Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Published: November 15, 2017 doi: 10.3791/56474
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1, 1, 2, 1,2
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

Summary

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Abstract

Vele uitzonderlijke vooruitgang geboekt in de Spectrometrie van de massa (MS)-op basis van proteomics, met bijzondere technische vooruitgang in vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan massaspectrometrie tandem (LC-MS/MS) en isobaar labeling multiplexing capaciteit. Hier introduceren we een diep-proteomics profiling protocol dat 10-plex tandem massa tag (TMT combineert) labelen met een uitgebreide LC/LC-MS/MS platform, en na MS computationele interferentie correctie op het hele proteomes nauwkeurig te kwantificeren. Dit protocol omvat de volgende hoofdstappen: eiwit extractie en spijsvertering, labelen van de TMT, 2-dimensionale (2D) LC, hoge-resolutie massa spectrometrie en computationele gegevensverwerking. Kwaliteitscontrole stappen zijn opgenomen voor het oplossen van problemen en de evaluatie van de experimentele variatie. Meer dan 10.000 eiwitten in zoogdieren monsters kunnen vol vertrouwen met dit protocol worden quantitated. Dit protocol kan ook worden toegepast op de kwantificatie van post-vertalende wijzigingen met kleine wijzigingen. Deze methode multiplexed, robuuste biedt een krachtige tool voor proteoom analyse in een verscheidenheid van complexe monsters, met inbegrip van celkweek, dierlijke weefsels en menselijke klinische specimens.

Introduction

Vooruitgang in de technologie van de volgende generatie sequencing hebben geleid tot een nieuw landschap voor de studie van biologische systemen en ziekten bij de mens. Dit heeft een groot aantal metingen van het genoom, transcriptome Proteoom, metabolome en andere moleculaire systemen tot tastbare toegestaan. De Spectrometrie van de massa (MS) is een van de meest gevoelige methoden in de analytische chemie, en de toepassing ervan in proteomics is snel uitgebreid na de sequencing van het menselijk genoom. Op het gebied van proteomics, hebben de afgelopen jaren grote vooruitgang in op basis van MS kwantitatieve analyses, met inbegrip van isobaar labeling en multiplexing vermogen gecombineerd met uitgebreide vloeistofchromatografie, naast instrumentatie opgeleverd vooruitgang, waardoor voor snellere, meer nauwkeurige metingen met minder monstermateriaal nodig. Kwantitatieve proteomics geworden een reguliere aanpak voor profilering van tienduizenden van eiwitten en posttranslationele modificaties in zeer complexe biologische monsters1,,2,,3,4 , 5 , 6.

Multiplexed isobaar labeling methoden zoals isobaar tag voor relatieve en absolute kwantificatie (dat wil zeggen, iTRAQ) en tandem massa tag (TMT) MS hebben sterk verbeterd monsters worden verwerkt en steeg het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd in één 1,6,7,8te experimenteren. Samen met andere kwantificatie op basis van MS-methoden, zoals label-vrije kwantificatie en stabiele isotoop labelen met aminozuren in de cultuur van de cel (dat wil zeggen, SILAC), het potentieel van deze technieken in de proteomics is veld aanzienlijke9 ,10,11. De TMT-methode kunnen bijvoorbeeld 10 EiwitSteekproeven te samen in 1 experiment worden geanalyseerd met behulp van 10-plex reagentia. Deze structureel identiek TMT-tags hebben dezelfde totale massa, maar zware isotopen zijn differentieel verdeeld over kooldioxide of stikstof-atomen, resulterend in een unieke verslaggever ion tijdens MS/MS versnippering van elke tag, waardoor de relatieve kwantificatie tussen de 10 monsters. De strategie van de TMT is routinematig toegepast om te bestuderen van de biologische afbraak, progressie van de ziekte, en cellulaire processen12,13,14.

Aanzienlijke technische verbeteringen hebben vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS systemen, zowel in termen van LC scheidingen en MS parameters, eiwit identificatie maximaliseren zonder in te boeten kwantificatie nauwkeurigheid verbeterd. Eerste-dimensie scheiding voor peptides door een scheiding techniek met hoge orthogonaliteit aan de tweede dimensie is van cruciaal belang is in dit soort geweer proteomics methode om maximale resultaten20. Hoge-pH reversed-phase vloeistofchromatografie (RPLC) levert betere prestaties dan conventionele sterke catie-uitwisseling chromatografie20. Als hoge-pH RPLC wordt gecombineerd met een tweede dimensie van lage-pH RPLC, zowel analytische dynamisch bereik en eiwit dekking zijn verbeterd, resulterend in de mogelijkheid om het grootste deel van de geuite eiwitten te identificeren bij het uitvoeren van geheel-Proteoom analyse15 ,16,17,18. Andere technische ontwikkelingen omvatten kleine C18 deeltjes (1.9 µm) en uitgebreid lang kolom (~ 1 m)19. Bovendien omvatten andere opmerkelijke verbeteringen nieuwe versies van massaspectrometers met snelle scan tarieven, verbeterde gevoeligheid en resolutie20en verfijnde bioinformatics pijpleidingen voor MS gegevens mijnbouw21.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin de meest recente methodologieën met wijzigingen ter verbetering van zowel de gevoeligheid en de doorvoer, met de nadruk op kwaliteit controlemechanismen gedurende het gehele experiment. Het protocol bevat eiwit extractie en spijsvertering, TMT 10-plex labeling fundamentele pH en zure pH RPLC fractionering, high-resolution MS detectie en verwerking van de gegevens van de MS (Figuur 1). Bovendien voeren we verschillende kwaliteitscontrole stappen voor het oplossen van problemen en de evaluatie van de experimentele variatie. Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen nieuwe naar het veld routinematig identificeren en duizenden eiwitten uit een lysate nauwkeurig te kwantificeren of weefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: Raadpleeg alle relevante gegevens omtrent de veiligheid (d.w.z., MSDS) vóór gebruik. Gebruik bij het uitvoeren van dit protocol op alle passende veiligheidspraktijken.

