caratterizzare le variazioni del numero di copia (CNV) in mutanti derivati da mutagenesi di bombardamento (FNB) di neutroni veloci in efficacemente Medicago truncatula, una specie di legume. Analisi di sequenza del genoma intero dimostra che ci sono più di 50.000 geni o modelli di gene in M. truncatula. Mutanti presenti, FNB-indotta in M. truncatula sono derivati da più di 150.000 linee M1, che rappresentano preziose risorse genetiche per studi funzionali dei geni nel genoma. La piattaforma di aCGH descritta qui è un efficace strumento per la caratterizzazione di mutanti FNB-indotta in M. truncatula.

Introduction

Leguminose (Fabaceae) sono la terza più grande famiglia di piante fiorite, con molte specie economicamente importanti come soia (Glycine max l.) e l'erba medica (Medicago sativa). Piante leguminose possono interagire con azoto-fissazione di batteri del suolo, generalmente chiamato Rhizobia a sviluppare noduli radice in cui il dinitrogen atmosferici sono ridotti ad ammoniaca per uso di pianta ospite. Come tale, coltivazione delle leguminose richiede poco input di fertilizzanti azotati e contribuisce così all'agricoltura sostenibile. Leguminose producono foglie e semi ad alto contenuto proteico, che funge da ottimo foraggio e cereali. Tuttavia, specie di legume coltivato hanno generalmente strutture complesso genoma, rendendo gli studi funzionali di geni che svolgono un ruolo chiave nei processi specifici del legume ingombranti. Medicago truncatula è stato ampiamente adottato come una specie di modello per studi di legume, principalmente perché (1) ha un genoma diploide con una dimensione relativamente piccola del genoma aploide (~ 550 Mbp); (2) piante possono essere trasformate stabilmente per studi funzionali del gene; e (3) si è collegato strettamente a erba medica (M. sativa), la Regina dei foraggi e molte altre colture economicamente importante per studi traslazionali. Recentemente, la sequenza del genoma di M. truncatula cv Jemalong A17 è stato rilasciato1,2. Annotazione del genoma Mostra che ci sono più di 50.000 geni predetti o modelli di gene nel genoma. Per determinare la funzione della maggior parte dei geni in M. truncatula genoma è un compito impegnativo. Per facilitare gli studi funzionali dei geni, una vasta collezione di mutanti nella gamma di oltre 150.000 M1 linee è stata generata utilizzando mutagenesi di bombardamento (FNB) di neutroni veloci in M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutroni veloci, un mutageno di ionizzazione ad alta energia, sono stato utilizzato nella generazione di mutanti in molte specie di piante tra cui Arabidopsis5,6, riso (Oryza sativa)7, pomodoro (Solanum lycopersicum), soia (Glycine soja; G. max)8,9, orzo (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Una grande parte delle mutazioni derivato da mutagenesi FNB sono a causa di omissioni del DNA che variano in dimensioni da poche coppie di basi a mega paia di basi9,11. Molti geni associati al fenotipo sono stati correttamente identificato e caratterizzato4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. in precedenza, clonazione molecolare dei geni sottostanti da mutanti FNB invocata da un approccio basato su mappa, che richiede tempo e limita il numero di mutanti per essere caratterizzata a livello molecolare. Recentemente, diversi approcci gratuiti inclusi metodi basati sulla trascrizione, genoma affiancamento ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice per la rilevazione del DNA copia numero variazione e sequenziamento del genoma intero, è stato impiegato per facilitare il caratterizzazione di mutanti di delezione in diversi organismi, tra cui animali e piante20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

Per facilitare la caratterizzazione di mutanti FNB in M. truncatula, un intero genoma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) piattaforma è stato sviluppato e convalidato. Come riportato in sistemi animali, la piattaforma CGH array-based permette la rilevazione di variazioni del numeri di copie (CNV) a livello di intero genoma nei mutanti di M. truncatula FNB. Inoltre, le lesioni possono essere confermate mediante PCR e bordi di eliminazione possono essere identificati mediante sequenziamento. Nel complesso, la piattaforma CGH array è uno strumento efficiente ed efficace nell'identificazione delle lesioni nei mutanti di M. truncatula FNB. Qui, la procedura CGH array e la caratterizzazione di PCR delle frontiere di eliminazione in un mutante di M. truncatula FNB sono illustrati.

