Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Published: November 15, 2017 doi: 10.3791/56474
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1, 1, 2, 1,2
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

Summary

نقدم بروتوكولا لدقة قوانتيتاتي البروتينات مع وسمها isobaric، وتجزئة واسعة النطاق، والأدوات المعلوماتية الحيوية وخطوات مراقبة الجودة في تركيبة مع اللوني السائل موصول إلى مطياف كتلة ذات الدقة عالية.

Abstract

قد بذلت العديد من أوجه التقدم الاستثنائي في الطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس البروتيوميات، مع التقدم التقني خاصة في اللوني السائل (ش) بالإضافة إلى الترادف الطيف الكتلي (LC-MS/MS) والقدرات المتنوعة وضع العلامات إيسوباريك. وهنا، نقدم بروتوكول تنميط البروتيوميات عميق الذي يجمع بين 10-من نوع plex جنبا إلى جنب الشامل العلامة (TMT) وسم مع منصة LC/LC-MS/MS واسعة النطاق، وتصحيح مللي ثانية بعد انتهاء التدخل الحسابية دقة قوانتيتاتي بروتيوميس كله. هذا البروتوكول يشمل الخطوات الرئيسية التالية: استخراج البروتين والهضم ووسم الحديد، ثنائي الأبعاد (2D) LC، الكتلي عالية الاستبانة، وتجهيز البيانات الحسابية. يتم تضمين لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم التباين التجريبية خطوات مراقبة الجودة. يمكن أن يكون كوانتيتاتيد 10,000 أكثر من البروتينات في عينات الثدييات ثقة مع هذا البروتوكول. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على كوانتيتاتيون التعديلات بعد متعدية مع تغييرات طفيفة. يوفر هذا الأسلوب متعدد وقوية هي أداة قوية لتحليل البروتين في مجموعة متنوعة من النماذج المعقدة، بما في ذلك زراعة الخلايا والأنسجة الحيوانية، والعينات السريرية البشرية.

Introduction

التقدم في تكنولوجيا الجيل التالي تسلسل أدت إلى المشهد جديد لدراسة النظم البيولوجية والأمراض التي تصيب البشر. وقد أتاح هذا عدد كبير من القياسات للجينوم والترنسكربيتوم والبروتين، ميتابولومي، ونظم أخرى الجزيئية لتصبح ملموسة. الطيف الكتلي (MS) أحد الأساليب الأكثر حساسية في الكيمياء التحليلية، وتطبيقه في البروتيوميات وقد توسعت بسرعة بعد تسلسل الجينوم البشري. في ميدان البروتيوميات، السنوات القليلة الماضية قد أسفرت عن أوجه التقدم التقني الرئيسية في التحليلات الكمية على أساس مرض التصلب العصبي المتعدد، بما في ذلك العلامات إيسوباريك ومضاعفة القدرة جنبا إلى جنب مع واسعة النطاق اللوني السائل، بالإضافة إلى الأجهزة السلف، مما يسمح لقياسات أكثر دقة، وأسرع مع أقل مواد العينة المطلوبة. البروتيوميات الكمية أصبحت نهجاً التيار الرئيسي للتنميط عشرات الآلاف من البروتينات والتعديلات بوستترانسلاشونال في عينات بيولوجية معقدة للغاية1،2،،من34 , 5 , 6.

متعدد أساليب وصفها isobaric مثل العلامة إيسوباريك كوانتيتاتيون النسبية والمطلقة (أي، إيتراق) والعلامة الجماعية جنبا إلى جنب (TMT) مرض التصلب العصبي المتعدد إلى حد كبير تحسنت إنتاجية عينة وازداد عدد العينات التي يمكن تحليلها في واحد تجربة1،6،،من78. جنبا إلى جنب مع الأساليب الأخرى المستندة إلى MS كوانتيتيشن، مثل كوانتيتيشن خالية من التسمية والنظائر المستقرة وسم مع الأحماض الأمينية في الخلية والثقافة (أيسيلك)، إمكانيات هذه التقنيات في البروتيوميات هو ميدان كبير9 ،،من1011. على سبيل المثال، يسمح الأسلوب الحديد 10 البروتين عينات تحليلها معا في التجربة 1 باستخدام الكواشف 10-من نوع plex. هذه العلامات الحديد هيكلياً متطابقة الجماهيري العام نفسه، ولكن النظائر الثقيلة توزع الأثران على ذرات الكربون أو النيتروجين، أسفر عن أيون مراسل فريدة من نوعها خلال تجزئة MS/MS لكل علامة، وبالتالي تمكين كوانتيتاتيون النسبية بين العينات العشر. تطبيق هذه الاستراتيجية الحديد بشكل روتيني لدراسة الممرات البيولوجية وتطور المرض والعمليات الخلوية12،،من1314.

تحسينات تقنية كبيرة عززت النظم – MS/MS اللوني السائل (ش)، سواء من حيث فصل LC والمعلمات مرض التصلب العصبي المتعدد، إلى أقصى حد ممكن تحديد البروتين دون التضحية بدقة كوانتيتيشن. فصل البعد الأول من الببتيدات بأسلوب فصل مع تعامد عالية للبعد الثاني ضروري في هذا النوع من الأسلوب البروتيوميات بندقية لتحقيق أقصى قدر من النتائج20. درجة الحموضة عالية عكس المرحلة اللوني السائل (ربلك) يوفر أداء أفضل مما يفعل تبادل الأيونات الموجبة القوى التقليدية اللوني20. عندما يتم الجمع بين ربلك درجة الحموضة العالية ذات بعد ثاني من ربلك درجة الحموضة المنخفضة، التحليل الديناميكي وتغطية البروتين يتم تحسين، أسفر عن القدرة على تحديد الجزء الأكبر البروتينات المعرب عنها عند إجراء تحليلات البروتين كل15 ،16،،من1718. التطورات التقنية الأخرى تشمل C18 جزيئات صغيرة (1.9 ميكرومتر) وتمديد فترة طويلة العمود (~ 1 م)19. وعلاوة على ذلك، تتضمن التحسينات الملحوظة الأخرى الإصدارات الجديدة من المطيافات الشامل مع معدلات المسح السريع وتحسين حساسية والقرار20وأنابيب المعلوماتية المتطورة لمرض التصلب العصبي المتعدد البيانات التعدين21.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة تتضمن المنهجيات الأخيرة مع بعض التعديلات لتحسين حساسية والإنتاجية، مع التركيز على آليات لمراقبة الجودة في جميع أنحاء هذه التجربة. ويتضمن البروتوكول استخراج البروتين والهضم والحديد 10-من نوع plex وسم والأس الهيدروجيني القاعدي وتجزئة ربلك حامضي، الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد عالية الاستبانة وتجهيز البيانات MS (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، علينا أن ننفذ عدة خطوات مراقبة الجودة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم التباين التجريبية. هذا البروتوكول مفصلاً يهدف إلى مساعدة الباحثين جديدة إلى الميدان بشكل روتيني تحديد ودقة كوانتيتاتي آلاف بروتينات من أو الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: يرجى استشارة جميع صحائف بيانات السلامة ذات الصلة (أي مسدس) قبل الاستخدام. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند تنفيذ هذا البروتوكول.