Opmerking: een TMT 10-plex isobaar label reagens set wordt gebruikt in dit protocol voor het proteoom kwantificatie van 10 monsters.

1. voorbereiding van de cellen/weefsels

Opmerking: het is van cruciaal belang voor het verzamelen van monsters in minimale tijd bij lage temperatuur om te houden van de eiwitten in hun oorspronkelijke biologische toestand.

  1. Wash Adherente cellen (bijvoorbeeld, HEK 293 cellen) op een bord van 10 cm tweemaal met 10 mL van ijs koud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Schrapen en verzamelen van cellen (~ 2 x 10 6 cellen) in 1 mL PBS. Transfer naar 1,5 mL buizen en PBS verwijderen na centrifugeren bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. winkel cel pellets bij-80 ° C tot lysis.
    Opmerking: Een proefproject wordt vaak uitgevoerd om te onderzoeken eiwit opbrengst. Ongeveer 1 mg van eiwitten kunnen worden geëxtraheerd uit 10 x 10 6 zoogdiercellen of uit een plaat van 15 cm met 80% samenvloeiing.
  2. Lyse anderzijds Adherente cellen op hun plaat door lysis-buffermengsel rechtstreeks naar de plaat toe te voegen na het wassen. Verzamelen van lysates in 1,5 mL buizen en de beschrijving van het protocol gebruiken in stap 2.5.
  3. Collect schorsing cellen in 15 mL buizen, twee keer wassen met 10 mL ijs koud PBS, overboeken naar 1,5 mL buizen, en centrifugeer bij 600 x g te verwijderen van PBS. PBS verwijderen door de stappen wassen volledig om de gewenste concentratie van lysis buffer ingrediënten. Bewaren van cel pellets bij-80 ° C tot lysis.
  4. Verzamelen en wegen weefsels snel. Houden van weefsels in vloeibare stikstof onmiddellijk na dissectie en winkel op -80 ° C.
    Opmerking: Het rendement van de proteïne van de weefsels is ongeveer 5% tot 10% van het weefsel gewicht
  5. gebruik van homogene weefsel maten en anatomische gebieden voor de 10 monsters om voorbeeld heterogeniteit. Verwijderen van bloed besmetting door spoelen monsters tweemaal met 1 mL van ijs koud PBS om te voorkomen dat zeer overvloedig bloedeiwitten beïnvloeden eiwit kwantificatie en downstream gegevensanalyse.

2. Eiwit extractie, kwaliteitscontrole westelijke bevlekken In-oplossing spijsvertering en Peptide ontzouten

Opmerking: dezelfde manier verwerken van elk van de 10 voorbeelden tijdens elke stap voordat de bundeling van de TMT-geëtiketteerden monsters is essentieel om te verminderen variatie.

  1. Make lysis-buffermengsel (50 mM HEPES [pH 8,5], 8 M ureum en 0,5% natrium deoxycholate) de dag van het experiment.
    Opmerking: Gedeeltelijke eiwit denaturatie tijdens lysis van de steekproef is van invloed op eiwit spijsvertering efficiëntie.
  2. Toevoegen lysis buffer zodat de verhouding tussen de buffer monstervolume 10:1 en ~ 20% van het uiteindelijke volume van glaskralen (0,5 mm diameter) cel pellets of weefsels (bijvoorbeeld, 10: 1 volumeverhouding tussen buffer en monsters) te bereiken van een definitieve eiwitconcentratie van 5 tot 10 mg/mL. Houden van alle 10 monsters dezelfde concentratie door te overwegen het aantal cellen die worden gebruikt of weefsel gewicht van elk monster.
  3. Behouden ureum concentratie op 8 meter door solide ureum aan het monster toe te voegen. Vergeet niet om het volume van het pellet van de cel of het weefsel te overwegen bij de berekening van het bedrag van solide ureum toe te voegen aan het monster, tot het bereiken van het concentratie van 8 M.
    Opmerking: Un-verse ureum buffer kan introduceren kunstmatige chemische modificatie (d.w.z., eiwit carbamylation) en negatieve invloed hebben op het aantal peptiden geïdentificeerd. Ureum neemt een aanzienlijke omvang (100 mg ureum neemt ~ 73 µL in oplossing).
  4. Houden het onoplosbare puin in de lysate toe vertering van de onoplosbare eiwitten 23.
  5. Lyse de monsters in een blender bij 4 ° C op snelheid 8 voor 30 s, rest voor 5 s, en herhaal 5 keer of totdat de monsters worden gehomogeniseerd. De monsters kunnen ook worden lysed door vortexing voor 30 s bij kamertemperatuur (RT) met een 30 s koeling periode op ijs voor ~ 10 cycli. Aanpassen van lysis van de voorwaarden als nodig, afhankelijk van het type monster.
  6. Meng de lysate put zonder centrifugeren en 2 kleine porties (elke ~ 15 µL) maken. Gebruik 1 aliquoot deel aan maatregel eiwitconcentratie en 1 aliquot positieve controle om validatie te voeren door het uitvoeren van westelijke vlekkenanalyse. Houden van de resterende grote monster voor de analyse van proteomics.
  7. Maatregel eiwitconcentratie door een standaard eiwit kwantificatie assay of door een Coomassie gebeitste korte natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (10%) 22 met bovien serumalbumine (BSA) als een standaard. Gebruik een BSA-standaard met een hoge graad van nauwkeurigheid van bekende concentratie. Om te bereiken van het hoogste niveau van nauwkeurigheid, aminozuur analyses van de BSA standaard uit te voeren.
    Opmerking: Andere nauwkeurige normen mogelijk. De eiwit-concentraties kunnen ook worden geschat door cel nummers of weefsel gewichten. Hoewel 1 mg van eiwit (100 µg/voorbeeld) wordt aanbevolen, de analyse uitgevoerd kan worden met zo weinig als 100 µg eiwit (10 µg/sample).
  8. Acetonitril (ACN) 100% toevoegen om een eindconcentratie van 10% ACN en LysC protease bij een enzym-naar-substraat verhouding van 1:100 (w/w) te verteren proteïnen onder zeer denaturerende omstandigheden op RT voor 2 h- 1. Dithiothreitol (DTT) toevoegen om een eindconcentratie van 1 mM tot verminderen disulfide bindingen in eiwitten en incubeer gedurende 1 h. uitvoeren LysC spijsvertering op een eindconcentratie van 7,2 M ureum.
  9. Verdund monsters 2 M ureum met 50 mM HEPES (pH 8,5) en verder digest monsters met een trypsine op RT voor 3U of overnachting in een trypsine eiwit/ratio van 1:50 (w/w). Gebruik ongeveer 2 µg trypsine voor 100 µg voor eiwit en een concentratie van de Trypsine van ongeveer 10 ng/µL.
    Opmerking: Factoren die tot inefficiënte trypsine spijsvertering leiden kunnen zijn pH kwesties, inactieve trypsine, of het gebruik van een ongeschikte ratio van enzym op substraat.
  10. DTT toevoegen aan opbrengst van 1 mM en peptiden gedurende 2 uur op RT. verder te verminderen
  11. Toevoegen iodoacetamide (IAA) tot 10 mM. Incubeer bij RT gedurende 30 min. in het donker te Cys-bevattende peptiden alkylate.
  12. Quench spoorverontreiniging IAA door toevoeging van DTT voor het bereiken van 30 mM en incubeer gedurende 30 min op RT.
    13. De efficiëntie van de spijsvertering van de trypsine controleren
  13. door het onderzoek van een kleine hoeveelheid van elk monster. Desalt met behulp van een 10 µL pipette uiteinde met chromatografie media ingebed in de dode ruimte, volgens de fabrikant ' s-protocol. Analyseren van elk monster door LC-MS/MS. LC-MS/MS parameters zijn hetzelfde als in stap 5, met de uitzondering dat de helling 10 min 23 is.
  14. Doorzoeken database voor MS ruwe gegevens (Zie nader in stap 6) met behulp van 4 gemiste breuklijnen als zoekparameter.
    Opmerking: Als het aantal breuklijnen gemiste is > 10%, kan dit erop duiden onvolledig trypsine spijsvertering. Dit zal downstream resultaten negatief beïnvloeden. Dit is een stap in de kritische kwaliteitscontrole (QC).
  15. Monsters weer verteren als het gemiste splijten > 10% van het aan de monsters toe te voegen een extra 10 µL van trypsine.
  16. Breng de monsters door trifluorazijnzuur (TFA) tot 1% concentratie toe te voegen. Wordt de pH met behulp van een pH-strip. Verifiëren dat de pH is weddenWeen 2 en 3. Voeg meer TFA druppel verstandig (1 µL) zo nodig totdat de juiste pH is bereikt.
  17. Centrifugeer bij 20.000 x g bij RT gedurende 10 min en verzamel het supernatant.
  18. Wassen 0,5 tot 60 µg capaciteit spin kolommen met C18 omgekeerde-fase hars met 0,25 mL methanol als met behulp van 100 µg monsters. Wassen van 0,03 tot en met 30 µg capaciteit spin kolommen met 0,25 mL van 60% ACN/0.1% TFA als 10 µg monsters gebruikt. Centrifugeer spin kolommen bij 500 x g gedurende 30 s.
  19. Equilibreer kolommen met 0,5 mL of 0,1% TFA verwijderen door centrifugatie bij 500 x g gedurende 30 s.
  20. Laden monsters op kolommen en monsters aan kolommen koppelen door centrifugeren op 100 x-g gedurende 3 minuten of totdat alle het monster door de kolom voorbij.
  21. Voeg 0,5 mL 0,1% TFA naar kolommen en centrifugeer bij 500 x g gedurende 30 s.
  22. Toevoegen 125 µL van 60% ACN/0.1% TFA aan elke kolom en elueer door centrifugatie bij 100 x g gedurende 3 min. Zorg ervoor alle de oplossing de kolom heeft gepasseerd.
  23. Droog de eluents in een vacuüm concentrator. Zorgen dat de monsters zijn volledig droog en niet vloeibaar blijft in de buizen. Winkel bij-80 ° C tot verdere analyse.

3. TMT Labeling van peptiden

Opmerking: het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle monsters zijn volledig gelabeld door TMT reagentia. Verschillende factoren (bijvoorbeeld, hoeveelheid van de gebruikte reagentia van de TMT, pH-waarde en nauwkeurigheid van eiwit kwantificatie) kunnen invloed hebben op de TMT labeling van efficiëntie, die zullen alle downstream resultaten negatief veranderen.

  1. Reconstrueren elke ontzout peptide monster in 50 µL van 50 mM HEPES-buffer (pH 8,5). Controleer de pH en ervoor te zorgen dat er tussen 7 en 8.
    Opmerking: Monster kan zuur als niet volledig na de demineralisatie stap, die zal van invloed zijn op de labeling doeltreffendheid gedroogd worden.
  2. Houden ~ 1 µg van elk labelloze monster voor een latere TMT labeling efficiëntie test, zoals beschreven in stap 3.3.
  3. Los TMT reagentia in watervrij ACN en label peptide monsters door de fabrikant te volgen ' s instructies. Incubeer reagentia op RT voor 1 h.
  4. Een QC TMT labeling efficiëntie test uitvoeren door demineralisatie ~ 1 µg van elk TMT- en label - labelloze monster met behulp van 10 µL Pipetteer tips met ingesloten chromatografie media volgens de fabrikant ' s-protocol. Analyseren van de TMT-label en labelloze monsters door LC-MS/MS.
    Opmerking: LC-MS/MS parameters zijn hetzelfde als in sectie 5, met de uitzondering dat de helling 10 min. is
  5. Onderzocht de ruwe gegevens om ervoor te zorgen dat labelloze peptiden niet worden gedetecteerd in de gelabelde monsters, ervoor te zorgen volledige etikettering efficiëntie ( Figuur 2). Hiervoor voor 6 tot en met 10 afzonderlijke peptides om te controleren of de labeling efficiëntie.
  6. De reactie door de toevoeging van 4 µL van 5% hydroxylamine Quench en incubeer gedurende 15 min.
  7. Meng een kleine en gelijke volume (2 µL) hoeveelheid van elk monster TMT-label. Desalt door het gebruik van 10 µL Pipetteer tips met ingesloten chromatografie media. Analyseer de monsters door LC-MS/MS, zoals beschreven in stap 3.4. Gebruik van het softwareprogramma JUMP (een open-source database zoekalgoritme dat tandem MS raw-bestanden naar een lijst van peptides en proteïnen converteert) geïdentificeerd om te bepalen van de relatieve concentratie-verhouding van alle 10 monsters door de TMT label intensiteiten van alle peptiden.
    Opmerking: Deze QC premix verhouding test is nuttig om te bepalen van de juiste verhouding voor gelijke mengen voordat de definitieve bundeling, pipetting fouten kunnen optreden dat concentraties zal veranderen en de eiwit kwantificatie stap kan niet altijd nauwkeurig. Het is ook de beste manier om ervoor te zorgen dat het bedrag van elk van de 10 monsters gebruikt voor de uiteindelijke mix zijn allemaal op een gelijke verhouding, zoals beschreven in stap 3.5.
  8. Herhaal zo vaak als nodig is om een 1:1 verhouding over alle 10 monsters.
  9. Mix even de 10 monsters volgens de resultaten van de test van de verhouding premix. Gebruik van het monster met de laagste concentratie als de basislijn aan te passen van de volumes van de andere 9 monsters.
  10. Verwijderen van de bijproducten van de blussen reactie van de gebundelde TMT-geëtiketteerden monster door ontzouten.
  11. Wash 1 mL solid-phase extraction cartridges met 50 mg sorptiemiddel per kolom met 1 mL/0,25 mL methanol als met behulp van 100 µg monsters. Wassen van 0,5 - tot 60-µg capaciteit C18 spin kolommen met 1 mL/0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA als 10 µg monsters gebruikt. Centrifugeer kolommen bij 500 x g gedurende 30 s.
  12. Equilibreer kolommen met 0,5 mL of 0,1% TFA verwijderen door centrifugatie bij 500 x g gedurende 30 s.
  13. Monsters op kolommen laden en binden door centrifugeren op 100 x g gedurende 3 minuten of totdat alle van het monster door de kolom voorbij.
  14. Voeg 0,5 mL 0,1% TFA naar kolommen en centrifugeer bij 500 x g gedurende 30 s.
  15. Toevoegen 125 µL van 60% ACN/0.1% TFA aan elke kolom en elueer door centrifugatie bij 100 x g gedurende 3 min. Zorg ervoor alle van de oplossing de kolom heeft gepasseerd.
  16. Droog de eluents in een vacuüm concentrator. Zorgen dat de monsters zijn volledig droog en niet vloeibaar blijft in de buizen. Winkel bij-80 ° C tot verdere analyse.

4. Uitgebreid met een hoge resolutie, Basic pH LC Prefractionation

  1. Set up 2 aangesloten C18 kolommen met overbrugde ethyleen hybride deeltjes (4.6 mm x 25 cm, 50 cm totaal; 3,5 µm deeltjesgrootte) en gebruik een microliter stroom hoogwaardige LC pomp voor fractionering.
    Opmerking: Het gebruik van 2 kolommen peptide belasting verhoogt en verbetert niet noodzakelijkerwijs chromatografie. Voor monsters met ≤ 200 µg peptiden, 1 kolom volstaat.
  2. Wassen van de 100-µL lus met latere toevoegingen van 300 µL van methanol, water en buffer A (10 mM ammonium formate, pH 8,0).
  3. Was de kolommen met 100 µL van even gemengde isopropanol, methanol, ACN, en water en equilibreer van de kolom in 95% buffer A voor 2 h.
  4. Solubilize het monster van de gepaarde TMT-geëtiketteerden peptide ontzout in 65 µL van buffer A. verifiëren dat de pH van de steekproef ~ 8.0 is. Indien nog steeds zuur, gebruiken ammoniumhydroxide pH tot 8,0.
  5. Fractionate monster met behulp van de volgende helling met buffer B (buffer een plus 90% ACN): 15% tot 20% gedurende 15 minuten, 20% tot 35% voor 100 min en 35% tot 50% voor 30 min. ingesteld de collector van de breuk te verzamelen van breuken elke 2 min inclusief laadtijd. Stel het debiet op 0.4 mL/min. Zie referentie 29 en Figuur 1 voor een representatieve chromatogram.
  6. Verzamelen van een totaal van 80 breuken en droog 40 breuken (elke andere fractie) met een vacuüm concentrator naar volledige droogheid.
  7. De 40 gedroogde monsters voor LC-MS/MS analyse gebruik.
  8. Analyseren van alle 80 breuken door LC-MS/MS tot dekking van de ultra-diep Proteoom.

5. LC-MS/MS voorbereiding en Parameters

Opmerking: In TMT gebaseerde kwantificatie, peptide ionen zijn isobaar en worden weergegeven als 1 massa in een MS1 scan. Echter, ze zijn quantitated volgens de intensiteit van de verslaggever ionen (10 unieke verslaggever-ionen) in de scan MS/MS na de peptide ion heeft zijn gefragmenteerd met hogere energie-botsing dissociatie (HCD). De TMT verslaggever ion verhoudingen kunnen van co elutie van TMT-geëtiketteerden ionen 24 onderdrukt worden. Vernauwing van de ion isolatie venster 25, gasfase zuivering 26, de MultiNotch MS3 methode 27 of uitgebreide fractionering met multidimensionale LC en lange hellingen (4-8 h) 28 zijn alternatieve benaderingen.

  1. Pack 75 µm binnendiameter (ID) lege kolommen met 1.9 µm C18 hars tot en met 30 tot 40 cm lengte (~1.3 µL bed volume).
  2. De kolommen bij 65 ° C verwarmen met een vlinder portefeuille kachel te verminderen tegendruk en over de druk van de ultra-hoge-druk te voorkomen vloeistofchromatografie (UPLC) systeem. Spoel de kolom 2 tot 3 keer in de vlinder kachel om ervoor te zorgen dat het hele bed kolomlengte wordt verwarmd. De kolom aan de binnenzijde van de kachel dat evenwel niet tot tape over de temperatuursensor binnen de kachel tape.
    Opmerking: De vlinder portefeuille kachel is gemonteerd en geplakt op een op maat gemaakte stuk van plexiglas aan de XYZ-fase van het instrument gehecht.
  3. Voorbereiden een (3% dimethyl sulfoxide en 0,2% mierenzuur) buffer en buffer B (buffer een plus 67% ACN) en de kolommen met 95% buffer B. grondig wassen Vervolgens volledig equilibreer kolommen in 95% buffer A (ten minste 3 kolom volumes). Gebruik een debiet van ~0.25 µL/min en tegendruk van 280 tot 320 bar.
  4. Onderzoekt de kwaliteit van de LC-MS/MS-systeem door het uitvoeren van 100 ng van rat hersenen peptiden (of norm van onze keuze) twee keer bedenken alvorens de TMT-geëtiketteerden monsters analyseren. Controleer de volgende parameters regelmatig om te zorgen voor kwalitatief hoogwaardige gegevensverzameling: enquête MS signaal intensiteit (tussen e8 en e9 hoofdpiek intensiteit), kwaliteit van MS/MS-spectra (een goede vertegenwoordiging van y en b ionen), piekbreedte (12-22-s), algemene retentietijd, LC systeem onder druk (druk opkomst > 50 bars geeft een vuile kolom of verstopte emitter tip), en de run-to-run variabiliteit (identieke pieken moeten < 30 s tussen runs).
    Opmerking: U kunt oplossen door de ionen in de buurt van-isobaar verslaggever van de 10-plex TMT reagentia (6.32 mDa verschil), de MS/MS-resolutie moet worden ingesteld op ten minste 30.000 op 400 m/z. HCD wordt doorgaans gebruikt voor TMT10-plex verslaggever ion fragmentatie, want het is niet onderworpen aan de eenderde regel die voor botsing veroorzaakte dissociatie (CID) in ion trap instrumenten geldt.
  5. Schone frisse LC buffers te gebruiken om de systeemprestaties te verbeteren en regelmatig kalibreren van het instrument van de MS.
  6. Reconstrueren de gedroogde peptiden van de scheiding van de fundamentele pH in 5% TFA.
  7. Laden ~0.2 µg op de kolom terwijl vloeiende 5% buffer A.
  8. Elute met 15% tot 45% voor buffer B in 150 min. Als uitgangspunt, gebruik het volgende verloop: tijd 0, buffer B 5%; tijd 2, buffer B 15%; tijd van 135, buffer B 45%, tijd 145, buffer B 70%; en tijd 150, buffer B 95%. Aanpassen van de gradiënt iets voor vroege en late fundamentele pH RPLC breuken na het herzien van de hoofdpiek chromatogrammen.
  9. Werken de massaspectrometer in gegevens-afhankelijke modus met een scan van de enquête in de ion trap massa analyzer (400-1600 m/z; 60.000 resolutie; 1 x 10 6 automatic gain control (AGC) doel; 50 ms maximale ion tijd; en centroid modus). Uitvoeren van 20 MS/MS high-resolution scans (60.000 resolutie, 1 x 10 5 AGC doel, ~ 100 ms maximale ion tijd, 35 HCD genormaliseerd botsing energie, 0.4 m/z isolatie venster en 20 s dynamische uitsluiting).
    Opmerking: Electron transfer dissociatie (ETD) wordt niet aangeraden voor TMT10-plex reagentia omdat ETD decollete sites zijn verschillend van HCD, resulterend in verslaggever ion overlapping. Bovendien, ETD is niet effectief als HCD is omdat al peptides doorgaans + 2 geladen Staten genereren en ETD efficiënter op hogere kosten Staten is.

6. Analyse van de gegevens van de MS

Opmerking: We beschrijven data-analyse met het softwareprogramma sprong. Echter, data-analyse kan worden uitgevoerd met andere commercieel beschikbare of vrije's.

  1. Proces raw-bestanden van de massaspectrometer met de hybrid tag-gebaseerde zoeken motor JUMP 21, die combineert een patroon gebaseerde database zoeken en de sequencing van een tag-gebaseerde DOVO ter verbetering van de gevoeligheid en specificiteit.
  2. De ruwe gegevens converteren naar mzXML opmaken en zoek MS2 spectra tegen de doel-lokvogel UniProt menselijke database (of andere geschikte soortspecifieke databank) voor het berekenen van het tarief valse ontdekking (FDR).
  3. Uitvoeren zoekopdrachten met behulp van een 10 ppm massa tolerantie voor zowel voorloper als fragment ionen. Stel andere zoekparameters op volledig al beperking met 2 maximale gemiste breuklijnen, 3 maximale wijziging sites per peptide en de toewijzing van een b en y ionen te scoren de peptiden. Statische aangebrachte wijzigingen TMT tags aangezet Lys residuen en N termini (+229.162 Da) en carbamidomethylation van Cys residuen (+57.021 Da). Stel dynamische wijzigingen op te nemen Met oxidatie (+15.994 Da), die een gemeenschappelijk peptide artefact als gevolg van de behandeling van het monster is.
  4. De gegevens filteren door de volgende criteria: 7 aminozuur minimale peptide lengte m/z nauwkeurigheid (b.v., 5 ppm) en bijpassende scoort (J score en deltaCn). Groep van peptiden volgens peptide lengte, trypticity, en opladen staat.
  5. Gebruiken een extra niveau van het filtreren congruente scores om eiwit FDR tot minder dan 1%. Eiwitten geïdentificeerd door een enkele spectrale telling vereist een hogere overeenkomende score.
  6. Voor gedeeld door meerdere leden van een familie van eiwitten, peptiden cluster de gecompenseerde eiwit-leden in 1 groep.
    Opmerking: Volgens het beginsel van spaarzaamheid, is de groep vertegenwoordigd door de proteïne met het hoogste aantal toegewezen peptiden en andere eiwitten geëvenaard door unieke peptiden 1.
  7. Kwantificeren van eiwitten door optelling van verslaggever ion graven over alle overeenkomende peptide spectrum wedstrijden (PSMs) met behulp van een programma dat is ingebouwd in de JUMP-softwaresuite.
  8. Voor elk aanvaard PSM, uitpakken en corrigeren van de TMT verslaggever ion intensiteiten volgens de isotopische verdeling van de labeling reagentia en het laden bias, die wordt berekend uit de globale PSM kwantificatie gegevens. PSMs filteren met een lage intensiteit en hoge geluidsniveau met gebruiker gedefinieerde drempels tijdens de kwantificatie.
  9. Berekenen een relatieve signaal tussen elke verslaggever ion en het gemiddelde van alle 10 verslaggever ionen. Som van de relatieve signalen van de PSMs voor de geïdentificeerde eiwitten. Deze relatieve signalen omzetten in absolute signalen door te vermenigvuldigen met de gemiddelde verslaggever ion intensiteit van de top 3 PSMs in overeenkomstige eiwitten.
  10. Gebruiken een rekenkundige benadering van post MS om te corrigeren van interferentie. Ervan uitgaande dat de y 1 ion intensiteit evenredig aan de intensiteit van de ion verslaggever is, berekent de lineaire relatie van schone scans en het niveau van de interferentie ontlenen de intensiteit van de besmette y1ion in lawaaierige scans 23.
    Opmerking: Voor TMT-label al peptides, K-TMT en R residuen zijn 2 soorten y 1 ionen (376.27574 Da en 175.11895 Da, respectievelijk) in MS2 scans. Als er slechts 1 y 1 ion wordt gedetecteerd en met de geïdentificeerde peptide strookt, geacht de MS2 schone scan ( figuur 3A). Als beide y1ions worden gedetecteerd, de MS2 wordt geacht een lawaaierige scan.
    11. De waarden van de kwantificatie eiwit exporteren
  11. naar een spreadsheetprogramma van de software voor verdere analyse. Paarsgewijze vergelijkingen of een variantie-analyse gebruiken om te identificeren van eiwitten die zijn differentially uitgedrukte.

7. MS Data Validation

Opmerking: om te beoordelen van de kwaliteit van de gegevens van de MS, ten minste 1 methode van validatie moet worden uitgevoerd voordat u verdergaat met tijdrovende biologische experimenten.

  1. Handmatig onderzoeken de MS/MS-spectra van proteïnen van belang zijn voor het valideren van de volgorde van de peptide en TMT verslaggever ion kwantificatie.
  2. Gebruik eiwit kwantificatie gegevens bekend om de MS-resultaten te bevestigen.
  3. Verifiëren eiwit veranderingen met antilichaam-gebaseerde benaderingen (bijv., westeRN vlek en immunohistochemistry analyse).
  4. Chemisch synthetiseren de peptiden van belang en gebruik ze als interne standaarden ter bevestiging van de identificatie van inheemse peptiden.
    Opmerking: Hun MS/MS patronen en retentietijd tijdens LC-MS/MS moet identiek.
  5. Verifiëren eiwit veranderingen met een gerichte aanpak van de MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gebruikten een eerder beschreven Kruis-soorten peptide mix om systematisch analyseren het effect van de compressie verhouding in 3 stappen van de grote protocol, met inbegrip van pre-MS fractionering, MS-instellingen en post-MS correctie23. De pre-MS fractionering werd geëvalueerd en geoptimaliseerd met behulp van een combinatie van fundamentele pH RPLC en zure pH RPLC. Voor de analyse van de post-MS, werden alleen soortspecifieke peptiden beschouwd. We gebruikten dit model interferentie te onderzoeken van een aantal parameters in LC/LC-MS/MS, inclusief de MS2 isolatie venster, online LC resolutie laden de online zure pH RPLC hoeveelheid en resolutie van de off line high-pH-RPLC (Zie Figuur 3 in verwijzing 29).

Om te wijzigen de resolutie tijdens de off line LC, we gescheiden van de isobaar gelabelde peptiden in 320 en vervolgens gecombineerd geselecteerde breuken samen om het aanpassen van de macht van scheiding. Off line LC resolutie werd getest met behulp van een aantal verzamelde fractie deelverzamelingen (1, 5, 10, 20, 40, 80 en 320), terwijl het toezicht op de niveaus van de storing. We vonden dat de storing niveaus daalde geleidelijk van 16,4% tot 2,8%, die aangeeft dat uitgebreide fractionering tijdens off line LC scheiding enigszins verminderd het probleem van mede eluerende peptiden maar was niet geschikt voor het volledig verwijderen de interferentie.

We geëvalueerd vervolgens het effect van het MS2 isolatie venster op interferentie. Wij vastbesloten experimenteel dat de storing ongeveer evenredig aan de grootte van het venster van de isolatie, in overeenstemming met eerdere studies29,30 was. Bijvoorbeeld een 4-fold verschil van venster omvang (1,6 tot 0.4 Da) resulteerde in een ~ 4-fold verschil van gevolgtrekking niveau (14,4% tot 3,7%). Wij ook bepaald het bedrag van de optimale laden op de kolom voor MS analyse en gebruikt deze informatie om verdere inmenging te ontkennen. We verlaagd de interferentie van 9,4% tot 3,3% door het laden van de juiste hoeveelheid monster. Laden van teveel monster kan leiden tot een hoogtepunt verbreding van31 en daarom verhogen de inmenging, wat resulteert in verminderde eiwit kwantificatie nauwkeurigheid. Tot slot, we de online RPLC resolutie geoptimaliseerd door het veranderen van de kleurovergang lengtes (1, 2 en 4 h) en met behulp van een lange kolom (~ 45 cm). We vonden dat een 4-h verloop bijna geëlimineerd van de inmenging (tot 0,4%), maar voegde ook een instrument tijd. De geoptimaliseerde parameters bleek een smalle isolatie venster (0.4 Da), ~ 100 ng van monster geladen op de kolom- en midlevel fractionering (~ 40 x 2 h, 3.3 dagen). We toonden ook aan dat we met behulp van een computer gebaseerde post-MS correctie strategie kwantitatieve precisie verbeterd bij het bepalen van de eiwit-ratio's (figuur 3B).

Onze resultaten wijzen erop dat het gebruik van geoptimaliseerd LC-MS parameters en post-MS correctie kan bieden een grondige proteomic profiel en vrijwel elimineren de storing die vaak door isobaar labeling technieken voor eiwit kwantificatie ontstaat.

Figure 1
Figuur 1: schema van de gehele-Proteoom profielanalyse door TMT-LC/LC-MS/MS. Tien biologische monsters werden lysed verteerd en gelabeld met 10 verschillende TMT tags, gebundelde even, en gespreide in 80 breuken door off line basis pH omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (LC). Elke andere fractie was verder gescheiden door zure RPLC en online met een hoge resolutie massaspectrometer geanalyseerd. De raw-bestanden van de MS/MS werden verwerkt en zocht tegen een Uniprot-gegevensbank voor identificatie van peptide en proteïne. Eiwitten zijn quantitated volgens de relatieve intensiteiten van de TMT-tags. Tot slot werden de geïdentificeerde en quantitated eiwitten ingediend voor integratieve data-analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: TMT efficiëntie onderzoek labeling. Beide TMT-label en hun corresponderende ongelabelde monsters werden geanalyseerd door LC-MS/MS afzonderlijk te onderzoeken van de TMT labeling van efficiëntie. Voor het volledige TMT labelen, (A) de labelloze peptide piek was volledig afwezig in het gelabelde monster, (B) Overwegende dat de peptide TMT-geëtiketteerden alleen in gelabelde monster aanwezig was. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: rekenkundige benadering voor het verwijderen van de storing na het verzamelen van de gegevens van de MS. (A) alle MS2 scans werden verdeeld in schone (linkerdeel) en lawaaierige scans (rechtervenster). Lawaaierige scans vertonen beide ionen1 y van K en R (1 uit een peptide van de doelgroep en de anderen besmetten peptides). (B) Escherichia coli peptiden individueel werden aangeduid met 3 verschillende TMT reagentia en gebundeld op 1:3:10 ratio's. Ongeveer 20-fold meer rat peptiden zijn toegevoegd als achtergrond. De opgetelde relatieve intensiteiten van de E. coli peptiden in de 3 fracties openbaarden dat y1 ion-gebaseerde correctie nauwkeuriger voor TMT gebaseerde kwantificatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beschrijven we een hoge-doorvoer-protocol voor de kwantificatie van eiwitten met een 10-plex isobaar labeling strategie, die is met succes geïmplementeerd in verschillende publicaties12,13,14,32 . In dit protocol, kunnen we maximaal 10 verschillende biologische EiwitSteekproeven in 1 experiment analyseren. We kunnen routinematig identificeren en kwantificeren van ruim 10.000 eiwitten met hoge vertrouwen. Hoewel isobaar labeling een effectieve technologie is te kwantificeren van eiwitten, wordt het beperkt door de compressie verhouding die tot kwantitatieve onnauwkeurigheid leiden kan. Ons protocol met behulp van verschillende strategieën, zoals het optimaliseren van LC/LC en MS/MS instellingen in combinatie met y1 ion-gebaseerde post-MS correctie, effectief verwijdert de meeste storende effecten en daarom aanzienlijk verbetert de nauwkeurigheid van eiwit kwantificatie.

Voor de kwantificatie van de eiwitten, de sprong suite van programma's functies op een aantal manieren. We meten de isotopische onzuiverheid voor elke batch van aangekochte reagentia, die enigszins van de gerapporteerde waarden in leverancier geleverde certificaten verschilt. De gemeten isotopische onzuiverheid wordt gebruikt voor het corrigeren van de intensiteiten van de verslaggever ionen in de JUMP-software. Een eiwit is meestal quantitated door vele PSMs met verschillende absolute intensiteiten die worden beïnvloed door verschillende oorzaken, zoals ionisatie efficiëntie. Omdat de invloed van de factoren onbekend is, onthullen massaspectra alleen de relatieve abundanties van verslaggever ionen in een TMT assay. De relatieve abundanties van verslaggever ionen zijn berekend door de intensiteit van elke verslaggever ion door de gemiddelde intensiteit van alle 10 verslaggevers. Om de beste vertegenwoordiger "absolute signaal" van het eiwit, berekend we een gemiddelde van de relatieve intensiteiten van 3 PSMs met de hoogste absolute intensiteiten van de eiwitten en het gemiddelde van de sterkste absolute intensiteit te schatten van de absolute signaal van het eiwit. Wij als volgt gedefinieerd als het herschalen. De y-1 correctie is universeel toepasbaar voor elke TMT-bepalingen; echter in sommige gevallen konden we niet corrigeren voor peptides met MS/MS-spectra met de y-1 -ion. We vonden echter dat ~ 90% van spectra de y1-ionen uit zowel lysine en arginine hebben. Om te compenseren voor de storing die wordt veroorzaakt door mede eluerende peptiden die dezelfde residuen als de geïdentificeerde peptide C-terminal hebben, was de geschatte interferentie niveau in wezen verdubbeld en gebruikt voor correctie. Deze aanname was gebaseerd op empirische gegevens die wij hebben verzameld over talrijke TMT-experimenten, waarin we het zelfde intensiteitsniveau voor y1 in K - en R-bevattende peptiden waargenomen.

Interferentie kan worden verminderd door veel andere methoden dan wat we hebben beschreven in dit protocol, zoals de MS3 multinotch aanpak. Al deze methoden zijn geldig en hun individuele verdiensten hebben. Uiteindelijk, de gebruikte methode hangt af van een aantal factoren, waaronder maar niet beperkt tot monster bedrag, instrument beschikbaarheid (d.w.z., instrument type en tijd die nodig is voor het analyseren van monsters), gewenste resultaten (dat wil zeggen, het aantal eiwitten geïdentificeerd), en kwantificatie nauwkeurigheid nodig.

Om ervoor te zorgen de meest accurate resultaten, is het belangrijk om te luisteren naar de stappen van de kwaliteitscontrole in het gehele protocol. Deze omvatten met behulp van nauwkeurige normen voor monster kwantificatie (bijvoorbeeldBSA dat heeft ondergaan aminozuur analyse), testen van de etikettering efficiëntie van de TMT-reagens, bepaling van het rendement van de spijsvertering van de trypsine, een premix verhouding test uitvoeren om een gelijke mengen van alle 10 monsters, en een softwarematig te corrigeren laden vooringenomenheid. In gevallen waarin een bekende proteïne of meerdere eiwitten zijn naar verwachting zullen vertonen expressie veranderingen tussen afzonderlijke monsters, is het belangrijk om uit te voeren westelijke vlekkenanalyse na de lysis van de cel van de eerste om te bevestigen dat deze wijzigingen aanwezig zijn en kunnen worden gedetecteerd. Dit zorgt ervoor dat de monsters vertegenwoordigen de biologie te beproeven en bespaart tijd, geld en inspanning vóór de uitvoering van het gehele TMT-protocol. Als een bepaalde monster verwachting uitspreken niet bepaalde expressie gebrachte eiwitten, is het ook belangrijk met westelijke vlekkenanalyse te bevestigen hun afwezigheid na lysis voordat u verdergaat met het protocol. Detest verhouding premix wordt gebruikt wanneer de meeste eiwitten verwachting niet wijzigen aan de 10 biologische monsters. Wij verwijderd ook bekende contaminerende eiwitten, zoals keratines, zodat ze zou geen negatieve invloed op onze correctie. Onze kwantificatie methode gecorrigeerd voor eventuele fouten die zich mogelijk hebben voorgedaan van pipetting fouten, enz. Indien mogelijk, we specifiek gebruikt Pipetteer volumes groter dan 5 µL ter vermindering van fouten. Wij uitgevoerd meerdere rondes van deze premix test om ervoor te zorgen dat we een nauwkeurige mix 1:1 verkregen. Het is belangrijk op te merken dat we niet dit soort premix verhouding test presteerde bij het gebruik van immunoprecipitation monsters voor het protocol, zoals we hadden verwacht een groot percentage van de eiwitten te wijzigen. In dergelijke gevallen zou de premix test vertekenen de resultaten. Dit geldt ook voor elk experiment waarin ten minste 1 van de 10 monsters naar verwachting zal variëren sterk in eiwit expressie (lege vector, proteasoom remming, enz.) In dergelijke gevallen, is het sterk aanbevolen om het gebruik van replicaat-organismen ter vergemakkelijking van de kwantificatie statistieken. Meestal wordt aangeraden voor deze soorten monsters uitvoeren van 3 repliceert. Uiteindelijk, het aantal replicatieonderzoeken is gebaseerd op de verwachte variabiliteit van elk monster.

Met sommige "fine-tuning", kan dit robuust protocol dienen als een algemene proteomic pijpleiding te onderzoeken, eiwitten, proteïne trajecten, progressie van de ziekte en andere biologische functies. Het hier gepresenteerde protocol biedt een krachtige techniek voor het verkrijgen van diepe eiwit dekking en verhouding onderdrukking tijdens kwantificering te verlichten. Met kleine wijzigingen, dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden aan eiwit posttranslationele modificaties, zoals fosforylatie, ubiquitination en acetylation33,34te kwantificeren. Deze soorten uitgebreide proteomics projecten kunnen worden geïntegreerd met de genomica, transcriptomics en eventueel metabolomica voor biologie een systeembenadering begrijpen van biologische systemen te vergemakkelijken van nieuwe ontdekkingen van moleculaire mechanismen, biomarkers, en therapeutische doelen in ziekte13,28,35,,36,,37,38.

We hebben een methode voor het nauwkeurig quantitating meer dan 10.000 eiwitten van hele cellen of weefsel lysates aangetoond. Wij verwachten dat deze methode te zijn breed toepasbaar voor vele biologische systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken alle andere lab en faciliteit leden voor nuttige discussie. Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door NI H verleent R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 en ALSAC. De MS-analyse werd uitgevoerd in de St. Jude Children's Research Hospital Proteomics Facility, slechts gedeeltelijk ondersteund door de NIH Cancer Center ondersteuning subsidie P30CA021765. De auteurs bedanken Nisha Badders voor hulp bij het bewerken van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Tags

Biochemie kwestie 129 bio-informatica interferentie isobaar labeling LC-MS/MS vloeibare chromatografie massaspectrometrie proteomics TMT
Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., … More

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter