Summary
مؤخرا نحن تعيين المواقع المكانية (3D) ثلاثي الأبعاد من طرق النقل لمختلف البروتينات ترانسلوكاتينج داخل أهداب الأساسية في الخلايا الحية. هنا تعيش هذه الورقة تفاصيل تطبيق الإعداد التجريبية والعملية للعينات البيولوجية وتحليل البيانات للأسفار 3D القرار العظمى التصوير نهجاً حديثا في أهداب الأولية.
Abstract
هدب الأولية المستندة إلى microtubule نتوء على السطح من العديد من الخلايا حقيقية النواة ويحتوي على مجموعة فريدة من نوعها من البروتينات التي تعمل حاسمة في حركية الخلية وإشارات. منذ أهداب قادرين على توليف البروتين الخاصة بهم، ما يقرب من 200 من البروتينات الهدبية فريدة من نوعها تحتاج إلى الاتجار بين سيتوسول واهداب الأولية. ومع ذلك، لا يزال تحديا تقنيا لتعيين مواقع (3D) ثلاثي الأبعاد لمسارات النقل لهذه البروتينات في أهداب الابتدائي حية بسبب القيود الموجودة حاليا تقنيات. للتغلب على هذا التحدي، مؤخرا لدينا المتقدمة والعاملين الفحص المجهري عالية السرعة قرار فائقة 3D ظاهري، تسمى نقطة واحدة الحافة--الإثارة مجهرية حيود الفرعية (سرعة)، تحديد الموقع المكاني ثلاثي الأبعاد لمسارات النقل كل سيتوسوليك وبروتينات الغشاء بأهداب الأولية للخلايا الحية. في هذه المقالة، سوف نظهر الإعداد التفصيلية لسرعة الفحص المجهري، إعداد الخلايا معربا عن الأسفار-البروتين المسمى البروتينات الهدبية وتتبع جزيء واحد في الوقت الحقيقي من البروتينات الفردية في هدب العيش وتحقيق خرائط ثلاثية الأبعاد المكانية الكثافة الاحتمالية لطرق النقل للبروتينات الهدبية.
Introduction
حيث ذكر إرنست [آب] في 1873، القرار للفحص المجهري الخفيفة التقليدية قد تم ويعتقد أن تقتصر على حوالي 200 شمال البحر الأبيض المتوسط بسبب حيود الضوء من الهدف1،2. حاليا تقنيات الفحص المجهري الخفيفة فائقة القرار كسر هذا القيد والسماح بالتقاط الصور الديناميكية مع القرار حيود الفرعية (< 200 nm). التقنيات عموما تندرج في فئتين عريضتين: حفز الانبعاثات استنفاد (STED) مجهرية على أساس النهج التي تولد حجم الإضاءة الحيود الفرعية بسبب الاستجابة البصرية غير الخطية من فلوروفوريس في3من العينات؛ ومن فوتواكتيفاتيد الخفيفة الميكروسكوب (النخيل) والتعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)-على أساس تقنيات فائقة القرار، التي تستخدم الدوال الرياضية تعريب سينترويدس فلوروفوريس وثم إعادة تشكيل هذه سينترويدس لنموذج القرار فائقة الصور4،5. حاليا، بسبب الإعداد الضوئية غير معقدة نسبيا، النخيل والعاصفة على نطاق واسع يعملون بتفعيل فقط مجموعة فرعية صغيرة من فلوروفوريس في كل إطار من شريط فيديو طويل لتحضير البيولوجية. وهذا يسمح للترجمة أكثر دقة بملائمة غاوسي 2D من بقعة مضيئة، يسمى الدالة نقطة انتشار (PSF)، البروتينات المسماة فلوريسسينتلي في كل إطار من الفيديو. ثم يمكن تركيب موقع 2D كل جزيء المسمى فلوريسسينتلي على متن طائرة تصوير واحد لإنتاج صورة فائقة قرار لإعداد البيولوجية1،2. بينما هذه الترجمة جزيء واحد، نهج القرار فائقة للفحص المجهري ثورة التأكيد كيف أنجز تصوير العينات البيولوجية، ولا تزال هناك تحديات يجب التغلب عليها. على سبيل المثال، العاصفة والنخيل يمكن تحقيق أفضل الحلول المكانية الخاصة بها بعد تثبيت العينات البيولوجية وهكذا يقدم تمثيل ثابت للبروتينات المسمى فلوريسسينتلي، ووجود قيود مماثلة على الميكروسكوب الإلكتروني. بالإضافة إلى ذلك، تحقيق عالية الدقة المكانية لكل البروتين المسمى فلوريسسينتلي في الخلايا الحية، يجب تصويرها عينات في فراميراتس طويلة جداً وغير قادر على التقاط ديناميات البروتين. ولذلك، من الضروري للتغلب على هذه العقبات التقنية الرئيسية.