ملاحظة: استخدام مجموعة كاشف تسمية isobaric 10-من نوع plex الحديد في هذا البروتوكول كوانتيتيشن البروتين من 10 عينات.

1. إعداد الخلايا/الأنسجة

ملاحظة: من الأهمية بمكان لجمع العينات في الحد الأدنى من الوقت في درجات حرارة منخفضة للحفاظ على البروتينات في حالتها البيولوجية الأصلية-

  1. الخلايا (مثلاً، خلايا HEK 293) يغسل ملتصقة على صفيحة 10 سم مرتين مع 10 مل جليد الباردة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). كشط وجمع الخلايا (~ 2 × 10 6 خلايا) في 1 مل من برنامج تلفزيوني. نقل إلى 1.5 مل الأنابيب وإزالة برنامج تلفزيوني بعد الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في "مخزن جيم" ° 4 خلايا الكريات في-80 درجة مئوية حتى تفسخ.
    ملاحظة: غالباً ما يتم تنفيذ تجربة رائدة لدراسة البروتين الغلة. ويمكن استخراج حوالي 1 ملغ بروتينات من 10 × 10 6 خلايا الثدييات أو من لوحة 15 سم مع التقاء 80%-
    2. بدلاً من ذلك،
  2. الخلايا ملتصقة لوحة عن طريق إضافة المخزن المؤقت لتحلل مباشرة إلى اللوحة بعد الغسيل. جمع ليساتيس إلى أنابيب 1.5 مل واستخدام الوصف البروتوكول في الخطوة 2، 5-
  3. جمع تعليق الخلايا في أنابيب 15 مل، يغسل مرتين مع 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني، نقل إلى أنابيب 1.5 مل، والطرد المركزي في ز 600 x لإزالة برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من خطوات الغسيل تماما للحفاظ على تركيز تحلل المكونات المخزن المؤقت المطلوب. تخزين خلايا الكريات في-80 درجة مئوية حتى تفسخ.
    4. جمع
  4. ووزن الأنسجة بسرعة. إبقاء الأنسجة في النتروجين السائل فورا بعد تشريح ومخزن في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: إنتاج بروتين الأنسجة هو حوالي 5% إلى 10% وزن الأنسجة
  5. استخدام أنسجة متجانسة الأحجام والمناطق التشريحية للعينات العشر للحد من عدم تجانس العينة. إزالة تلوث الدم بدهن العينات مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد لتجنب الدم وفرة عالية البروتينات التي تؤثر على البروتين كوانتيتيشن وتحليل البيانات المصب.

2. استخراج البروتين ومراقبة الجودة الغربية النشاف، والهضم في الحل والملحي الببتيد

ملاحظة: التعامل مع كل من 10 عينات بنفس الطريقة أثناء أي خطوة قبل تجميع عينات المسمى الحديد ضروري للحد من تباين-