Il seguente protocollo vengono fornite procedure sperimentali e informazioni su reagenti, apparecchiature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di numero di copia variazioni nelle piante. Ad esempio, Medicago truncatula FN6191 mutante è stato utilizzato per identificare regioni di eliminazione e geni candidati associati con fenotipi mutanti. M. truncatula FN6191 mutante, originariamente isolato da un neutrone veloce eliminazione indotta da bombardamento mutante collezione32 (Vedi Tabella materiali), hanno esibito un fenotipo iper-nodulazione dopo l'inoculazione con il terreno batterio, meliloti Sihorhizobium Sm1021, in contrasto con piante di tipo selvaggio.

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Protocol

Nota: la figura 1 Mostra i cinque passi per il protocollo CGH array. Essi sono: 1) preparazione di materiali vegetali; 2) isolamento di campioni di DNA di alta qualità; 3) etichettatura e purificazione di campioni di DNA; 4) ibridazione, lavaggio e la scansione di matrici intero genoma; e 5) analisi dei dati CGH. M. truncatula intero genoma piastrellatura matrici contengono un totale di 971.041 sonde oligo unico targeting più di 50.000 geni o modelli di gene nel genoma (Vedi tabella materiali). Le sonde uniche sono spaziate circa ogni 150 paia di basi (bp) in regioni exonic e 261 bp in regioni introniche del genoma di M. truncatula.

1. preparazione di materiali vegetali

  1. sacrifici wild type (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) e semi mutanti di FN6191 con acido solforico concentrato per 8 min (Vedi Tabella materiali). Rimuovere e smaltire l'acido solforico per un contenitore per rifiuti liquidi.
  2. Sciacquare i semi con acqua deionizzata in autoclave tre volte.
  3. Superficie sterilizzare semi con soluzione di candeggina al 20% per 10 min.
  4. Sciacquare i semi con acqua deionizzata in autoclave tre volte.
  5. Semi di store a 4 ° C per 3 giorni. Dopo la vernalizzazione, trasferimento e far germinare i semi nel terreno per una settimana in una camera di crescita con 16 h/8 h ciclo luce/buio e 150 µE/m 2/s l'intensità della luce.
  6. Trapiantare le piantine a 1 gallone pentole e farle crescere in una serra con ciclo luce/buio di 16 h/8 h, 150 µE/m/s 2 intensità luminosa per tre o quattro settimane. Raccogliere campioni di foglia giovane dalle piante per isolamento del DNA.

2. Isolamento di alta qualità campioni di DNA

  1. prendere 1 g di tessuto fogliare giovane da una singola pianta e congelare in azoto liquido immediatamente.
  2. Macinare tessuto fogliare congelati in azoto liquido con un mortaio e pestello per polvere fine.
  3. Isolare DNA genomico con un isolamento di DNA kit (Vedi Tabella materiali).
  4. Risospendere purificato campioni di DNA in 50 µ l di sterilizzato nell'autoclave doppia deionizzata H 2 O (ddH 2 O) o 1x buffer di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).
  5. Concentrazioni nel DNA di misura con uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali).
  6. Valutare 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm rapporti di campioni di DNA.
    Nota: I campioni di DNA di alta qualità dovrebbero avere un rapporto di 260 nm/280 nm ≥ 1.8 e un rapporto di 260 nm/230 nm ≥ 2.0.
  7. Ulteriormente valutare campioni di DNA mediante l'esecuzione in 1% gel dell'agarosi.
    Nota: I campioni di DNA di alta qualità dovrebbero avere ad alto peso molecolare e non dovrebbero essere contaminati da RNA. Idealmente, la concentrazione finale di campioni di DNA dovrebbe essere ~ 150 ng / µ l.

3. Etichettatura di DNA e purificazione

  1. diluire 1 µ g di DNA genomic campioni con ddH 2 O ad un volume finale di 20 µ l in una provetta da centrifuga 500 µ l.
  2. Aggiungere 5 µ l di primer casuale (Vedi Tabella materiali) per il tubo.
  3. Vortex brevemente il tubo e metterlo in un termociclatore per incubare e denaturazione del DNA a 98 ° C per 10 min.
  4. Prendere il tubo fuori il termociclatore e metterla immediatamente in acqua con ghiaccio per raffreddare per 5 min.
  5. Preparare due etichettatura mescola come mostrato in tabella 1.
  6. Tubi di aggiungere 25 µ l di mix 1 e 2 di riferimento DNA e DNA campione di etichettatura, rispettivamente.
  7. Mescolare la miscela e il DNA d'etichettatura pipettando tre volte e girare i tubi brevemente.
  8. Mettere le provette in un termociclatore per incubare a 37 ° C per 2 h e quindi a 65 ° C per 20 min inattivare l'enzima exo-Klenow (Vedi Tabella materiali).
  9. µ L di aggiungere 430 di 1x buffer di TE in ogni provetta.
  10. Mescolare il contenuto e girare i tubi brevemente.
  11. Trasferimento della soluzione nel tubo in una colonna di purificazione con una collezione di 2 mL tubo (vedere Tabella materiali).
  12. Centrifuga della colonna di purificazione a 14.000 x g per 10 min.
  13. Scartare il pass-through soluzione.
  14. Aggiungere 480 µ l 1 x buffer di TE per ogni colonna.
  15. Centrifuga della colonna nuovamente a 14.000 x g per 10 min.
  16. Scartare la soluzione pass-through.
  17. Trasferire il campione di DNA con etichettato che rimane nella parte inferiore della colonna a una nuova centrifuga.
  18. Misurare il volume del campione di DNA con etichettato utilizzando una pipetta e portare il volume finale di 80 µ l con 1x TE.
  19. Misurare la concentrazione del campione del DNA con etichetta utilizzando uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali).
  20. Mescolare una pari quantità di campione con etichetta DNA e DNA di riferimento e portare il volume finale a 160 µ l con TE 1x.
  21. Aggiungere 256 µ l di tampone di ibridazione, 50 µ l di DNA umano Cot-1 e 50 µ l di 10 × aCGH agente bloccante: 2x (Vedi Tabella materiali) e mescolarli bene pipettando per tre volte.
  22. Girare i tubi brevemente e metterli in un termociclatore per incubare a 98 ° C per 10 min.
  23. Incubare le provette a 37 ° C per 20 min.

4. Ibridazione, lavatrice e scansione delle matrici genoma

  1. pre-riscaldare il forno di ibridazione a 67 ° C almeno 4 h prima dell'avvio di ibridazione.
  2. Disporre un vetrino di guarnizione sulla base di una camera di ibridazione.
  3. Carico 490 µ l di soluzione di ibridazione 3,23 passo sulla diapositiva guarnizione.
  4. Coprire la diapositiva di guarnizione con un chip di microarray del genoma di Medicago truncatula per formare una camera di ibridazione.
  5. Mettere sulle copertine di camera di ibridazione e serrare saldamente la camera con morsetti.
  6. Mettere la camera di ibridazione assemblato nel forno ibridazione e incubare a 67 ° C per 40-48 h.
  7. Scivolo di preparare tre piatti di lavaggio: due con 250 mL di tampone di lavaggio ho mantenuto a temperatura ambiente, ed uno con lavatrice buffer II mantenuta a 37 ° C.
  8. Scivolo di preparare due vasetti di lavaggio: uno con 70 mL acetonitrile e uno con 70 mL stabilizzazione e asciugatura soluzione; tenere entrambi in una cappa a temperatura ambiente (Vedi Tabella materiali).
  9. La camera di ibridazione di togliere dal forno e rimuovere i morsetti di camera e copertura.
  10. Spostare il chip di microarray e la guarnizione scivolare per un piatto di lavaggio diapositiva con tampone di lavaggio io e separare il chip dalla diapositiva coperchio.
  11. Mossa microarray del chip per il lavaggio di diapositiva secondo piatto con tampone di lavaggio ho e delicatamente far circolare la soluzione con un ancoretta su una piastra magnetica a temperatura ambiente per 5 min.
  12. Trasferimento microarray del chip per la terza diapositiva lava piatto con tampone di lavaggio pre-riscaldato II e lavarla delicatamente con un ancoretta su una piastra magnetica a 37 ° C per 1 min.
  13. Trasferire il chip di microarray a una diapositiva vaso con acetonitrile in una cappa di lavaggio e lavarlo per 30 s.
  14. Trasferire il chip di microarray a una diapositiva vaso con stabilizzazione di lavaggio e asciugatura soluzione e lavarlo per 30 s.
  15. Togliere lentamente il chip e asciugare per 1 min.
  16. Scan il chip di microarray utilizzando uno scanner (Vedi Tabella materiali) sotto i 2 µm ad alta risoluzione. Impostare i parametri per salvare più immagini e scansioni di intera diapositiva. Impostare i canali 1 e 2 guadagni al 100% e annullare il guadagno automatico.

5. Analisi dei dati CGH

  1. estratto la fluorescenza Cy3 e Cy5 intensità per ogni sonda sull'array utilizzando software di scansione (vedere Tabella materiali).
  2. Analisi di segmentazione di uso del software per rilevare variazioni numeri di copie (CNV) tra il campione DNA e DNA di riferimento. Utilizzare una soglia di segmento log medio 2 campione/riferimento rapporto ± 2,5 deviazioni standard per la determinazione CNVs.
  3. Controllare la distribuzione di rapporti del campione/riferimento di registro 2 attraverso l'intero genoma utilizzando un software di mappatura del segnale (Vedi Tabella materiali).

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Representative Results

La figura 2 Mostra la distribuzione dei rapporti di2 ceppo normalizzato del mutante rispetto al WT segnali attraverso l'intero genoma. L'analisi dei dati CGH ha rivelato un approssimativo annotato 22 kb omissione sul cromosoma 4 che racchiude l'intero gene SUNN 33 e parecchi altri geni in mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). La regione cancellata candidato era coperto da 73 sonde consecutive su una matrice con i rapporti di2 log medio normalizzato inferiore a -2,5 (Supplemental tabella 1). Un'ispezione delle frontiere di eliminazione ha suggerito che la presunta omissione in questo mutante è affiancato da sonde posizionate tra le coordinate 22,313,168 e 22,334,934 sul cromosoma 4 (Figura 3). Per confermare i confini di eliminazione, gli iniettori di PCR sono stati progettati per essere circa 1.500 bp oltre i confini di cancellazione previsto (FN6191-DB-f: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) e l'amplificazione di PCR è stata effettuata con questi iniettori e i seguenti parametri: 94 ° C, 5 min; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, min 1,5; per 35 cicli; 72 ° C, 10 min e poi 10 ° C a tempo indeterminato. Come previsto, un unico prodotto PCR di circa 1,5 kb con successo è stato amplificato dal mutante FN6191, ma non WT (Figura 4A). Basato su v 3.5 di rilascio del genoma M. truncatula , la dimensione dell'omissione in FN 6191 è stata stimata essere 26,67 kb (Figura 4B). I risultati CGH ha mostrato che nessun altri segmenti anormali sono presenti nel genoma mutante FN6191 (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro di analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di mutanti di M. truncatula . (A) preparazione di materiali vegetali: M. truncatula wild type (Jemalong A17) e FN6191 mutante sono state coltivate per tre o quattro settimane in serra. (B) isolamento di DNA genomic di alta qualità: un grammo di foglie giovani da singoli impianti è stato usato per isolare il DNA di genomic. Qualità del DNA è stata determinata utilizzando un spettrofotometro ed elettroforesi su gel. Etichettatura (C), del DNA e purificazione. DNAs genomic di riferimento e campioni sperimentali sono stati etichettati con cianina 3 (Cy3) e Cy5 utilizzando un'etichettatura di DNA kit e purificato utilizzando una colonna di purificazione. (D) ibridazione, lavaggio e la scansione di 1 x 1 M M. truncatula CGH array. (E) CGH analisi: Log2 rapporti di segnali di riferimento/sperimentale che sono minore o uguale a -2,5 o maggiore o uguale a 2,5 sono considerati come presunti delezioni e duplicazioni, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Matrice base di analisi di ibridazione genomic comparativa delle variazioni del numeri di copie in M. truncatula iper nodulazione mutante FN6191. Vengono mostrati registro2 rapporti di tipo mutante/selvaggio delle sonde su tutti i cromosomi di otto. Una regione di 73-sonda consecutiva sul cromosoma 4 è stata identificata come la regione cancellata nel mutante (freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3. Identificazione della regione eliminata nel mutante di FN6191 di M. truncatula . Una vista ravvicinata della regione sul cromosoma 4, in cui 73 microarray sonde esposte significativamente ridotti rapporti di tipo mutante/selvaggio di ceppo2 e sei mappati geni compreso SUNN (Medtr4g070970). Le frecce indicano la posizione e la direzione di primer per l'amplificazione di PCR dei bordi di eliminazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Conferma dell'eliminazione bordi nel mutante di M. truncatula FN6191. (A), PCR amplificazione delle frontiere di eliminazione: un prodotto di 1,5 kb è stato amplificato da mutante FN6191 utilizzando primers fiancheggianti i bordi eliminazione (lane 1; MU). Lo stesso set di primer non ha fatto amplificare tutti i prodotti da WT (M. truncatula Jemalong A17) a causa di un limite di dimensione di PCR (corsia 2; WT). M. Lane, scaletta di 1 kb. (B) sequenze della giunzione eliminazione nel mutante FN6191. Una freccia indica il bivio di eliminazione. (C) sequenziamento risultati ha mostrato che i confini di eliminazione (frecce) si trovano in corrispondenza delle coordinate 22309163 e 22335836 sul cromosoma 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Etichettatura mix 1 Per reazione x campione # (μL) Etichettatura mix 2 Per reazione x riferimento # (μL)
ddH2O 6,0 x ddH2O 6,0 x
5 x Buffer x 10.0 5 x Buffer x 10.0
10 x dNTPs 5,0 x 10 x dNTPs 5,0 x
Cianina 5 3.0 x Cianina 3 3.0 x
Exo-Klenow 1,0 x Exo-Klenow 1,0 x
Totale 25 x Totale 25 x

Tabella 1: Etichettatura mix.

Supplemental tabella 1: Sonda sequenze eliminate nel mutante di FN6191 di M. truncatula.
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Discussion

Abbiamo sviluppato una piattaforma CGH array-based per la rilevazione e la caratterizzazione di bombardamento di neutroni veloci (FNB)-indotta di mutanti di M. truncatula CV Jemalong A17. Per illustrare l'utilizzo della matrice metodo CGH nella rilevazione di mutazioni del gene, abbiamo effettuato l'analisi di aCGH del mutante FN6191, che ha esibito un fenotipo iper-nodulazione in contrasto con piante di tipo selvaggio, quando inoculati con S. meliloti Sm1021. Per le analisi di segmentazione, un segmento è ritenuto significativo se il rapporto di2 log dire delle sonde all'interno del segmento era sopra la soglia superiore o inferiore alla soglia inferiore per quel confronto matrice specificata. La soglia superiore per ogni confronto è stata determinata per essere il valore di rapporto di2 log del 95 ° percentile di tutti i punti dati. La soglia inferiore per ogni confronto è stata determinata per essere il valore di registro2 rapporto del 5 ° percentile di tutti i dati punti24.

La nostra analisi ha mostrato che modifiche numero significativo copia possono essere determinate recuperando i segmenti con un rapporto di2 log normalizzata media maggiore rispetto alla media di 2.5 SD (duplicazione) o meno rispetto alla media di 2.5 SD (eliminazione). Basato su analisi di CGH, abbiamo rilevato una regione di omissione con una dimensione stimata 22 kb sul cromosoma 4, che comprende il gene SUNN 33. Risultati di sequenziamento ha confermato che la dimensione di eliminazione era 26,67 kb basato su M. truncatula genoma rilascio v 3.5. È stato dimostrato che SUNN codifica per una chinasi del recettore ripetizione leucina-ricche di CLV1-come che controlla il numero di nodulo in M. truncatula33. I nostri risultati CGH indicano che FN6191 è un nuovo allele SUNN . Basato su questi risultati, abbiamo ragionato che il metodo CGH accoppiato con fenotipica e l'analisi genetica può essere utilizzato con successo per identificare rapidamente i geni candidati in mutanti di delezione di FNB. Sopra i passato parecchi anni, abbiamo utilizzato questa piattaforma a identificare e caratterizzare numerosi mutanti FNB per studi funzionali del gene M. truncatula34,35. Abbiamo generato un database delle variazioni numeri di copie (CNV) connesso con FNB linee mutanti36. In questo database, sequenze eliminate dalle analisi CGH di oltre 100 ha confermato simbiotico nodulazione mutanti sono stati mappati il genoma di M. truncatula . Un server di scoppio è stato impostato per facilitare la ricerca di sequenze eliminate nella raccolta mutante. Lo sviluppo e l'ulteriore espansione del database eliminazione sarebbe altamente utili per la ricerca genomica funzionale utilizzando risorse mutanti di M. truncatula FNB.

Il protocollo di aCGH ha cinque passaggi principali. Anche se tutti i passaggi sono importanti e devono essere eseguiti con cura come descritto in precedenza, le seguenti sono particolarmente critiche: (1) i campioni di DNA non dovrebbe essere degradato e non dovrebbe essere contaminato da RNA durante la fase di preparazione; Campioni di DNA di prova e di riferimento (2) dovrebbero essere altrettanto ben preparati in modo che i campioni etichettati sono della stessa qualità; (3) campioni di DNA con etichettati non devono essere esposto a un'ad alta intensità di luce e un elevato livello di ozono; e (4) è importante mantenere il tampone di lavaggio II a 37 ° C durante la fase di lavaggio.

La copertura dell'oggetto array di genoma di M. truncatula corrente è principalmente sulle regioni exonic e meno sulle regioni introniche e non è affatto in regioni intergeniche. La copertura nelle regioni quest'ultime può essere migliorata se le lesioni in queste regioni sono importanti per i fenotipi mutanti. D'altra parte, l'attuale design della sonda ha meno potere identificare piccole mutazioni e polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs). Questa limitazione può essere superata utilizzando CGH + SNP microarray design37. Nel complesso, la piattaforma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) genoma è un potente strumento per l'analisi del numero di copie e variazioni strutturali nei mutanti di M. truncatula FNB.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Finanziamento di questo lavoro è fornito in parte da una sovvenzione da NSF Plant Genome Research (IOS-1127155).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Genetica problema 129 Medicago truncatula mutanti di bombardamento di neutroni veloci ibridazione genomica comparativa basata su array copia numero variazione rilevazione di mutazione mutazione
Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta <em>Medicago truncatula</em>
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Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).

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