للحصول على دقة عالية الزمانية المكانية التي مناسبة تماما لكشف البروتينات أو الكشف تتحرك بسرعة في الخلايا الحية، وقد وضعنا القرار فائقة السرعة مجهرية في لدينا مختبر (الشكل 1)6،7، 8-عدة أوجه التقدم التقني الرئيسية في سرعة الفحص المجهري مكنتنا سابقا لتعقب النقل نوكليوسيتوبلاسميك من الجزيئات الصغيرة بنجاح، والبروتينات، ومرناً والفيروسات من خلال الأم النووية المسام المجمعات (الشخصيات)6، 7 , 8-بإيجاز، سيتم استخدام الميزات التالية لسرعة الفحص المجهري لتعقب الجزيئات تتحرك بسرعة من خلال الهياكل الفرعية ميكرومتر التناوب متناظرة في الخلايا الحية، مثل الشخصيات واهداب الأولية: (1) يميل أو الإضاءة الرأسية PSF تمكن إثارة جزيئات مفردة داخل وحدة تخزين صغيرة حيود حد في المستوى البؤري (الشكل 1)؛ (2) PSF يميل يمكن تجنب الأسفار خارج نطاق التركيز إلى حد كبير ومن ثم تحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. (3) كثافة بصرية من 100-500 كيلو واط/سم2 في الإضاءة PSF يسمح آلاف فوتونات التي سيتم جمعها من فلوروفوريس واحدة مع الكشف بسرعة بسرعة (> 500 هرتز). (4) الصيام الكشف عن سرعة يقلل إلى حد كبير أيضا خطأ التعريب المكانية جزيء مفرد (< 10 نانومتر) في تحديد مسارات المكانية تتحرك الجزيئات الفلورسنت في الخلايا الحية، نظراً للانتشار الجزيئي أحد العوامل الرئيسية تسبب عيوب التعريب جزيء واحد لنقل الجزيئات. (5) الراسخة في 2D إلى 3D التحويل خوارزميات تمكننا من توفير خرائط ثلاثية الأبعاد المكانية الكثافة الاحتمالية لطرق النقل للجزيئات في المجلس الوطني أو هدب الأولية. الجدير بالذكر أن لدينا عملية التحويل بين ديكارت ونظام التنسيق أسطواني يستخدم لتوليد كثافة الاحتمالية مكانية 3D خريطة بدلاً من 3D جزيء واحد تعقب (الشكل 2). سابقا، قد كشفت البيانات الميكروسكوب الإلكتروني أن9،المجلس الوطني10 و هدب الابتدائية11 كلا من بنية متناظرة التناوب. من حيث المبدأ، ينبغي نشرها الجزيئات تتحرك من خلال المجلس الوطني للصحافة أو هدب الأولية عشوائياً أيضا أن التوزيعات التناوب متناظرة. كما هو مبين في الشكل 2، عدد كبير من نشرها الجزيئات داخل الاسطوانة عشوائياً من شأنه أن يولد توزيعات التناوب متناظرة في عرض المقطع العرضي كالتي في المجلس الوطني، كما أدى نحو موحد المكانية التوزيع داخل كل منطقة فرعية صغيرة جداً بين اثنين من حلقات المجاورة (الشكل 2ه). ويؤدي هذا التوزيع الموحد أن التوزيع المكاني على طول البعد θ في نظام أسطواني ثابت. ثم يمكن تبسيط إحداثيات ثلاثي الأبعاد (R, X, θ) أن تكون إحداثيات 2D (R, X, ثابت). في الواقع، لدينا عملية التحويل بين نظامي أسطواني وديكارت من 2D (X, Y) 2D (R, X, ثابت). Θ ثابتة، تشير إلى الكثافة المكانية ف في الشكل 2ه، ويتم حسابها باستخدام المعادلة A
.
وفي نهاية المطاف، تتبع جزيء واحد له تطبيق واسع في البحوث البيولوجية، ومن ثم، فمن الطبيعي أن توضع مجموعة كبيرة تقنيات لسد منافذ البيولوجية المحددة12،،من1314. وهذا هو الحال بالنسبة لسرعة الفحص المجهري. سابقا، عندما يقترن مع خوارزمية تحول 3D، تم تطوير هذا الأسلوب لحل طرق النقل 3D لعبور الجزيئات من خلال اللجان التحضيرية الوطنية، هيكل البيولوجي التناوب متماثل والحجم diffraction الفرعية6. في هذه الورقة، تظهر أهداب الأولية لتكون نموذجا ممتازا العضيات كذلك. أهداب الأولية هي العضيات أسطواني، مثل هوائي (radius نانومتر ~ 125) أن المشروع من على سطح الأرض من الثدييات معظم الخلايا15،16،17. فمسؤولة عن تلقي إشارات خارجية، ويحيل بها استجابة داخل الخلايا المرتبطة عادة بالنمو والايض15،16. ولذلك، تدفق البروتينات الهيكلية، إعادة تدوير مستقبلات transmembrane، وانتقال الرسل داخل الخلايا المسؤوليات الحيوية من أهداب الأولية. في هذا المنعطف بين أهداب الابتدائي وجسم الخلية هو حاجز انتقائية حرجة، تسمى منطقة انتقالية أو TZ، من خلاله يجب أن يحدث كل هذا النقل البروتين11،،من1819، 20. بالإضافة إلى وظيفة TZ النابضة، واثنين على الأقل من عمليات النقل، النقل إينترافلاجيلار ونشر السلبي، يعتقد أن تكون مسؤولة عن حركة البروتين من خلال هذه المنطقة16،21، 22-من وجهة نظر صحة بشرية، فقدان أهداب الابتدائي وإلغاء الضوابط التنظيمية اللاحقة مما يشير إلى المصب مميزة لكثير من أنواع السرطان. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الأمراض الوراثية مثل متلازمة باردت-بيدل ومرض تكيس الكلي، ترتبط بالبروتين معيبة النقل23. جعل حجم الحد حيود الفرعية والعملية المعقدة للنقل البروتين انتقائية عن طريق TZ أهداب الابتدائي هدفا رئيسيا لهذه التقنية. في هذه الورقة، والأساليب وسوف نظهر تتبع البروتين transmembrane الهدبية، مستقبلات سوماتوستاتين 3 (SSTR3)24، المسمى خارجياً مع أليكسا فلور 647 ومكون من ايفت، IFT2025، المسمى مع جزيء تنصهر في التجارة والنقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-المعاهد الوطنية للصحة-3T3 خلية التحضير لسرعة الفحص المجهري من المخزون
- استرداد 1.5 أسابيع قبل التجربة، ثقافة جديدة للمعاهد الوطنية للصحة-3T3 الخلايا من الأوراق المالية مجمدة بذوبان الجليد في 37 درجة مئوية ونقل الخلايا إلى 25 سم2 قارورة ثقافة الخليوي مع 3 مل من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع 110 ملغ/مل بيروفات صوديوم الجلوتامين مم 2، 10% مصل بقرى الجنين والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%.
- تقسيم الخلايا في كونفلوينسي 80 في المائة، عن كل يومين، ثلاث مرات على الأقل قبل يوم تجريبي لضمان التجانس لدورة الخلية. تريبسينيزي الخلايا مع التربسين 0.25% لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية ونضح التربسين واستبدله مع 2 مل متوسطة. ماصة المتوسط مرارا وتكرارا إلى تفريق تجمعات الخلايا وإزالة العدد المطلوب من الخلايا وجلب الحجم الإجمالي لوسائل الإعلام مرة أخرى تصل إلى 3 مل.
ملاحظة: المعاهد الوطنية للصحة-3T3 كانت سابقا وراثيا للتعبير عن نفب-4، بروتين الذي يموضع TZ26، تنصهر في المحطة ج إلى مشري. مشري هو فلوروفوري التي يمكن أن تكون متحمس مع 561 نانومتر الإضاءة لتعريب الحاجز الانتقائية TZ كمياً وتوجيه أهداب الأولية. - يومين قبل التجربة، لوحة الخلايا في أسفل زجاج 35 مم طبق في كونفلوينسي 60-70% مع 1.5 مل الوسط نفسه كخطوة 1.1 والعودة الخلايا للحاضنة.
- يوم واحد قبل التجربة، كيميائيا ترانسفيكت الخلايا مع بلازميد المرجوة. مزيج 500-1000 نانوغرام بلازميد المطلوب (راجع ملاحظة أدناه) بنسبة 1: 2.5 مع كاشف تعداء في 0.25 مل من المصل انخفاض وسائل الإعلام دون المضادات الحيوية من أجل 30 دقيقة أسبيراتي وسائل الإعلام من 35 ملم الزجاج الطبق السفلي واستبدله مع بلازميد 0.25 مل/ تعداء كاشف مزيج زائد 1.25 مل إضافية من المصل انخفاض وسائل الإعلام دون المضادات الحيوية. وسائط المصل انخفاض يخدم غرض تيسير تعداء ناجح، الذي يحفز نمو أهداب الأولية، فضلا عن إبقاء الخلايا حية طويلة بما يكفي لإجراء التجربة. إعادة الخلايا إلى حاضنة للتجربة في اليوم التالي.
ملاحظة: عند إجراء تتبع جزيء واحد من IFT20، بلازميد تحتوي على IFT20 المعدلة وراثيا تنصهر في نهايته ج للتجارة والنقل وهي تستخدم25. عند أداء جزيء واحد تتبع SSTR3، تنصهر فيها بلازميد يحتوي على SSTR3 من الأغذية المعدلة وراثيا في نهايته N إلى مجال ببتيد (AP) يقبلون وتيرمينوس ج للتجارة والنقل المستخدمة22. بالإضافة إلى بناء SSTR3، يجب أن يعبر عنه بلازميد يحتوي على ليجاسى البيوتين البيرا المشترك ويجب أن تستكمل وسائل الإعلام تعداء مع 10 ميكرون البيوتين. ثم تولي البيرا البيوتين إلى مجال AP المركبة حديثا جزيئات AP-SSTR3-التجارة والنقل على المستوى لائحة. Alexa647 مترافق لثلاثة من أربعة مواقع البيوتين الملزمة في ستريبتافيدين، في المتوسط، ثم يمكن استكمال لوسائل الإعلام قبل التصوير إلى التسمية فلوريسسينتلي الجزيئات AP-SSTR3-التجارة والنقل على السطح الخارجي ل الخلية22،27 . وتستخدم في هذا الأسلوب؛ التجارة والنقل و AlexaFluor647 ومع ذلك، يمكن استخدام المسابير الفلورية الأخرى إذا كان لديهم وبالمثل صور عالية-الاستقرار والكم تسفر عن. - في حالة استخدام بناء SSTR3 المسمى خارجياً، إزالة الوسائط من أسفل الزجاج طبق ح 1 قبل التجربة وغسل الخلية 5 مرات مع 1 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS)، وإضافة 1 مل من المصل انخفاض وسائل الإعلام وتستكمل مع 1 ميكرومتر Alexa647 مترافق ستريبتافيدين.
- قم بإزالة الوسائط من الطبق أسفل الزجاج لا يزيد عن 15 دقيقة قبل التجربة، وتغسل الخلايا ترانسفيكتيد والمسمى 5 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- ضع 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير (20 ملم حبيس، 110 مم كوك، 5 ملم نواك، 2 مم مجواك، 1 مم عطا، 7.3 درجة الحموضة) في الطبق أسفل الزجاج.
ملاحظة: في المخزن المؤقت للتصوير، خلايا قابلة للتطبيق للم يعد من ح 3. لذلك، يتم تنفيذ فقط 2 ح تجارب على كل طبق.
2-سرعة الفحص المجهري
ملاحظة: يتضمن إعداد الفحص المجهري السرعة مجهر مقلوب fluorescence مجهزة هدفا اللازيغيه غمر نفط 100 × 1.4-نا، 35 ميغاواط 633 نانومتر ني أنه ليزر، 50 ميغاواط الحالة الصلبة 488-شمال البحر الأبيض المتوسط، وشمال البحر الأبيض المتوسط-561 أشعة الليزر، ومكسب في ضرب على شريحة جهاز شحن إلى جانب الكاميرا وحزمة برامج مجهر للحصول على البيانات وتجهيزها (الشكل 1). لتصوير القناة الفردية، متحمسون بروتينات فلورية خضراء، مشري، و Alexa647 من 488 نانومتر، 561 شمال البحر الأبيض المتوسط، أو 633 نانومتر الليزر، على التوالي. لتتبع جزيء واحد، والإضاءة نقطة واحدة يتم استخدامه لتتبع الجزيئات الفردية المسمى فلوريسسينتلي. للتصوير ابيفلوريسسينسي، ويتم وضع عدسة مقعرة في المسار الإضاءة الليزر لتوسيع الشعاع في حقل موحدة من الإضاءة. الانبعاثات الأسفار التي تجمعها نفس الهدف وتصفية بواسطة عامل تصفية مزدوج اللون (405/488/561/635) وعامل تصفية انبعاثات (405/488/561/635) وتصويرها بكاميرا CCD أعلاه تعمل على 500 لتعقب جزيء واحد أو 2 هرتز تصوير ابيفلوريسسينسي.
- إلصاق لوحة أسفل الزجاج إلى مرحلة المجهر وتحديد موقع خلية التي تعرب عن بنيات المطلوب بشكل صحيح. مرة واحدة وقد تم العثور على خلية مناسبة، محاذاة بقعة NPHP4-مشري في قاعدة أهداب الأولية مع الموقع على متن الطائرة التصوير الذي يتوافق مع إضاءة الليزر نقطة واحدة.
- قم بالتقاط صورة ابيفلوريسسينسي NPHP4-مشري، وأما IFT20-التجارة والنقل أو AP-SSTR3-التجارة والنقل باستخدام الدالة "المفاجئة" في علامة التبويب "الكاميرا" من إطار "عناصر التركيز" في حالة استخدام حزمة برامج الفحص المجهري الرقمية (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: سوف تعمل هذه الصور كمرجع لمواقع جزيء واحد اللاحقة. - حالما يتم الحصول على الصور المرجعية، محلياً خفض تركيز جزيئات مفردة مسماة. صور--التبييض TZ مع إضاءة الليزر ميغاواط 1 ل 20 ق أو حتى شدة الأسفار قريب من الأسفار الخلفية.
ملاحظة: عند تركيز دقيق يمكن السيطرة عليها، 0.1-1 نانومتر المسمى الجزيئات واحدة تستخدم. - للتحضير لتعقب جزيء واحد، الحد من قوة الإضاءة الليزر ~0.15 ميغاواط لجزيئات مفردة المسمى مع بروتينات فلورية خضراء أو ~0.5 ميغاواط للجزيئات المسماة مع Alexa647.
- بمجرد أن قوة الليزر والتصوير المعلمات هي مجموعة، الحد الأقصى من الربح وتكثيف ومعدل الإطار 2 مللي ثانية، لتصوير جزيء واحد، إشراك الليزر الإضاءة المناسبة وتسجيل غير فوتوبليتشيد، وصفت جزيئات واحد كما أنها تنقل من خلال منطقة فوتوبليتشيد TZ بالنقر فوق الزر "تيار" في علامة التبويب "الكاميرا" من إطار "عناصر التركيز".
ملاحظة: يجب أن يتم القبض على أكثر من 2 دقيقة من الفيديو التقليل من آثار الهدبية الانجراف إلى مستوى لا يذكر. - بعد التقاط الفيديو جزيء واحد، عملية أشرطة الفيديو باستخدام خوارزمية مناسب غاوسي 2D، مثل لمحة عن طريق مختبر جيليس، وفيها دقة يموضع centroid للإثارة كل جزيء واحد PSF في منطقة تشمل الاهتمام (AOI).
- حدد كل جزيء واحد المواقع بدقة < 10 نانومتر، وتصحيح مركز أهداب على أساس توزيع مواقع جزيء واحد مزودة بوظيفة غاوسي 2D.
ملاحظة: باستخدام 2D إلى خوارزمية تحول 3D، طرق النقل 3D IFT20-التجارة والنقل ووكالة اسوشييتد برس-SSTR3 طرق هي بوضوح على الغشاء أكسونيمال أو الهدبية الهدبية، على التوالي.
3. 2D إلى 3D التحويل
- حالما يتم جمع عدة آلاف لعبور الجزيئات (الإشارات إلى الضجيج نسبة > 11) في هدب تعريب، حدد محور طويل هدب X-البعد. جعل الرسم بياني بعد Y للمواقع والحصول على مبالغ بن تزايدات 10 من شمال البحر الأبيض المتوسط.
ملاحظة: يمكن تقييم في 2D إلى 3D التحويل بواسطة اليد أو أي برنامج أو لغة البرمجة. الكتاب نفذت بنجاح التحول في Matlab و 2.7 بيثون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح هذا القسم البيانات المتحصل عليها من أداء سرعة الفحص المجهري في TZ أهداب الأولية لدراسة مسار النقل SSTR3 متصلة بواسطة رابط خارجي نانومتر ~ 15 إلى Alexa647 (الشكل 3أ). أنه يخدم الغرض المزدوج للتحقق من خوارزمية تحول 3D. وينبغي Alexa647 حسب التسمية السطح الخارجي هدب الأولية، ومن ثم المسار 3D النقل ينبغي أن تكشف عن مسار نقل عالي الكثافة في هذا الموقع. يجب أن transfected مع وكالة اسوشييتد برس-SSTR3-التجارة والنقل المعاهد الوطنية للصحة-3T3 ستابلي معربا عن NPHP3-مشري في TZ والمحتضنة وفقا للبروتوكول المذكور أعلاه مع مترافق ستريبتافيدين Alexa647. يستخدم التصوير بمجال واسع للتسمية مشري تعريب TZ في حين يستخدم في التجارة والنقل للتأكد من أن خلية قد أعرب في بناء SSTR3 المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، تصوير ميدانية واسعة للتسمية Alexa647 استخدام 633 نانومتر الإضاءة اللازمة للتأكد من أن الخلية بشكل صحيح وقد أعرب بلازميد البيرا واستوعبت البيوتين كافية من وسائل الإعلام. تأكيد إيجابي يتسم هدب مرئية متميزة من الأسفار الخلفية (الشكل 3ب). وسم كفاءة بناء AP-SSTR3-التجارة والنقل مع مترافق ستريبتافيدين Alexa647 يمكن أن يحدث إلا في ظل هذه الظروف. مرة واحدة تم الحصول على تأكيد إيجابية لوسم انتقائية من هدب الأولية من Alexa647، فوتوبليتشينج والإضاءة نقطة واحدة من TZ مع ليزر 633 نانومتر سوف تسمح جزيئات مفردة تصور. قبل تحليل البيانات، فرض الفيديو جزيء واحد على الإضاءة الميدانية على نطاق واسع خطوة مفيدة في التحقق من صحة (الشكل 3ج). على سبيل المثال، إذا لم يتم محاذاتها الليزر بشكل صحيح، ستظهر لا جزيئات مفردة لتعريب يشترك مع TZ. آخر خطوة التحقق من الصحة في تحليل البيانات السابقة لضمان نسبة الإشارة إلى الضوضاء كافية للتحقق من الكثافة في TZ على طول جزيء واحد الفيديو (الشكل 3ه). يمكن إجراء هذا التحليل بسرعة في إيماجيج باستخدام الدالة 'مؤامرة الشخصية المحور z'. القمم في الشكل 3و تتوافق مع مظهر جزيء واحد في TZ مع إشارة إلى ضوضاء ~ 5.0. هذا الرسم البياني أيضا قادرة على ضمان حدوث ما يكفي فوتوبليتشينج كما يدل على ذلك تواتر جيدا فصل جزيئات مفردة. الشكل 3 ز يوضح نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة < 0.5. وسيكون أحد التفسيرات أن لم يتم محاذاتها الليزر مباشرة على TZ. قد يكون هناك سبب آخر أن قوة الإضاءة الليزر منخفضة جداً. ويؤدي الإثارة منخفض كل التفسيرات، ولذلك انخفاض انبعاثات فلوروفوريس في TZ. بعد إجراء هذه الفحوص، سوف تنتج 2D المناسب الضبابي من جزيئات مفردة مساراتها في TZ (الشكل 3ح). سوف تنتج فرض مسارات العديد من مسار النقل من البروتين المسمى الاهتمام TZ (الشكل 3أنا). منذ تركيب غاوسي 2D يتوافق مع قيم بكسل على الكاشف، x، y جزيء واحد البيانات قد يتم دمج مع صورة ميدانية واسعة TZ واهداب الأولية لزيادة توضيح البروتين من التعريب للفائدة (الشكل 3ي ).
IFT20 هو عنصر من عناصر ايفت المعقدة، التي تحمل البضائع على طول microtubules داخل أهداب الابتدائي25. واستخدمت لتسمية أهداب الابتدائي19Arl13b-مشري، بروتين علامة الهدبية مستخدمة على نطاق واسع. استخدام الصورة في هدب الأولية معربا عن Arl13b-مشري والتجارة والنقل IFT20 مجهرية واسع المجال برنامج التحصين الموسع-الأسفار وثم تحولت إلى سرعة الفحص المجهري لتعقب الفردية البروتينات IFT20-التجارة والنقل في أهداب الأولية بعد قبل فوتوبليتشينج للتجارة والنقل الأسفار وصولاً إلى مستوى جزيء واحد في مجال الإضاءة لسرعة الفحص المجهري (الشكل 4أ-4 ج).
في نهاية المطاف، يمكن الحصول على مئات مواقع التجارة والنقل IFT20 جزيء واحد مع دقة ترجمة المنهجي < 16 نيوتن متر من هدب الأولية من خلية حية (الشكل 4د). وفقا لمحاكاة لدينا، واحد 250 موقعا جزيء مع دائرة نصف قطرها من 95 شمال البحر الأبيض المتوسط كان كافياً لتوليد مسار موثوق نقل ثلاثي الأبعاد (الشكل 5). قرار نهائي لمسار النقل IFT20-التجارة والنقل يستند إلى الآلاف من جزيء واحد المواقع IFT20-التجارة والنقل التي تم جمعها من عشرة أهداب (الشكل 4ه). منذ الابتدائي أهداب تمتلك بنية مع التناوب التماثل، طبقت في 2D إلى خوارزمية تحول 3D 2D البيانات المتوقعة. من المثير للاهتمام، خرائط ثلاثية الأبعاد المكانية الكثافة الاحتمالية IFT20 أشارت إلى أن منطقة عالية الكثافة واحدة فقط مع عرض ~ 60-شمال البحر الأبيض المتوسط بلغ ذروته في ~ 95 شمال البحر الأبيض المتوسط على طول شعاع أهداب الأولية (الشكل 4ه). هذه المنطقة عالية الكثافة المحتمل يموضع يشترك مع ميكروتوبوليس أكسونيمال، باﻻتفاق مع الموقع المعروف من طريق ايفت (الشكل 4و).
الشكل 1 . التخطيطي المبسط لسرعة الفحص المجهري. عمودي (المسار 1) أو دالة انتشار نقطة ميلا (مسار 2) يتم استخدامه لإلقاء الضوء على جزيئات فلوروفوري واحد في المستوى البؤري. "د" يشير إلى المسافة بين عمودي إنارة شعاع الليزر الذي يمر عبر وسط الهدف وزاوية الإضاءة الذي يتحقق من خلال تركيز الليزر الإضاءة على حافة الهدف. تستخدم أشعة الليزر اثنين أو أكثر التي ينظمها مروحية بصرية بأسلوب إثارة على الخروج لتعقب الجزيئات واحدة تمر عبر المجلس الوطني أو هدب الأولية. وقت إيقاف التشغيل على الأقل عشرة إضعاف أطول من الوقت فوتوبليتشينج من التسمية فلوروفوري على الجزيئات المستهدفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . مظاهرة رسومية في 2D لعملية التحويل 3D- الخطط تثبت في 2D إلى خوارزمية تحويل ثلاثي الأبعاد للجزيئات، على سبيل المثال، إذا كانت منتشر داخل التجويف المركزي (واو) أو منطقة هامشية (ز-ل) أنبوب. (A) يمكن تنسيق المواقع المكانية 3D المثالية لنشرها الجزيئات داخل أنبوب عشوائياً في نظام تنسيق أسطواني (R, X, θ). في سرعة، ويحسب فقط الخريطة الكثافة ثلاثية الأبعاد في نهاية المطاف من المواقع المكانية 2D. ومع ذلك، هذا حالة مثالية لتوضيح أن الخريطة الكثافة 3D ما يعادل ما إذا كانت معروفة في 2D أو 3D المواقع المكانية. (ب) مواقع الجزيئية 3D يتم إسقاط على طائرة 2D في نظام تنسيق ديكارت (X, Y, Z) بالتصوير المجهري. (ج) شريحة رقيقة جداً (Δx) قطع من الاسطوانة في A على طول × البعد. (د يمكن المتوقع) المواقع المكانية ثلاثية الأبعاد في شريحة سيظهر في ج داخل منطقة ضيقة في 2D. (ه) عرض المقطع العرضي لكافة المواقع في شريحة رقيقة سيظهر في c يمكن تجميع هذه المواقع في المناطق الفرعية بين حلقات متحدة المركز. ونظرا لارتفاع عدد الجزيئات موزعة عشوائياً في الاسطوانة وقص شريحة رقيقة جداً، كثافة المواقع المكانية (فأنا) في كل منطقة فرعية (Si) بين اثنين من حلقات المجاورة سوف يكون التناوب متناسقة وموحدة. يمكن كذلك المتوقعة هذه المواقع إلى د 1 على طول البعد Y. إذا كانت المواقع على طول البعد Y تتجمع في الرسم بياني مع أعمدة ي. يساوي العدد الإجمالي لمواقع في كل عمود (جعفر) 
، الذي يمكن تجريبيا قياس كما هو موضح في (و). (غ-ل) مماثلة كما ورد أعلاه، تقدم عملية التحول للجزيئات التي نشرها داخل منطقة هامشية من أنبوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 -المكان المكانية 3D خط النقل ل SSTR3 على أهداب الابتدائي يعيش تعيينها بسرعة الفحص المجهري. (أ) رسومي لسرعة الفحص المجهري يجري تطبيقها على متابعة SSTR3 معلم التجارة والنقل من خلال TZ تميزت NPHP4-متشيري. (ب) الصورة ابيفلوريسسينسي NPHP4-مشري (أحمر)، أ فب-SSTR3-بروتينات فلورية خضراء (الأخضر)، Alexa647 التي تستخدم لتسمية خارجياً AP-SSTR3-بروتينات فلورية خضراء (أبيض)، والصورة المدمجة النهائية. شريط الحجم: 2 ميكرومتر. (ج) تتبع واحد المسمى 647 أليكسا AP-SSTR3-التجارة والنقل (أبيض) الذي يمر عبر حقل الإضاءة نقطة لأربعة إطارات (2 مللي ثانية في الإطار). شريط الحجم: 2 ميكرومتر. (د) جزيء واحد مسار (أبيض) من (ج) فرضه على صورة ابيفلوريسسينسي NPHP4-مشري (أحمر) ووكالة اسوشييتد برس-SSTR3-بروتينات فلورية خضراء (أخضر). شريط الحجم: 2 ميكرومتر. متقطع الأبيض (ه) مربعا يسلط الضوء على مجال الإضاءة نقطة واحدة تركز على TZ. شريط الحجم: رقم 2 ميكرومتر. (و) فوتون العد مقابل إطار الرسم البياني لجزيء واحد فيديو مع إشارة عالية للضوضاء بالنسبة قسمة fluorescence الحد الأقصى من جزيء واحد مقسوماً على الأسفار الخلفية. (ز) فوتون العد مقابل الإطار رقم الرسم البياني لجزيء واحد فيديو مع إشارة منخفضة بنسبة الضوضاء. (ح) مسار من (ه) و (د) المترجمة في كل إطار بملائمة غاوسي 2D وفرضه على تمثيل رسومي دقيق ل TZ، مترجمة أيضا بتركيب غاوسي 2D. عملية تركيب غاوسي 2D يناسب وظيفة غاوسي إلى أبعاد X و Y لكثافة لمجال يحظى باهتمام (AOI) يشمل PSF.(I) جزيء واحد في 2D القرار فائقة التوزيع المكاني ل 220 الفردية المسمى أليكسا فلور 647 مواقع AP-SSTR3-التجارة والنقل التي جمعت من هدب أساسي واحد. (ي) قرار فائقة جزيء واحد المواقع من (ط) فرضه على صورة ابيفلوريسسينسي NPHP4-مشري (أحمر) ووكالة اسوشييتد برس-SSTR3-بروتينات فلورية خضراء (أخضر). شريط الحجم: 2 ميكرومتر. (ك) من 2D إلى 3D تحويل الخوارزمية، توزيع الكثافة الاحتمالية المكانية المسمى أليكسا فلور 647 AP-SSTR3-التجارة والنقل على أهداب الأولية على طول البعد R تم الحصول عليها. تستند وظيفة غاوسي المناسب، المسمى أليكسا فلور 647 AP-SSTR3-بروتينات فلورية خضراء تقع أساسا على الغشاء الهدبية في دائرة نصف قطرها من 131±3 شمال البحر الأبيض المتوسط ذات عرض كامل في نصف كحد أقصى (فوم) 24±1 شمال البحر الأبيض المتوسط. (L) عرض المقطع العرضي لتوزيع الكثافة الاحتمالية المكانية (سحابة خضراء) المسمى أليكسا فلور 647 AP-SSTR3-التجارة والنقل على أهداب الأولية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 -موقع المكاني ثلاثي الأبعاد من طريق النقل IFT20 داخل أهداب الابتدائي يعيش تعيينها بسرعة الفحص المجهري. (أ-ج) صورة الممثل مشري Arl13b (A) والتجارة والنقل IFT20 (ب) أعربت عن الاشتراك في خلية NIH3T3 والمدمجة (ج). الدائرة (سماوي) يشير إلى موقع إضاءة نقطة واحدة من سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية نمت إلى جانب خلية (خطوط متقطعة بيضاء) الحواف التي تتحدد بالأسفار IFT20-التجارة والنقل في جسم الخلية وإضاءة مشرقة الحقل (لا سيظهر). شريط الحجم: 10 ميكرومتر. (د) القرار فائقة 2D التوزيع المكاني لمواقع التجارة والنقل IFT20 الفردية 286 التي جمعت من هدب أساسي واحد. (ﻫ) من 2D إلى 3D تحويل الخوارزمية، يتم الحصول على توزيع الكثافة الاحتمالية المكانية IFT20-التجارة والنقل داخل أهداب الأولية على طول البعد R. تستند وظيفة غاوسي المناسب، IFT20-التجارة والنقل أساسا تحديد موقع في دائرة نصف قطرها من 95±1 شمال البحر الأبيض المتوسط مع عرض كامل نصف الحد الأقصى (فوهم) من 56±5 شمال البحر الأبيض المتوسط. (F) عرض المقطع العرضي على توزيع الكثافة الاحتمالية المكانية (الغيوم الخضراء) IFT20-التجارة والنقل في أهداب الأولية، مضافين مع التخطيطي في شريط مقياس حاء: 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . تم استخدام المحاكاة لتقدير الحد الأدنى لعدد مواقع جزيء واحد ثنائي الأبعاد لإنشاء مخطط كثافة الاحتمال المكاني ثلاثي الأبعاد يمكن الاعتماد عليها 2D إلى 3D تحويل الخوارزميات. (أ) 100 حسابياً إنشاء مواقع جزيء واحد عينة عشوائياً من توزيع عادي كثافة شعاعي، تركزت في 95 نانومتر (المقابلة لمسار النقل الأساسي IFT20 العزم في تجاربنا). دقة الترجمة من 16 شمال البحر الأبيض المتوسط هو محاكاة لكل موقع جزيء واحد بأخذ العينات من توزيع العادي مع σ = 16 شمال البحر الأبيض المتوسط. كما هو مبين في الشكل 2ج، شريحة رقيقة جداً (Δx) في البعد س يستخدم لتحويل الخوارزميات و ولذلك لا يظهر البعد العاشر في المواقع جزيء واحد 2D المولدة حسابياً. (ب) التحول بين بيانات المشروع Y ثلاثي الأبعاد والكثافة R ثلاثي الأبعاد 3D توليد الرسوم البيانية للكثافة R ثلاثي الأبعاد 3D لخمس مجموعات البيانات محاكاة مختلفة (كل منها 100 نقطة). الرقم أعلاه هو ± الموقف ذروة المناسب خطأ. (ج-د) نتائج المحاكاة استناداً إلى 250 موقعا جزيء واحد. (ه-و) نتائج المحاكاة تستند إلى 500 جزيء واحد المواقع. (ز--أنا) متوسط كثافة 3D رسوم بيانية من المحاكاة 100-، 250 و 500 نقطة على التوالي. أشرطة الخطأ تمثل التغير في مرتفعات بن الرسم البياني بينما العدد أعلاه الذروة الذروة متوسط موقف ± الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول تطبيق سرعة الفحص المجهري هدب الأولية، عضية إشارات خلوية التي عالية تعتمد على البروتين كفاءة النقل. سرعة الفحص المجهري يمكن أن توفر دقة عالية مواقع (< 10 نانومتر) للجزيئات المسماة فلوريسسينتلي كما أنها تمر عبر الإضاءة نقطة واحدة تركز على TZ. سابقا قد طبق على دراسة البروتين الاتجار بالأشخاص من خلال المجلس الوطني6،،من78. ومع ذلك، يجوز تمديدها لدراسة الاتجار بالأشخاص عن طريق تجويف الخلوية أي حيود الفرعية. هذا الأسلوب له ميزة على غيرها من تقنيات التصوير عالي الدقة في ذلك وقادر على التقاط ديناميات النقل البروتين وحيد في نظم الخلايا الحية بدقة المكانية والزمانية < 10 نانومتر و < 2 مللي ثانية، على التوالي. ميزة أخرى هي أن أحد يجب فقط فلوريسسينتلي--تسمية وتين اهتمام والتعبير عن البناء عبر تعداء، اتباع نهج مشترك في بيولوجيا الجزيئية لدراسة البروتين التعريب، البدء في إجراء الفحص المجهري السرعة. واحد يجب أن نضع في اعتبارنا أن الإضاءة نقطة واحدة مع ليزر عالية الطاقة هي الميزة التي توفر مواقع جزيء واحد جيدا المنفصلين عن ذويهم، وارتفاع القرار. ومع ذلك، هذا أيضا يحد من مجال الإضاءة ويجعل هذا الأسلوب غير مناسب للترجمة الميدانية على نطاق واسع. لحسن الحظ، هناك العديد من التقنيات القرار سوبر ميدانية واسعة للمحققين للاختيار من بينها، إذا رغبت في ذلك. نقطة أخرى للنظر أن سرعة الفحص المجهري يلتقط فقط مواقع لنقل الجزيئات واحدة. ولذلك، قد يكون الجمع بين مع فراب، الذي يمكن تحديد جزء صغير من مجموع الجزيئات التي تكون متنقلة، إضافة مفيدة للتحليل.
عملية التحويل بين ديكارت ونظام التنسيق أسطواني لإنشاء مخطط كثافة الاحتمال 3D ظاهري بدلاً من عرض ثلاثي الأبعاد استناداً إلى تتبع 3D جزيء واحد. بالتفصيل، كشفت البيانات الميكروسكوب الإلكتروني أن أهداب الأولية يكون هيكل متناظرة التناوب التي يمكن أن تولد توزيعاً جزيء موحدة على طول نصف قطرها معينة. ويؤدي هذا التوزيع الموحد أن التوزيع المكاني على طول البعد θ في نظام أسطواني ثابت. ثم يمكن تبسيط إحداثيات ثلاثي الأبعاد (R, X, θ) أن تكون إحداثيات 2D (R, X, ثابت). في الواقع، لدينا عملية التحويل بين نظامي أسطواني وديكارت من 2D (X, Y) 2D (R, X, ثابت). Θ ثابتة، تشير إلى الكثافة المكانية ف، ويتم حسابها باستخدام المعادلة A
(الشكل 2). استخدام آلة حاسبة مصفوفة لحساب الناقل 
، الذي يتوافق مع المناطق النسبي بين حلقات متحدة المركز المجاورة في شريحة عرض6،7sجعفر مواقع التفاعل الكلي في ي موقف تقاس مباشرة من التجارب؛ وهكذا، فالأول، الكثافة الاحتمالية المكانية من مواقع التفاعل في البحث والتطويروأنا، يمكن حسابها عن طريق حل معادلة المصفوفة A.
خطوة حاسمة في البروتوكول التقليل إلى أدنى حد من أي اضطراب من الإعداد مجهرية بين الحصول على مرجع الصور والفيديو جزيء واحد. في حالة حدوث أي حركة، من غير الممكن لتعيين مواقع جزيء واحد ثقة إلى أولتراستروكتوري أهداب الأولية التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير ابيفلوريسسينسي. هو خطوة أساسية أخرى إلى فوتوبليتش مجال إضاءة كافية خفض تركيز الجزيئات واحدة فلوريسسينتلي المسمى محلياً ولكن ليس إلى حد أن السكان تماما فوتوبليتشيد. وفي حالة SSTR3، معامل نشر بطيئة مقارنة بالجزيئات القابلة للذوبان وحركة السكان من جزيئات SSTR3 فوتوبليتشيد الأمم المتحدة مرة أخرى إلى منطقة فوتوبليتشيد سوف تكون أطول من دقيقتين، الوقت بعدها الانجراف الهدبية عامل لا يستهان به. إذا كان من الصعب تحقيق المستوى المناسب من فوتوبليتشينج ومستوى عال من الأسفار الخلفية لا تزال موجودة، ليزر زاوية إضاءة قد تستعمل لتقليل كمية جزيئات مفردة المسماة فلوريسسينتلي التي متحمسون أعلاه وأدناه تصوير الطائرة. وهذا الحد من الخلفية وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لكل جزيء واحد تم التقاطها.
وخلاصة القول، سرعة الفحص المجهري قادراً على سهولة تنفيذ على الفحص المجهري التقليدي على الأجهزة بإضافة مصدر إضاءة ليزر ومرايا المرتبطة بها، وكاميرا عالية السرعة اتفاقية مكافحة التصحر. النهوض الرئيسية عبر تقنيات أخرى مماثلة هي الليزر يميل مما يقلل كثيرا من الأسفار الخلفية وخوارزميه التحويل 2D إلى 3D الذي يعيد خريطة 3D الكثافة الاحتمالية المكانية من 2D جزيء واحد المواقع. من ناحية بيولوجية، لا وضع العلامات الإضافية إلى جانب بروتين مترافق fluorophore الاهتمام مطلوب. تسمح هذه الميزات سرعة الفحص المجهري لتعقب الجزيئات واحدة مع ارتفاع الزمانية المكانية (5-10 نانومتر، 0.4-2 مللي) القرار كما أنهم حركة المرور من خلال ميكرومتر الفرعية بيو-تجويف أو قناة الحيوية مع هياكل التناوب متماثل. مقترنة مع خوارزمية تحول كثافة الاحتمالية 3D، قد يتم تحديد طرق النقل ثلاثي الأبعاد للبروتينات المعلمة من خلال تجويف أو قناة. تطبيق هذه التقنية قد استخدمت سابقا للتمييز بين طرق النقل ثلاثي الأبعاد للبروتينات والكشف من خلال المجلس الوطني، ونعرض هنا، أن النقل ثلاثي الأبعاد لبروتين ترانسميمبراني و SSTR3 وبروتين سيتوسوليك، IFT20، قد تتحقق في TZ من أهداب الأولية. الحصول على التقنيات سوبر القرار الأخرى، مثل 3D-العاصفة، س، ص، ض المواقف لجزيئات مفردة بوضع عدسة أسطوانية في المسار البصري الذي يقوم تشويه غير متناظرة من PSF جزيء واحد تبعاً لموقفها في أعلى أو أسفل المستوى البؤري28. قد يحاول تقدما آخر لتنفيذ التكنولوجيا الثقب الظاهري تقليل عرض انبعاث PSF، وبالتالي زيادة القرار أبعد من ذلك. التقنيات المذكورة أعلاه يمكن أن تنفذ في سرعة الفحص المجهري سهولة تماما. وعموما، سرعة الفحص المجهري يوفر نهجاً فريداً في تحديد حركية النقل في خريطة 3D ومستوى جزيء واحد من مسارات النقل مع فائقة عالية الدقة الزمانية المكانية للاتجار في جملة-أو داخلها-عضية الجزيئية في وقت واحد تحت ظروف معينة في نظم الخلايا الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور كريستين فرهي (جامعة ميتشيغان، أن أربور) والدكتور غريغوري بازور (كلية الطب في جامعة ماساتشوستس) لتوفير بعض والبلازميدات. وأيد المشروع المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة" (المعاهد الوطنية للصحة GM097037 و GM116204 و GM122552 إلى W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