المخزن المؤقت لتحلل
  1. جعل (50 مم حبيس [pH 8.5]، اليوريا 8 أمتار، وديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5%) يوم التجربة.
    ملاحظة: تمسخ البروتين الجزئية أثناء تحلل العينة يؤثر على كفاءة هضم البروتين.
  2. تحلل إضافة المخزن المؤقت حيث تكون نسبة المخزن المؤقت لحجم العينة 10:1 و ~ 20% من الحجم النهائي للزجاج الخرز (0.5 مم) إلى حبيبات الخلايا أو الأنسجة (مثلاً، حجم 10:1 نسبة بين المخزن المؤقت وعينات) لتحقيق تركيز بروتين نهائي من 5 أن 10 ملغ/مل. تبقى جميع العينات 10 تركيز نفسه بالنظر في العدد الخلايا المستخدمة أو الأنسجة وزن كل عينة.
  3. المحافظة على تركيز اليوريا في 8 م عن طريق إضافة اليوريا الصلبة للعينة. تذكر أن تنظر في حجم الخلية بيليه أو الأنسجة عند حساب كمية اليوريا الصلبة إضافة إلى عينة لتحقيق تركيز 8 م.
    ملاحظة: يمكن إدخال تعديل المواد الكيميائية الاصطناعية (أي، كارباميليشن البروتين) اليوريا جديدة الأمم المتحدة العازلة وتؤثر تأثيراً سلبيا على عدد الببتيدات المحددة. اليوريا ويحتل حجم كبير (100 مغ يوريا تحتل ميليلتر ~ 73 في الحل)-
  4. إبقاء الحطام غير قابلة للذوبان في للسماح بهضم البروتينات غير قابلة للذوبان 23-
  5. العينات في خلاط في 4 درجات مئوية في سرعة 8 30 s، والباقي 5 s، وكرر 5 مرات أو حتى يتم تجانس العينات. يمكن أيضا أن يكون تفكيك العينات من فورتيكسينج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة (RT) مع 30 s التبريد الفترة على الجليد لدورات ~ 10. ضبط ظروف تحلل حسب الضرورة، اعتماداً على نوع العينة.
  6. ميكس البئر ليستي دون استخدام الطرد المركزي ومختبرين الصغيرة 2 (~ 15 ميليلتر كل). استخدم 1 قاسمة لقياس تركيز البروتين وقاسمه 1 لإجراء التحقق من صحة عنصر التحكم الإيجابي بإجراء تحليل لطخة غربية. تبقى قاسمة الكبيرة المتبقية في تحليل البروتيوميات.
  7. قياس تركيز البروتين مقايسة بروتين قياسي كوانتيتيشن أو الملطخة بأخذ صوديوم قصيرة دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام (10 ٪) 22 مع ألبومين المصل البقري (BSA) كمعيار. استخدام معيار جيش صرب البوسنة بدرجة عالية من الدقة تركيز معلوم. لتحقيق أعلى مستوى من الدقة، إجراء تحليل الأحماض الأمينية مستوى جيش صرب البوسنة-
    ملاحظة: قد تكون المعايير الدقيقة الأخرى المتاحة. يمكن أيضا تقدير تركيزات البروتين بأرقام الخلية أو النسيج الأوزان. على الرغم من أن من المستحسن 1 ملغ بروتين (100 ميكروغرام في عينة)، التحليل يمكن أداؤها مع أقل قدر من 100 ميكروغرام من البروتين (10 ميكروغرام في عينة)-
  8. إضافة 100% الاسيتو الانيتريل (ACN) لتحقيق تركيز حوزتي تزاول وليس 10% نسبة 1: 100 (w/w) لهضم البروتينات تحت الغاية يشوه شروط في الرايت ح 2 1 الإنزيم إلى الركيزة نهائية. إضافة ديثيوثريتول (DTT) بتركيز نهائي من 1 ملم تخفيض سندات ثنائي كبريتيد في البروتينات واحتضانها حاء 1 الهضم "ليسك القيام" بتركيز نهائي من اليوريا 7.2 م.
  9. تضعف من عينات لليوريا 2 متر مع 50 مم هيبيس (pH 8.5) وكذلك هضم العينات مع التربسين في RT ح 3، أو بين ليلة وضحاها في التربسين لنسبة البروتين من 01:50 (w/w). استخدام حوالي 2 ميكروغرام من التربسين 100 ميكروغرام من البروتين وتركيز التربسين من حوالي 10 نانوغرام/ميليلتر.
    ملاحظة: هي العوامل التي يمكن أن تؤدي إلى عدم كفاءة التربسين هضم القضايا الأس الهيدروجيني، التربسين غير نشط، أو استخدام نسبة غير ملائمة للانزيم إلى الركازة.
  10. إضافة القيمة تسفر عن 1 مم، وكذلك الحد من الببتيدات ح 2 في الرايت
  11. إضافة إيودواسيتاميدي (IAA) لتحقيق 10 ملم. تبني على RT لمدة 30 دقيقة في الظلام الكيلات الببتيدات المحتوية على Cys.
  12. إخماد الأكاديمية الممتص بإضافة القيمة تحقيق 30 ملم، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
  13. التحقق من كفاءة الهضم التربسين بفحص قاسمة صغيرة لكل عينة. تحلية باستخدام تلميح ماصة 10 ميليلتر مع الفصل اللوني لوسائل الإعلام جزءا لا يتجزأ من الفضاء الميت، وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s. تحليل كل عينة من LC-MS/السيدة LC-MS/MS المعلمات هي نفسها كما في الخطوة 5، باستثناء أن التدرج هو 10 دقيقة 23-
  14. إجراء بحث قاعدة بيانات للبيانات الخام مرض التصلب العصبي المتعدد (انظر المزيد من التفاصيل في الخطوة 6) باستخدام 4 الانقسامات غاب كمعلمة بحث.
    ملاحظة: إذا غاب العدد من الانشقاقات هو > 10%، فإنه قد يشير إلى التربسين غير مكتملة الهضم. وهذا سيؤثر سلبيا على النتائج النهائية. هذا خطوة حاسمة مراقبة الجودة (QC).
  15. هضم العينات مرة أخرى إذا كان الانقسام غاب > 10% بإضافة ميليلتر 10 إضافية من التربسين للعينات-
  16. أسيديفي العينات بإضافة حامض trifluoroacetic (تفا) لتحقيق تركيز 1%. قياس درجة الحموضة باستخدام شريط الأس الهيدروجيني. تحقق من أن الرقم الهيدروجيني هو الرهانوين 2 و 3. إضافة المزيد تفا قطره الحكمة (1 ميليلتر) حسب الحاجة حتى يتم تحقيق درجة الحموضة الصحيح.
  17. الطرد المركزي في 20,000 x ز في الرايت 10 دقيقة وجمع المادة طافية.
    18. أغسل
  18. 0.5 إلى 60 ميكروغرام القدرات تدور الأعمدة التي تحتوي على راتنج عكس المرحلة C18 مع 0.25 مل ميثانول في حالة استخدام 100 ميكروغرام عينات. أغسل 0.03 إلى 30 ميكروغرام القدرات تدور الأعمدة مع 0.25 مل 60% تفا ACN/0.1% في حالة استخدام 10 ميكروغرام عينات. الطرد المركزي أعمدة الدوران في 500 غ س ل 30 س.
  19. حجته الأعمدة مع 0.5 مل من 0.1% تفا وإزالة من سينتريفوجينج في غ 500 x 30 س.
  20. تحميل العينات في الأعمدة وربط عينات للأعمدة باستخدام الطرد المركزي في 100 غ س لمدة 3 دقائق أو حتى اجتاز جميع العينة من خلال العمود.
  21. إضافة 0.5 مل من 0.1% تفا لأعمدة وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز ل 30 س.
  22. ميليلتر 125 إضافة 60% تفا ACN/0.1% لكل عمود والوت سينتريفوجينج في ز 100 x للحد الأدنى 3 ضمان جميع الحل مرت العمود.
  23. الجاف الوينتس في مركز فراغ. تضمن العينات رفات جافة تماما ولا السائل في الأنابيب. مخزن في-80 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل.

3. وسم الحديد من الببتيدات

ملاحظة: من الأهمية بمكان لضمان أن جميع العينات تماما المسماة بالحديد والمواد الكيميائية. يمكن أن تؤثر على العديد من العوامل (مثل كمية الحديد والكواشف المستخدمة، وقيمة الأس الهيدروجيني ودقة كوانتيتيشن البروتين) الحديد وصفها بكفاءة، والتي ستغير سلبا على جميع النتائج النهائية-

ديسالتيد
  1. إعادة كل عينة الببتيد في 50 ميليلتر من 50 مم حبيس المخزن المؤقت (pH 8.5). فحص درجة الحموضة والتأكد من أنها بين 7 و 8-
    ملاحظة: قد تكون العينة الحمضية إذا لم يجف تماما بعد الخطوة desalting، التي سوف تؤثر على كفاءة التوسيم.
  2. تبقى ~ 1 ميكروغرام لكل عينة غير مسمى للاحقة الحديد التوسيم كفاءة اختبار، كما هو موضح في الخطوة 3، 3-
  3. حل الكواشف الحديد في ACN اللامائى، وتسمية عينات الببتيد باتباع الشركة المصنعة ' تعليمات s. احتضان الكواشف على RT حاء 1
  4. إجراء اختبار كفاءة التوسيم "الحديد مراقبة الجودة" قبل الملحي ~ 1 ميكروغرام لكل عينة المسمى الحديد وغير مسمى باستخدام 10 ميليلتر ماصة نصائح مع وسائل الإعلام جزءا لا يتجزأ من عملية فصل لوني وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s. تحليل عينات الحديد المسماة وغير المسماة ب LC-MS/السيدة
    ملاحظة: معلمات LC-MS/MS هي نفسها كما هو الحال في المادة 5، باستثناء أن التدرج هو الحد الأدنى 10
  5. دراسة البيانات الخام التأكد من أنه لم يتم الكشف عن الببتيدات غير المسماة في عينات المسمى، ضمان كفاءة الوسم الكامل ( الشكل 2). القيام بذلك على 6 إلى 10 الببتيدات منفصلة للتحقق من كفاءة التوسيم.
  6. آرو الرد بإضافة 4 ميليلتر من هيدروكسيلاميني 5% واحتضانها ل 15 دقيقة
    7. مزيج
  7. حجم صغير وعلى قدم المساواة (2 ميليلتر) قاسمة كل عينة المسمى الحديد. تحلية باستخدام 10 ميليلتر ماصة نصائح مع وسائل الإعلام جزءا لا يتجزأ من الفصل اللوني. تحليل العينات من LC-MS/MS، كما هو موضح في الخطوة 3.4. استخدام برنامج حاسوبي القفز (خوارزمية بحث قاعدة بيانات المصدر المفتوح تحويل ملفات raw MS جنبا إلى جنب على قائمة من الببتيدات والبروتينات) لتحديد نسبة التركز النسبي لكل 10 عينات بكثافات العلامة الحديد جميع حددت الببتيدات.
    ملاحظة: هذا الاختبار نسبة مواده QC مفيد لتحديد نسبة الصحيحة لخلط متساوية قبل تجميع النهائي، كما يمكن أن تحدث الأخطاء بيبيتينج من شأنها أن تغير التركيزات والخطوة كوانتيتيشن البروتين قد لا تكون دائماً دقيقة. كما أنها أفضل طريقة للتأكد من وجود كمية كل من 10 عينات المستخدمة للمزيج النهائي كل نسبة متساوية، كما هو موضح في الخطوة 3، 5-
  8. كرر عدة مرات حسب الضرورة لتحقيق نسبة 1:1 عبر كافة العينات 10-
  9. ميكس على قدم المساواة 10 عينات وفقا لنتائج اختبار نسبة مواده. استخدام النموذج مع أدنى تركيز كخط أساس لضبط أحجام العينات الأخرى 9.
  10. إزالة المنتجات الثانوية لرد فعل التبريد من عينة المسمى الحديد المجمعة بواسطة الملحي.
  11. الغسيل 1 مل الصلبة-مرحلة استخراج خراطيش تحتوي على 50 ملغ مسيل كل عمود مع 1 مل/0.25 مل ميثانول إذا استخدام 100 ميكروغرام عينات. أغسل قدرة 0.5-60 ميكروغرام C18 تدور الأعمدة مع 1 مل/0.25 مل 60% تفا ACN/0.1% في حالة استخدام 10 ميكروغرام عينات. الطرد المركزي الأعمدة في 500 غ س ل 30 س.
  12. حجته الأعمدة مع 0.5 مل من 0.1% تفا وإزالة من سينتريفوجينج في غ 500 x 30 س.
  13. تحميل العينات في الأعمدة وربط بالطرد المركزي في ز 100 x لمدة 3 دقائق أو حتى كل من العينة مرت العمود.
  14. إضافة 0.5 مل من 0.1% تفا لأعمدة وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز ل 30 س.
  15. ميليلتر 125 إضافة 60% تفا ACN/0.1% لكل عمود والوت سينتريفوجينج في 100 غرام x للحد الأدنى 3 ضمان كل من الحل مرت العمود.
  16. الجاف الوينتس في مركز فراغ. تضمن العينات رفات جافة تماما ولا السائل في الأنابيب. مخزن في-80 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل.

4. درجة الحموضة عالية الاستبانة، أساسية واسعة النطاق بريفراكتيونيشن LC

  1. مجموعة الأعمدة C18 متصلة 2 التي تحتوي على جزيئات الهجين الموصولة الإيثيلين (4.6 مم × 25 سم، يبلغ مجموعها 50 سم؛ 3.5 حجم الجسيمات ميكرومتر) واستخدام ميكروليتير تدفق عالية أداء لمضخة LC تجزئة.
    ملاحظة: استخدام الأعمدة 2 زيادة تحميل الببتيد وليس بالضرورة تحسين اللوني. للعينات التي تحتوي على ≤ 200 ميكروغرام من الببتيدات، العمود 1 يكفي.
  2. يغسل الحلقة 100 ميليلتر مع إضافات لاحقة من 300 ميليلتر من كل من الميثانول، والمياه، والمخزن المؤقت A (فورمات الأمونيوم 10 ملم، ودرجة الحموضة 8.0).
  3. غسل الأعمدة مع 100 ميليلتر من الايزوبروبانول مختلطة على قدم المساواة، والميثانول، وتزاول، والمياه، وحجته في العمود في المخزن المؤقت 95% عن 2 حاء
  4. جعل العينة ديسالتيد الببتيد المسمى الحديد المجمعة في 65 ميليلتر من المخزن المؤقت التحقق من أ أن الأس الهيدروجيني عينة هو ~ 8.0. إذا كان لا يزال الحمضية، استخدام هيدروكسيد الأمونيوم لضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.0.
    5. نموذج
  5. فراكتيوناتي باستخدام التدرج التالي مع المخزن المؤقت ب (المخزن المؤقت الإضافة إلى 90% تزاول): 15% إلى 20% لمدة 15 دقيقة، 20% إلى 35% لمدة 100 دقيقة، ونسبة 35 في المائة إلى 50 في المائة للحد الأدنى 30 مجموعة جامع الكسر جمع الكسور كل 2 دقيقة بما في ذلك وقت التحميل. تعيين معدل التدفق إلى 0.4 مل/دقيقة. انظر مرجع 29 و الرقم 1 chromatogram ممثل.
  6. جمع ما مجموعة 80 الكسور والجاف للكسور 40 (كل جزء من غيرها) مع مركز فراغ إلى جفاف كامل-
  7. استخدام العينات المجففة 40 لتحليل LC-MS/MS.
  8. تحليل جميع الكسور 80 من LC-MS/MS لتحقيق تغطية البروتين العميق جداً.

5. إعداد LC-MS/MS ومعلمات

ملاحظة: كوانتيتاتيون القائم "في الحديد"، أيونات الببتيد إيسوباريك وتظهر ككتلة 1 في مسح MS1. ومع ذلك، أنها هي quantitated وفقا لكثافة الأيونات مراسل (10 مراسل فريدة من نوعها أيونات) في مسح MS/MS بعد فقد تمت تجزئة أيون الببتيد مع الانفصال التصادم أعلى من الطاقة (HCD). وقد قمعت النسب أيون الحديد مراسل من شطف المشارك من أيونات الحديد المسمى 24. تضييق إطار العزلة أيون 25، وتنقية الغاز-المرحلة 26، أسلوب MS3 مولتينوتش 27، أو تجزئة واسعة النطاق مع LC متعددة الأبعاد والتدرجات طويلة (4-8 ح) 28 هي النهج البديلة-

  1. 75 حزمة القطر الداخلي ميكرومتر (ID) فارغة الأعمدة مع 1.9 ميكرومتر راتنج C18 إلى 30 بطول 40 سم (حجم السرير ميليلتر ~1.3)-
  2. تسخين الأعمدة عند 65 درجة مئوية مع سخان حافظة فراشة للحد من باكبريسوري ومنع أكثر من الضغط على فائقة العالية الضغط النظام اللوني السائل (أوبلك). لفائف العمود 2 إلى 3 مرات في سخان الفراشة لضمان أن يتم تسخين طول السرير العمود كله. الشريط العمود إلى داخل المدفأة مع الحرص على عدم الشريط على مدى استشعار درجة الحرارة داخل المدفأة.
    ملاحظة: سخان حافظة الفراشة محمولة ومسجلة على قطعة مصنوعة خصيصا شبكي المرفقة إلى مرحلة XYZ الصك.
  3. إعداد المخزن المؤقت من (3% ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 0.2 ٪ حمض الفورميك) والمخزن المؤقت ب (المخزن المؤقت الإضافة إلى 67% تزاول) وغسل الأعمدة تماما مع 95% المخزن المؤقت ب ثم، تاما حجته الأعمدة الموجودة في المخزن المؤقت 95% A (وحدات تخزين العمود 3 على الأقل). استخدم معدل تدفق ~0.25 ميليلتر/دقيقة وباكبريسوري من 280 إلى 320 شريط
  4. دراسة نوعية LC-MS/MS النظام عن طريق تشغيل 100 نانوغرام من الفئران الدماغ الببتيدات (أو معيار من اختيارنا) مرتين قبل تحليل عينات الحديد المسمى. تحقق من المعلمات التالية كثيرا لضمان جمع بيانات عالية الجودة: استقصاء كثافة إشارة مرض التصلب العصبي المتعدد (بين e8 e9 لكثافة الذروة الأساسية)، ونوعية MS/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف (تمثيل جيد لأيونات ص وب)، ذروة العرض (s 12-22)، والوقت الإجمالي للاحتفاظ بها، LC نظام الضغط (ارتفاع الضغط > أشرطة 50 يشير إلى عمود القذرة أو تلميح باعث انسداد)، وتقلب التشغيل لتشغيل (ينبغي أن تكون متطابقة قمم < 30 s بين تشغيلات).
    ملاحظة: لحل مراسل قرب isobaric الأيونات من الكواشف الحديد 10-من نوع plex (6.32 mDa الفرق)، يجب تعيين القرار MS/MS إلى مالا يقل عن 30 ألفا في 400 m/z. عادة ما تستخدم HCD TMT10-من نوع plex مراسل أيون التجزؤ، كما أنها لا تخضع لقاعدة الثلث الذي ينطبق على الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) في فخ أيون الصكوك-
  5. نظيفة ومعايرة أداة MS بانتظام واستخدام المخازن المؤقتة LC جديدة لتحسين أداء النظام.
  6. إعادة تشكيل الببتيدات المجفف من فصل الأس الهيدروجيني القاعدي في 5% تفا.
  7. تحميل ~0.2 ميكروغرام في العمود بينما تتدفق من المخزن المؤقت 5% ألف
  8. الوتي مع 15% إلى 45% من المخزن المؤقت ب في 150 دقيقة. وكنقطة انطلاق، استخدام التدرج التالي: الوقت 0، المخزن المؤقت ب 5%؛ الساعة 2، المخزن المؤقت ب 15%؛ 135، المخزن المؤقت ب 45% من الوقت، والوقت 145، المخزن المؤقت ب 70 في المائة؛ ووقت 150، المخزن المؤقت ب 95%. ضبط التدرج قليلاً للكسور ربلك pH الأساسية المبكرة والمتأخرة بعد استعراض قاعدة الذروة تشروماتوجرامس.
    9. وتعمل
  9. مطياف الشامل في الوضع تعتمد على البيانات مع مسح مسح في فخ أيون محلل الشامل (400-1600 m/z؛ و 60,000 القرار؛ 1 × 10 6 الكسب التلقائي السيطرة (AGC) الهدف؛ ووقت أيون الحد الأقصى 50 مللي ثانية؛ ووضع centroid). تنفيذ 20 MS/MS مسح عالية الدقة (القرار 60,000، هدف AGC 1 × 10 5، ~ 100 مللي ثانية أيون أقصى الوقت 35 HCD تطبيع الاصطدام، 0.4 m/z العزلة نافذة، والطاقة 20 s دينامية الاستبعاد).
    ملاحظة: الانفصال نقل الإلكترون (أتد) لا ينصح الكاشفات TMT10-من نوع plex لأن أتد الانقسام ومواقع مختلفة من مشاريع التنمية البشرية، أدى إلى تداخل أيون مراسل. وباﻹضافة إلى ذلك، أتد ليست فعالة كما يرجع إلى مشاريع التنمية البشرية تولد الببتيدات تريبتيك عادة + 2 مشحونة، واتد أكثر كفاءة في أعلى مقابل الدول.

6. تحليل البيانات MS

ملاحظة: يصف لنا تحليل البيانات مع البرنامج القفز. ومع ذلك، يمكن تنفيذ تحليل البيانات مع البرامج الأخرى المتاحة تجارياً أو الحرة-

  1. معالجة الملفات الخام من مطياف كتلة مع الهجين على أساس العلامة البحث محرك القفز 21، الذي يجمع بين بحث القائم على نمط قاعدة بيانات تسلسل على أساس العلامة حيثياته تحسين حساسية وخصوصية.
  2. تحويل البيانات الخام إلى مزكسمل تنسيق والبحث الأطياف MS2 ضد قاعدة بشرية أونيبروت المستهدفة-شرك (أو قاعدة بيانات أخرى باﻷنواع الملائمة) لحساب معدل اكتشاف كاذبة (FDR).
  3. إجراء عمليات البحث باستخدام تسامح شامل 10 أجزاء من المليون لأيونات السلائف ويفتت. تعيين معلمات البحث الأخرى لتقييد تريبتيك تماما مع الانشقاقات غاب الحد الأقصى 2، 3 مواقع تعديل الحد الأقصى للواحد الببتيد وإحالة ، ب، وأيونات y نقاط الببتيدات. تعيين التعديلات ثابتة للحديد العلامات على بقايا Lys وتيرميني N (+229.162 Da) وكارباميدوميثيليشن بقايا Cys (+57.021 دا). مجموعة التعديلات الديناميكية تشمل أكسدة Met (+15.994 دا)، وهو قطعة أثرية ببتيد مشتركة الناجمة عن التعامل مع عينة-
    4. معايير
  4. تصفية البيانات بما يلي: 7 من الأحماض الأمينية ببتيد الدنيا طول ودقة m/z (مثلاً، 5 جزء في المليون)، ومطابقة عشرات (نقاط ي وديلتاكن). مجموعة الببتيدات وفقا لطول الببتيد، تريبتيسيتي، واتهام الدولة.
  5. استخدام مستوى إضافي من التصفية عن طريق مطابقة الدرجات لتقليل البروتين فرانكلين روزفلت إلى أقل من 1%. البروتينات المحددة حسب عدد طيفية واحدة تتطلب أعلى درجة مطابقة.
  6. للكتلة الببتيدات تتقاسمها عدة أفراد من عائلة البروتين، البروتين يقابل الأعضاء في المجموعة 1-
    ملاحظة: وفقا لمبدأ التقتير، يمثل المجموعة البروتين مع أعلى عدد من الببتيدات المعينة وغيرها من البروتينات التي تقابلها الببتيدات فريدة 1.
  7. كوانتيتاتي البروتينات بجمع التهم أيون مراسل عبر كافة التطابقات الطيف الببتيد المتطابقة (النظام) باستخدام برنامج صلب برمجيات القفز.
  8. لكل قبلت إدارة المشتريات والتوريدات، استخراج وتصحيح كثافات أيون مراسل الحديد وفقا لتوزيع النظائر الكواشف التوسيم والتحيز التحميل، التي يتم حسابها من البيانات كوانتيتاتيون إدارة المشتريات والتوريدات العالمية. تصفية النظام بكثافة منخفضة والضوضاء عالية المستوى مع عتبات المعرفة من قبل المستخدم أثناء كوانتيتاتيون.
  9. حساب إشارة نسبي بين كل أيون مراسل ومتوسط جميع مراسل 10 أيونات. مجموع إشارات النظام النسبي للبروتينات التي تم تحديدها. تحويل هذه الإشارات النسبية إلى إشارات المطلق بضرب مراسل متوسط كثافة أيون النظام أعلى 3 في المقابل البروتينات.
  10. استخدام نهج حسابية بعد مرض التصلب العصبي المتعدد لتصحيح التدخل. افتراض أن كثافة أيون 1 y تتناسب مع كثافة أيون مراسل، حساب العلاقة الخطية من مسح نظيفة ومستوى التدخل وتستمد كثافتها y1ion الملوثة في مسح صاخبة 23-
    ملاحظة: للحديد المسمى الببتيدات تريبتيك، بقايا كالحديد والبحث والتطوير أنواع من أيونات ص 1 2 (دا 376.27574 ودا 175.11895، على التوالي) في فحص MS2. إلا إذا تم الكشف عن أيون 1 ص 1 ويتسق مع الببتيد التي تم تحديدها، يعتبر MS2 نظيفة المسح الضوئي ( الشكل 3A). إذا تم الكشف عن كلا y1ions، MS2 يعتبر فحص صاخبة.
  11. تصدير قيم البروتين كوانتيتيشن إلى برنامج جدول بيانات لمزيد من التحليل. استخدام مقارنات عشوائية أو تحليل تباين لتحديد البروتينات التي يتم التعبير عنها الأثران.

7. التحقق من صحة البيانات MS

ملاحظة: لتقييم نوعية البيانات MS، ينبغي أن يقوم على الأقل 1 أسلوب التحقق من الصحة قبل المضي قدما في إجراء تجارب بيولوجية مضيعة للوقت.

  1. يدوياً دراسة الأطياف MS/MS من البروتينات ذات الاهتمام للتحقق من صحة تسلسل الببتيد والحديد مراسل أيون كوانتيتاتيون.
  2. استخدام يعرف بروتين كوانتيتاتيون البيانات للتأكد من النتائج MS.
    3. التحقق من التغييرات البروتين مع النهج القائم على جسم (مثلاً، ويستي
  3. تحليل وصمة عار و immunohistochemistry rn).
  4. كيميائيا توليف الببتيدات الفائدة واستخدامها المعايير كما الداخلية للتأكد من تحديد الببتيدات الأصلية-
    ملاحظة: أنماط MS/MS، والاحتفاظ بالوقت أثناء LC-MS/MS يجب أن تكون متطابقة.
  5. التحقق من التغييرات البروتين مع نهج مستهدف MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كنا خليط تم وصفه مسبقاً عبر الأنواع ببتيد بصورة منهجية تحليل تأثير ضغط نسبة 3 خطوات البروتوكول الرئيسية، بما في ذلك تجزئة بريمس وإعدادات مرض التصلب العصبي المتعدد، وتصحيح بوستمس23. تم تجزئة بريمس تقييم والأمثل باستخدام مزيج من الأس الهيدروجيني القاعدي ربلك والحموضة الحمضية ربلك. واعتبرت لتحليل بوستمس، سوى من إبلاغها الببتيدات. استخدمنا هذا نموذج التدخل لبحث عدد من المعلمات في LC/LC-MS/MS، بما في ذلك نافذة العزلة MS2 والقرار LC عبر الإنترنت، تحميل مقدار درجة الحموضة الحمضية على الإنترنت ربلك وحلها ربلك درجة الحموضة العالية دون اتصال (انظر الشكل 3 في إشارة 29).

لتغير هذا القرار من خلال قانون العمل دون اتصال، فصل الببتيدات المسمى إيسوباريك إلى 320 الكسور، وثم ضم الكسور المحدد معا لضبط قوة فصل. تم اختبار القرار LC دون اتصال باستخدام عدد من الكسر جمع مجموعات فرعية (1، 5، 10، 20، 40، 80، و 320)، بينما رصد مستويات التدخل. وجدنا أن مستويات التدخل انخفض تدريجيا من 16.4% إلى 2.8 في المائة، مما يشير إلى أن وجود واسعة النطاق خلال فصل LC دون اتصال إلى حد ما التخفيف من حدة مشكلة المشترك التينج الببتيدات لكن لم يكن قادراً على إزالة تماما التدخل.

المقبل، ونحن تقييم تأثير الإطار العزلة MS2 على التدخل. نحن مصممة تجريبيا أن التدخل كان تقريبا متناسبة مع حجم إطار العزلة، باﻻتفاق مع الدراسات السابقة29،30. على سبيل المثال، أدى إلى اختلاف النوبات من حجم الإطار (1.6 إلى 0.4 دا) ~ الفرق النوبات من مستوى الاستدلال (14.4 في المائة إلى 3.7 في المائة). ونحن أيضا تحديد مقدار التحميل الأمثل في العمود لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد ويستخدم هذه المعلومات لزيادة ينفي التدخل. وخفضنا التدخل من 9.4 في المائة إلى 3.3 في المائة عن طريق تحميل كمية مناسبة من عينة. تحميل عينة أكثر من اللازم قد تؤدي إلى ذروة توسيع31 وذلك رفع مستوى التدخل، أدى إلى انخفاض البروتين كوانتيتيشن دقة. وأخيراً، نحن الأمثل القرار ربلك على الإنترنت بتغيير أطوال متدرجة (1 و 2 و 4 ح) باستخدام عمود طويل (~ 45 سم). لقد وجدنا أن تدرج 4-ح تقريبا القضاء التدخل (وصولاً إلى 0.4 في المائة) ولكن أيضا إضافة وقت صك. كشفت المعلمات الأمثل نافذة عزلة ضيقة (0.4 دا)، ~ 100 نانوغرام عينة حملت على العمود، وتجزئة البكلاريوس (~ 40 × 2 ح، أيام 3.3). ونحن كما أظهرت أنه باستخدام استراتيجية الحاسوب تصحيح بوستمس نحن تحسين الدقة الكمية عند تحديد نسب البروتين (الشكل 3B).

نتائجنا تشير إلى أن الاستخدام الأمثل المعلمات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد وتصحيح بوستمس يمكن توفير ملف تعريف دقيق البروتين البشري والقضاء فعلياً على التدخل الذي غالباً ما ينتج بتقنيات وضع العلامات إيسوباريك للبروتين كوانتيتاتيون.

Figure 1
رقم 1: نظام لتحليل كل البروتين التنميط بالحديد-LC/LC-MS/السيدة تم تفكيك عشر عينات بيولوجية وهضمها والمسمى بواسطة العلامات 10 الحديد المختلفة، مجمعة على قدم المساواة، وهورمونات في الكسور 80 بالاس الهيدروجيني الأساسية دون اتصال عكسي-المرحلة اللوني السائل (ش). كذلك كل جزء أخرى مفصولة بواسطة ربلك الحمضية وتحليلها على الإنترنت مع مطياف كتلة ذات الدقة عالية. معالجة ملفات raw MS/MS وتفتيش ضد قاعدة أونيبروت لتحديد الببتيد والبروتين. كانت quantitated البروتينات وفقا لكثافة نسبية من علامات الحديد. وأخيراً، قدمت البروتينات التي تم تحديدها وكوانتيتاتيد لتحليل البيانات التكاملية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الحديد وسم امتحان الكفاءة- كل المسمى الحديد والمقابلة غير مسمى عينات تم تحليلها بواسطة LC-MS/MS كل على حدة لبحث الحديد وسم الكفاءة. لوسم الحديد الكامل، الذروة (A) الببتيد غير مسمى كان تماما غائبة في العينة المسمى، (ب) بينما الببتيد المسمى الحديد كانت موجودة فقط في عينة المسمى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: النهج الحسابية لإزالة التدخل بعد جمع البيانات MS. (أ) جميع MS2 مسح قسمت إلى نظيفة (اللوحة اليمنى) وصاخبة بالأشعة (اللوحة اليمنى). مسح صاخبة يحمل كلا أيونات1 ص ك وار (1 من ببتيد مستهدفة وغيرها من تلويث الببتيدات). (ب) الببتيدات الإشريكيّة القولونية فردياً المسمى مع 3 الكواشف الحديد المختلفة وتجميعها في 1:3: نسب 10. وأضيفت تقريبا إلى برنامج الببتيدات الفئران أكثر كخلفية. كثافتها النسبية summed من الببتيدات كولاي في 3 مجموعات كشفت أن التصحيح على أساس أيون1 y أكثر دقة للقائم على الحديد كوانتيتاتيون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكننا وصف بروتوكول الفائق كوانتيتيشن البروتينات مع استراتيجية التوسيم isobaric 10-من نوع plex، التي نفذت بنجاح في عدة منشورات12،،من1314،32 . في هذا البروتوكول، يمكننا تحليل عينات البروتين البيولوجي مختلفة تصل إلى 10 في التجربة 1. بشكل روتيني يمكن أن نحدد وكوانتيتاتي البروتينات 10,000 أكثر بثقة عالية. على الرغم من أن العلامات isobaric تقنية فعالة البروتينات قوانتيتاتي، فإنه يحد من نسبة ضغط يمكن أن يؤدي إلى عدم دقة الكمية. لدينا بروتوكول باستخدام استراتيجيات مختلفة، مثل إعدادات MS/MS في تركيبة مع ذ1 المستندة إلى أيون بوستمس التصحيح، والاستفادة المثلى من LC/LC فعال يزيل معظم آثار التدخل وذلك تحسن إلى حد كبير دقة كوانتيتيشن البروتين.

للبروتين كوانتيتيشن، جناح القفز من وظائف البرامج في عدد من الطرق. قمنا بقياس شوائب النظائر المشعة لكل دفعة من الكواشف التي تم شراؤها، الذي يختلف قليلاً عن القيم المبلغ عنها في الشهادات المقدمة من المورد. شوائب النظائر قياس يستخدم لتصحيح كثافة الأيونات مراسل في برنامج الانتقال. هو كوانتيتاتيد بروتين عادة بكثير من النظام مع مختلف الكثافات المطلقة التي تتأثر بعوامل متعددة، مثل كفاءة التأين. نظراً لتأثير العوامل غير معروف، تكشف الأطياف الشامل فقط وفرة نسبية من أيونات مراسل في مقايسة الحديد. وفرة نسبية من أيونات مراسل تحسب بقسمة كثافة كل أيون المراسل بمتوسط كثافة جميع الصحفيين 10. لتوفير أفضل ممثلة "إشارة المطلقة" من البروتين، قمنا بحساب متوسط الشدة النسبية للنظام 3 مع كثافة مطلقة أعلى من البروتين ومتوسط كثافة مطلقة أقوى لتقدير المطلق إشارة البروتين. وحددنا هذه الخطوات كإعادة قياس. التصحيح1 y قابلة للتطبيق عالمياً لأي فحوصات الحديد؛ ومع ذلك، في بعض الحالات نحن يمكن أن لا تصحيح الببتيدات مع MS/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف التي تحتوي على أيون1 y. ومع ذلك، وجدنا أن ~ 90% أطياف الأيونات y1 من يسين وارجينين. للتعويض عن التداخل الناجم عن المشترك التينج الببتيدات التي لديها نفس المخلفات ج-الطرفية الببتيد التي تم تحديدها، تضاعف مستوى التدخل المقدرة أساسا ويستخدم لتصحيح. هذا الافتراض يستند إلى الأدلة التجريبية التي قمنا بجمعها عن تجارب الحديد العديدة، التي لاحظنا نفس مستوى كثافة ل ص1 في الببتيدات المحتوية على ك والبحث والتطوير.

يمكن الحد من التدخل بطرق كثيرة خلاف ما وصفناها في هذا البروتوكول، مثل نهج مولتينوتش MS3. كل من هذه الأساليب صالحة ومزاياها الفردية. وفي نهاية المطاف، يعتمد على عدد من العوامل، بما في ذلك المنهجية المستخدمة لكن لا تقتصر على المبلغ عينة، توفر أداة (أينوع الصك والوقت اللازم لتحليل العينات)، النتائج المرجوة (أي، وعدد من البروتينات المحددة)، وكوانتيتيشن الدقة المطلوبة.

لضمان تحقيق النتائج الأكثر دقة، من المهم أن تصغي خطوات مراقبة الجودة في جميع أنحاء البروتوكول. وهذه تشمل استخدام معايير دقيقة لنموذج كوانتيتيشن (مثلاً، جيش صرب البوسنة الذي خضع لتحليل الأحماض الأمينية)، اختبار كفاءة التوسيم لكاشف الحديد، وتحديد كفاءة الهضم التربسين، أداء اختبار نسبة مواده لضمان خلط متساوية لجميع العينات العشر، واستخدام برمجيات لتصحيح أي تحيز للتحميل. في الحالات التي من المتوقع أن يحمل تغييرات التعبير بين العينات الفردية يعرف بروتين أو بروتينات متعددة، من المهم إجراء تحليل لطخة غربية بعد تحلل الخلية الأولى للتأكد من أن هذه التغييرات موجودة ويمكن الكشف عنها. وهذا ما يضمن أن العينات تمثل بيولوجيا لفحصها ويوفر الوقت والمال والجهد قبل تنفيذ البروتوكول الحديد بأكملها. إذا كان نموذج معين من المتوقع أن لا تعبر عن بعض protein(s)، من المهم أيضا استخدام تحليل لطخة غربية للتأكد من عدم وجودها بعد تحلل قبل المتابعة مع البروتوكول. يستخدم اختبار نسبة مواده معظم البروتينات التي يتوقع أن لا تتغير عبر 10 عينات بيولوجية. ونحن أيضا إزالة البروتينات تلويث المعروفة، مثل كراتين، حيث أنهم لن يؤثر سلبا على لدينا تصحيح. لدينا أسلوب كوانتيتيشن تصحيح أية أخطاء قد يكون حدث من أخطاء بيبيتينج، إلخ. عندما يكون ذلك ممكناً، على وجه التحديد استخدمنا ماصة أحجام تزيد على 5 ميليلتر لتقليل الأخطاء. أجرينا عدة جولات من هذا الاختبار مواده لضمان الحصول على مزيج دقيق من 1:1. من المهم ملاحظة أن نحن عدم إجراء هذا النوع من اختبار نسبة مواده عند استخدام عينات إيمونوبريسيبيتيشن للبروتوكول، كما كنا نتوقع نسبة مئوية كبيرة من البروتينات لتغيير. وفي مثل هذه الحالات، سوف تحرف الاختبار مواده النتائج. وهذا صحيح أيضا أي تجربة فيها على الأقل 1 من 10 عينات من المتوقع أن تختلف اختلافاً كبيرا في التعبير البروتين (متجه فارغة، وتثبيط بروتوزوم، إلخ) وفي مثل هذه الحالات، يوصي بشدة باستخدام replicates لتسهيل كوانتيتاتيون الإحصاءات. ونحن نوصي عادة أداء 3 يعيد لهذه الأنواع من العينات. وفي نهاية المطاف، يستند عدد replicates التغير المتوقع لكل عينة.

مع بعض التحسين، يمكن استخدام هذا البروتوكول قوية كخط أنابيب البروتين عامة للتحقيق في البروتينات والبروتين مسارات وتطور المرض والوظائف البيولوجية الأخرى. وينص البروتوكول على المقدمة هنا تقنية قوية للحصول على تغطية البروتين العميق والتخفيف من قمع نسبة أثناء القياس الكمي. مع تعديلات طفيفة، يمكن أن يكون هذا البروتوكول يسهل تكييفه مع كوانتيتاتي التعديلات بوستترانسلاشونال البروتين، مثل الفسفرة وأوبيكويتينيشن وأسيتيليشن،من3334. هذه الأنواع من المشاريع البروتيوميات شاملة يمكن أن تكون متكاملة مع علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، وربما جميع نهجاً بيولوجيا نظم لفهم النظم البيولوجية وتسهيل الاكتشافات رواية الآليات الجزيئية، المؤشرات الحيوية، والأهداف العلاجية في الأمراض13،28،35،36،،من3738.

لقد أظهرنا أسلوب لدقة كوانتيتاتينج البروتينات 10,000 أكثر من ليساتيس كامل الخلية أو النسيج. ونحن نتوقع هذا الأسلوب لتكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع في العديد من النظم البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون سائر أعضاء المختبر ومرفق لمناقشة مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا منح ح ني R01GM114260، R01AG047928، R01AG053987، والساك. تم إجراء تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد في الأطفال سانت جود "مستشفى البروتيوميات منشأة الأبحاث"، معتمدة بشكل جزئي بمنحه "دعم مركز السرطان المعاهد الوطنية للصحة" P30CA021765. يشكر المؤلفون نيشا باديرس للمساعدة في تحرير المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، 129 قضية، المعلوماتية الحيوية، والتدخل، ووسم isobaric، اللوني LC-MS/MS، والسائل، الكتلي، البروتيوميات، الحديد
التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., … More

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter