Summary
हाल ही में हम तीन आयामी (3 डी) विभिन्न प्रोटीन के लिए परिवहन मार्गों के स्थानिक स्थानों में translocating प्राथमिक cilia अंदर रहते कोशिकाओं में मैप. यहां इस पत्र का विवरण प्रयोगात्मक सेटअप, जैविक नमूनों की प्रक्रिया और डाटा विश्लेषण के लिए 3 डी सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग दृष्टिकोण नव लाइव प्राथमिक cilia में लागू किया ।
Abstract
प्राथमिक पपनी कई युकेरियोटिक कोशिकाओं की सतह पर एक microtubule आधारित दखल है और सेल गतिशीलता और संकेतन में महत्वपूर्ण कार्य है कि प्रोटीन का एक अनूठा पूरक शामिल हैं. चूंकि cilia अपने स्वयं के प्रोटीन synthesizing में असमर्थ हैं, लगभग २०० अद्वितीय सिलिअरी प्रोटीन की जरूरत है cytosol और प्राथमिक cilia के बीच की तस्करी । हालांकि, यह अभी भी एक तकनीकी चुनौती वर्तमान मौजूदा तकनीकों की सीमाओं के कारण लाइव प्राथमिक cilia में इन प्रोटीन के लिए परिवहन रास्ते के तीन आयामी (3d) स्थानों का नक्शा है । चुनौती को जीत के लिए, हाल ही में हम विकसित किया है और एक उच्च गति आभासी 3 डी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, के लिए परिवहन रास्ते के 3 डी स्थानिक स्थान निर्धारित करने के लिए एक बिंदु एज-उत्तेजना उप विवर्तन (गति) माइक्रोस्कोपी कार्यरत है जीवित कोशिकाओं के प्राथमिक cilia में cytosolic और झिल्ली प्रोटीन दोनों । इस अनुच्छेद में, हम गति माइक्रोस्कोपी के विस्तृत सेटअप, प्रतिदीप्ति व्यक्त कोशिकाओं की तैयारी प्रदर्शित करेगा-प्रोटीन लेबल सिलिअरी प्रोटीन, लाइव पपनी में व्यक्तिगत प्रोटीन के वास्तविक समय एकल अणु ट्रैकिंग और उपलब्धि सिलिअरी प्रोटीन के लिए परिवहन मार्गों के 3 डी स्थानिक संभावना घनत्व नक्शे के ।
Introduction
के बाद से १८७३ में अर्नस्ट अब्बे द्वारा कहा गया है, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संकल्प को लगभग २०० उद्देश्य1,2से प्रकाश विवर्तन के कारण एनएम तक ही सीमित माना गया है । वर्तमान में, सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक इस सीमा को तोड़ने और उप-विवर्तन (< २०० एनएम) संकल्प के साथ गतिशील छवियों का कब्जा करने की अनुमति । तकनीक आम तौर पर दो व्यापक श्रेणियों में गिर: प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) सूक्ष्म आधारित दृष्टिकोण है, जो उप विवर्तन रोशनी की वजह से नमूनों में fluorophores के रैखिक ऑप्टिकल प्रतिक्रिया के कारण मात्रा उत्पंन3; और photoactivated प्रकाश माइक्रोस्कोपी (पाम) और stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) आधारित सुपर संकल्प तकनीक है, जो गणितीय कार्यों का उपयोग करने के लिए fluorophores के centroids स्थानीयकृत और फिर पुनर्गठन इन centroids सुपर संकल्प छवियों4,5बनाने के लिए । वर्तमान में, अपेक्षाकृत सीधी ऑप्टिकल सेटअप, पाम और तूफान के कारण बड़े पैमाने पर केवल एक जैविक तैयारी की एक लंबी वीडियो के प्रत्येक फ्रेम में fluorophores के एक छोटे सबसेट को सक्रिय द्वारा नियोजित कर रहे हैं । इस फ्लोरोसेंट जगह के 2 डी गाऊसी फिटिंग द्वारा और अधिक सटीक स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है, वीडियो के प्रत्येक फ्रेम में फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन की बात फैल समारोह (पीएसएफ), कहा । प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल अणु के 2d स्थान तो एक इमेजिंग विमान पर आरोपित हो सकता है जैविक तैयारी1,2के एक सुपर संकल्प छवि का उत्पादन । हालांकि इन एकल अणु स्थानीयकरण, सूक्ष्मता के लिए सुपर संकल्प दृष्टिकोण निश्चित रूप से क्रांति कैसे जैविक नमूनों की इमेजिंग किया गया था, वहां अभी भी चुनौतियों से उबरने के लिए कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, तूफान और हथेली जैविक नमूनों के निर्धारण के बाद अपने सबसे अच्छे स्थानिक संकल्प को प्राप्त कर सकते हैं और इस प्रकार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की एक ऐसी ही सीमा है जो फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन, का एक स्थिर प्रतिनिधित्व पेश करते हैं । इसके अतिरिक्त, लाइव कोशिकाओं में प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के लिए उच्च स्थानिक संकल्प प्राप्त करने के लिए, नमूनों बहुत लंबे समय framerates जो प्रोटीन गतिशीलता पर कब्जा करने में असमर्थ है पर imaged किया जाना चाहिए । इसलिए इन मुख्य तकनीकी बाधाओं को दूर करना आवश्यक है ।
एक उच्च spatiotemporal संकल्प है कि तेजी से चलती प्रोटीन या जीवित कोशिकाओं में RNAs का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है प्राप्त करने के लिए, हम अपनी प्रयोगशाला में सुपर संकल्प गति माइक्रोस्कोपी विकसित की है (चित्रा 1)6,7, 8. गति माइक्रोस्कोपी में कई प्रमुख तकनीकी अग्रिमों पहले हमें सफलतापूर्वक देशी परमाणु ताकना परिसरों के माध्यम से छोटे अणुओं, प्रोटीन, mRNA और वायरस के nucleocytoplasmic परिवहन को ट्रैक करने के लिए सक्षम है (NPCs)6, 7 , 8. संक्षेप में, गति माइक्रोस्कोपी की निम्नलिखित विशेषताएं लाइव कोशिकाओं में उप माइक्रोमीटर घूर्णन रूप से सममित संरचनाओं के माध्यम से तेजी से चलती अणुओं ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, ऐसे NPCs और प्राथमिक cilia के रूप में: (1) एक झुका या एक कार्यक्षेत्र प्रदीप्ति पीएसएफ फोकल विमान में एक छोटे से विवर्तन-सीमा मात्रा के भीतर एकल अणुओं के उत्तेजना सक्षम बनाता है (चित्रा 1); (2) झुका पीएसएफ बहुत बाहर के ध्यान प्रतिदीप्ति से बचने और इस तरह संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार कर सकते हैं । (3) रोशनी पीएसएफ में 100-500 किलोवाट/सेमी2 के ऑप्टिकल घनत्व फोटॉनों के हजारों की अनुमति देता है तेजी से पता लगाने की गति के साथ एकल fluorophores से एकत्र (> ५०० हर्ट्ज) । (4) तेजी से पता लगाने की गति भी बहुत ही जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट अणुओं हिल के स्थानिक पथ का निर्धारण करने में एकल अणु स्थानिक स्थानीयकरण त्रुटि (< 10 एनएम) को कम कर देता है, क्योंकि आणविक प्रसार प्रमुख कारकों में से एक है अणु बढ़ने के लिए एकल अणु स्थानीयकरण की खामियों के कारण. (5) अच्छी तरह से 3 डी रूपांतरण एल्गोरिदम के लिए 2 डी की स्थापना की हम एनपीसी या प्राथमिक पपनी में अणुओं के लिए परिवहन मार्गों के 3d स्थानिक संभाव्यता घनत्व नक्शे प्रदान करने के लिए सक्षम । यह उल्लेखनीय है कि काटीज़ियनवादी और बेलनाकार समंवय प्रणाली के बीच हमारी रूपांतरण प्रक्रिया 3 डी एकल अणु ट्रैकिंग (चित्रा 2) के बजाय एक 3 डी स्थानिक संभावना घनत्व नक्शा उत्पंन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पहले, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा से पता चला है कि एनपीसी ने9,10 और प्राथमिक पपनी11 दोनों एक घूर्णन सममित संरचना है । सिद्धांत रूप में, बेतरतीब ढंग से बढ़ते अणुओं को एनपीसी या प्राथमिक पपनी के माध्यम से भी घूर्णन रूप से सममित वितरण होना चाहिए । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, सिलेंडर के अंदर बेतरतीब ढंग से फैलाना अणुओं की एक उच्च संख्या है कि एनपीसी में के रूप में पार अनुभाग देखने में रोटेशन सममित वितरण उत्पंन होगा, आगे एक लगभग एक समान स्थानिक में जिसके परिणामस्वरूप दो पड़ोसी के छल्ले के बीच प्रत्येक बहुत छोटे उप क्षेत्र के भीतर वितरण (चित्रा 2ई) । इस वर्दी वितरण की ओर जाता है कि बेलनाकार प्रणाली में θ आयाम के साथ स्थानिक वितरण स्थिर है । फिर 3d निर्देशांक (r, x, θ) को 2d निर्देशांक (r, x, स्थिरांक) होना सरल हो सकता है. दरअसल, काटीज़ियनवादी और बेलनाकार सिस्टम के बीच हमारी रूपांतरण प्रक्रिया 2d (x, Y) से 2d (R, x, स्थिरांक) तक है । लगातार θ,
चित्रा 2ईमें स्थानिक घनत्व पी को संदर्भित करता है, समीकरण एकका उपयोग करके की गणना की है ।
अंततः, एकल अणु ट्रैकिंग जैविक अनुसंधान में व्यापक आवेदन किया है, इस प्रकार, यह स्वाभाविक है कि तकनीक के ढेर सारे विशिष्ट जैविक niches12,13,14भरने के लिए विकसित की जाएगी । इस तरह की गति माइक्रोस्कोपी के साथ मामला है । पहले, जब एक 3 डी परिवर्तन एल्गोरिथ्म के साथ युग्मित, इस तकनीक को NPCs, एक उप विवर्तन के आकार और रोटेशन सममित जैविक संरचना6के माध्यम से पारगमन अणुओं के 3 डी परिवहन मार्गों को हल करने के लिए विकसित किया गया था । इस पत्र में प्राथमिक cilia को उत्कृष्ट मॉडल organelles के रूप में भी दिखाया गया है. प्राथमिक cilia बेलनाकार हैं, एंटीना की तरह organelles (~ १२५ एनएम त्रिज्या) कि परियोजना के सबसे स्तनधारी कोशिकाओं की सतह से15,16,17। वे बाहरी संकेतों को प्राप्त करने और एक intracellular आम तौर पर विकास और चयापचय15,16के साथ जुड़े प्रतिक्रिया संचारित करने के लिए जिंमेदार हैं । इसलिए, संरचनात्मक प्रोटीन का प्रवाह, transmembrane रिसेप्टर्स के पुनर्चक्रण, और intracellular दूतों के संचरण प्राथमिक cilia के महत्वपूर्ण जिम्मेदारियां हैं. प्राथमिक cilia और कोशिका शरीर के बीच के मोड़ पर एक महत्वपूर्ण selectivity बाधा है, संक्रमण क्षेत्र या TZ कहा जाता है, जिसके माध्यम से यह सभी प्रोटीन परिवहन होना चाहिए11,18,19, 20. TZ के गेटिंग फंक्शन के अलावा, कम से दो परिवहन प्रक्रियाओं, intraflagellar परिवहन और निष्क्रिय प्रसार, इस क्षेत्र के माध्यम से प्रोटीन की आवाजाही के लिए जिंमेदार माना जाता है16,21, 22. एक मानव स्वास्थ्य के दृष्टिकोण से, प्राथमिक cilia और बहाव संकेतन के बाद के विनियमन के नुकसान कई कैंसर की विशेषता है । इसके अलावा, कई आनुवंशिक रोगों, जैसे Bardet-Biedl सिंड्रोम और पॉलीसिस्टिक गुर्दे की बीमारी, दोषपूर्ण प्रोटीन परिवहन के साथ जुड़े रहे हैं23। दोनों उप विवर्तन सीमा आकार और TZ के माध्यम से चयनात्मक प्रोटीन परिवहन की जटिल प्रक्रिया प्राथमिक cilia इस तकनीक के लिए एक प्रमुख लक्ष्य बनाते हैं । इस तरीके कागज में, हम एक सिलिअरी transmembrane प्रोटीन, सोमेटोस्टेटिन रिसेप्टर 3 (SSTR3) के ट्रैकिंग का प्रदर्शन करेंगे24, Alexa Fluor ६४७ और IFT, IFT2025के एक घटक, एक फ्यूज GFP अणु के साथ लेबल के साथ बाह्य लेबल ।
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Protocol
1. NIH-3T3 स्टॉक से गति माइक्रोस्कोपी के लिए सेल तैयारी
- प्रयोग के अग्रिम में १.५ सप्ताह, ३७ डिग्री सेल्सियस पर गल द्वारा एक जमे हुए शेयर से NIH-3T3 कोशिकाओं की एक ताजा संस्कृति की वसूली और Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) ११० मिलीग्राम/एमएल के साथ पूरक के 3 मिलीलीटर के साथ एक 25 सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी glutamine, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
- एक 5% कं2 मशीन में ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन ।
- सेल चक्र की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए प्रायोगिक दिन से पहले कम से तीन बार, हर दो दिन के बारे में, ८०% प्रवाह में विभाजित कोशिकाओं । Trypsinize ०.२५% trypsin के साथ कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस, महाप्राण trypsin पर 2 मिनट के लिए और यह माध्यम से 2 मिलीलीटर की जगह । मध्यम बार पिपेट कक्ष क्लस्टर्स को भंग करने के लिए, कक्षों की इच्छित संख्या निकालें और वापस 3 मिलीलीटर तक मीडिया की कुल मात्रा ले ।
नोट: NIH-3T3 पहले आनुवंशिक रूप से NPHP-4 व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थे, एक प्रोटीन है कि TZ के लिए informations26, mCherry करने के लिए ग टर्मिनस पर जुड़े । mCherry एक fluorophore है जो ५६१ एनएम रोशनी के साथ उत्तेजित किया जा सकता है के लिए मात्रात्मक TZ selectivity बाधा स्थानीयकरण और प्राथमिक cilia ओरिएंट । - प्रयोग से पहले दो दिन, एक ३५ mm ग्लास नीचे डिश में प्लेट 60-70% एक ही माध्यम के १.५ मिलीलीटर के साथ चरण १.१ के रूप में प्रवाह और मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस ।
- प्रयोग से एक दिन पहले रासायनिक transfect से कोशिकाओं को वांछित प्लाज्मिड । मिश्रण ५००-१००० वांछित प्लाज्मिड के एनजी (देखें नीचे नोट ) में एक 1: अभिकर्मक एजेंट के साथ कम सीरम मीडिया के ०.२५ मिलीलीटर में 30 मिनट के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना महाप्राण मीडिया ३५ mm ग्लास बॉटम डिश से और यह जगह के साथ 2.5 अनुपात ०.२५ एमएल प्लाज्मिड/ अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण प्लस एंटीबायोटिक दवाओं के बिना कम सीरम मीडिया के एक अतिरिक्त १.२५ मिलीलीटर । कम सीरम मीडिया एक सफल अभिकर्मक को सुविधाजनक बनाने के उद्देश्य से कार्य करता है, प्राथमिक cilia विकास उत्प्रेरण, साथ ही कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए काफी प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए । अगले दिन पर प्रयोग के लिए कोशिकाओं को मशीन के लिए लौटें ।
नोट: IFT20 के एकल अणु ट्रैकिंग प्रदर्शन करते हैं, एक प्लाज्मिड एक आनुवंशिक रूप से संशोधित IFT20 अपनी ग टर्मिनस पर GFP करने के लिए शामिल कर रहे हैं25का उपयोग किया जाता है । जब एकल अणु ट्रैकिंग SSTR3, एक आनुवंशिक रूप से संशोधित SSTR3 अपने N टर्मिनस पर एक स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) डोमेन और सी के लिए GFP से जुड़े युक्त प्लाज्मिड के प्रदर्शन का प्रयोग किया जाता है22। SSTR3 निर्माण के अलावा, एक प्लाज्मिड बायोटिन ligase बिरा युक्त सह होना चाहिए और व्यक्त अभिकर्मक मीडिया 10 µ m बायोटिन के साथ पूरक होना चाहिए । बिरा तो ईआर के स्तर पर नव संश्लेषित एपी-SSTR3-GFP अणुओं के एपी डोमेन के लिए बायोटिन देते हैं । Alexa647 संयुग्मित चार बायोटिन की तीन streptavidin पर बाध्यकारी साइटों, औसत पर, तो मीडिया के लिए पूरक हो सकता है पहले इमेजिंग करने के लिए फ्लोरोसेंट-SSTR3-GFP अणुओं की बाहरी सतह पर लेबल सेल22,27 . इस विधि में GFP और AlexaFluor647 का प्रयोग किया जाता है; हालांकि, अंय फ्लोरोसेंट जांच अगर वे इसी तरह उच्च फोटो स्थिरता और क्वांटम उपज है इस्तेमाल किया जा सकता है । - यदि बाह्य-लेबल SSTR3 के निर्माण का उपयोग कर, गिलास नीचे डिश 1 एच से मीडिया प्रयोग से पहले हटा दें, सेल धो फॉस्फेट के 1 मिलीलीटर के साथ 5 बार-बफर खारा (पंजाब), और 1 µ एम Alexa647 के साथ पूरक घटाया सीरम मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें संयुग्मित streptavidin ।
- प्रयोग से पहले कोई 15 मिनट से अधिक, गिलास नीचे पकवान से मीडिया को हटा दें और transfected और लेबल कोशिकाओं 5 बार पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ धो लो ।
- इमेजिंग बफर (20 mm HEPES, ११० mm KOAc, 5 mm NaOAc, 2 mm MgOAc, 1 mm EGTA, पीएच ७.३) के ग्लास बॉटम डिश में 1 मिलीलीटर रखें ।
नोट: इमेजिंग बफ़र में, कक्षों से अब 3 h के लिए व्यवहार्य हैं । इसलिए, प्रत्येक डिश पर प्रयोगों के केवल 2 ज प्रदर्शन कर रहे हैं ।
2. स्पीड माइक्रोस्कोपी
नोट: गति माइक्रोस्कोपी सेटअप एक औंधा प्रतिदीप्ति एक १.४-NA १०० × तेल विसर्जन apochromatic उद्देश्य, एक ३५ मेगावाट ६३३ एनएम वह-Ne लेजर, ५० मेगावाट ठोस राज्य ४८८ एनएम और ५६१-एनएम पराबैंगनीकिरण, पर एक चिप गुणा लाभ से सुसज्जित शामिल है चार्ज-युग्मित-डिवाइस कैमरा और डेटा प्राप्ति और प्रसंस्करण के लिए एक माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर पैकेज (चित्र 1) । व्यक्तिगत चैनल इमेजिंग के लिए, GFP, mCherry, और Alexa647 क्रमशः ४८८ एनएम, ५६१ एनएम, या ६३३ एनएम पराबैंगनीकिरण से उत्साहित हैं । एकल अणु ट्रैकिंग के लिए, एकल बिंदु रोशनी व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट लेबल वाले अणुओं को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है । epifluorescence इमेजिंग के लिए, एक गुफा लेंस लेजर रोशनी पथ में रखा के लिए रोशनी के एक समान क्षेत्र में बीम का विस्तार है । प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एक dichroic फ़िल्टर (405/488/561/635) और एक उत्सर्जन फिल्टर (405/488/561/635) द्वारा फ़िल्टर किया गया, एक ही उद्देश्य से एकत्र कर रहे हैं, और के लिए एकल अणु ट्रैकिंग या 2 हर्ट्ज के लिए ५०० हर्ट्ज पर ऊपर सीसीडी कैमरा ऑपरेटिंग के साथ imaged epifluorescence इमेजिंग ।
- माइक्रोस्कोप के मंच के लिए कांच के नीचे प्लेट प्रत्यय और ठीक से वांछित निर्माण व्यक्त कर रही है कि एक सेल का पता लगाने । एक बार एक उपयुक्त कोशिका पाया गया है, इमेजिंग विमान है कि लेजर एकल बिंदु रोशनी से मेल खाती है पर स्थान के साथ प्राथमिक cilia के आधार पर NPHP4-mCherry स्थान संरेखित करें ।
- NPHP4-mCherry की एक epifluorescence छवि पर कब्जा और या तो IFT20-GFP या एपी SSTR3-GFP "स्नैप" समारोह का उपयोग "कैमरा" टैब "फोकस नियंत्रण" विंडो में यदि डिजिटल माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें).
नोट: इन छवियों के बाद एकल अणु स्थानों के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करेगा । - एक बार संदर्भ छवियों प्राप्त कर रहे हैं, स्थानीय रूप से एक अणु लेबल की एकाग्रता को कम । फोटो-ब्लीच 20 एस के लिए 1 मेगावाट लेजर रोशनी के साथ TZ या जब तक प्रतिदीप्ति तीव्रता पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के करीब है ।
नोट: जब सटीक एकाग्रता नियंत्रित किया जा सकता है, 0.1-1 एनएम लेबल एकल अणुओं का उपयोग किया जाता है । - एकल अणु ट्रैकिंग के लिए तैयार करने के लिए, लेजर रोशनी शक्ति को कम ~ ०.१५ मेगावाट GFP या ~ ०.५ मेगावाट Alexa647 के साथ लेबल अणुओं के लिए के साथ लेबल के लिए एक अणु के लिए ।
- जैसे ही लेजर शक्ति और इमेजिंग मापदंडों सेट कर रहे हैं, अधिकतम लाभ और गहनता और 2 एमएस फ्रेम दर, एकल अणु इमेजिंग के लिए, उपयुक्त रोशनी लेजर और रिकॉर्ड गैर photobleached संलग्न, एकल अणुओं लेबल के रूप में वे ले जाया जाता है "फोकस नियंत्रण" विंडो के "कैमरा" टैब में "स्ट्रीम" बटन पर क्लिक करके TZ के photobleached क्षेत्र के माध्यम से ।
नोट: वीडियो के 2 मिनट से अधिक नहीं एक नगण्य स्तर पर सिलिअरी बहाव के प्रभाव को कम करने के लिए कब्जा कर लिया जाना चाहिए । - एक अणु वीडियो पर कब्जा करने के बाद, इस तरह की झलक के रूप में एक 2d गाऊसी फिटिंग एल्गोरिथ्म, Gelles लैब है, जो संक्षेप में प्रत्येक एक अणु के उत्तेजना पीएसएफ के हित के क्षेत्र में एक को शामिल करने के केन्द्रक स्थानीयकरण का उपयोग कर वीडियो प्रक्रिया (AOI) ।
- परिशुद्धता < 10 एनएम के साथ सभी एकल अणु स्थानों का चयन करें और एक 2 डी गाऊसी समारोह के साथ सज्जित एकल अणु स्थानों के वितरण के आधार पर cilia के केंद्र सही ।
नोट: 3 डी परिवर्तक एल्गोरिथ्म के लिए 2d का उपयोग करके, IFT20-GFP और एपी SSTR3 मार्गों के 3 डी परिवहन मार्गों क्रमशः सिलिअरी axonemal या सिलिअरी झिल्ली पर स्पष्ट रूप से दिखाए जाते हैं ।
3 डी परिवर्तन करने के लिए 2d
- एक बार पपनी में पारगमन अणुओं (शोर अनुपात > 11 के लिए सिग्नल) के लिए कई हजार स्थानीयकरण एकत्र कर रहे हैं, X-आयाम के रूप में पपनी की लंबी धुरी का चयन करें । स्थान के Y आयाम हिस्टोग्राम बनाएं और 10 एनएम वेतन वृद्धि में बिन रकम प्राप्त करें ।
नोट: 3d रूपांतरण के लिए 2d हाथ या किसी भी सॉफ्टवेयर या प्रोग्रामिंग भाषा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । लेखक सफलतापूर्वक दोनों Matlab और पायथन २.७ में परिवर्तन लागू किया है ।
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Representative Results
यह अनुभाग Alexa647 (चित्रा 3ए) से जुड़े SSTR3 के परिवहन मार्ग का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक cilia के टीज़र पर स्पीड माइक्रोस्कोपी करने से प्राप्त डेटा को प्रदर्शित करता है । यह 3 डी रूपांतरण एल्गोरिथ्म की पुष्टि करने के दोहरे उद्देश्य से कार्य करता है । Alexa647 केवल प्राथमिक पपनी की बाहरी सतह को लेबल करना चाहिए और इसलिए, 3d परिवहन मार्ग को उस स्थान पर एक उच्च घनत्व वाले परिवहन मार्ग को प्रकट करना चाहिए. NIH-3T3 छुरा व्यक्त NPHP3-TZ पर mCherry एपी transfected-SSTR3 के साथ GFP किया जाना चाहिए और streptavidin-संयुग्मित Alexa647 के साथ ऊपर प्रोटोकॉल के अनुसार मशीन । mCherry लेबल के वाइड फील्ड इमेजिंग का उपयोग TZ को स्थानीयकृत करने के लिए किया जाता है जबकि GFP को यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि किसी कक्ष ने वांछित SSTR3 का निर्माण किया है । इसके अतिरिक्त, Alexa647 लेबल के वाइड फील्ड इमेजिंग ६३३ एनएम रोशनी का उपयोग करने की पुष्टि है कि सेल ठीक से बिरा प्लाज्मिड व्यक्त किया है और मीडिया से पर्याप्त बायोटिन अवशोषित आवश्यक है । सकारात्मक पुष्टि एक दृश्यमान पपनी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (चित्रा 3बी) से अलग की विशेषता है । streptavidin-संयुग्मित Alexa647 के साथ निर्माण एपी-SSTR3-GFP के कुशल लेबल केवल इन शर्तों के तहत हो सकता है । एक बार Alexa647 द्वारा प्राथमिक पपनी के चुनिंदा लेबलिंग की सकारात्मक पुष्टि प्राप्त किया गया है, photobleaching और एक ६३३ एनएम लेजर के साथ टीज़र के एकल बिंदु रोशनी एक अणुओं visualized किया जा करने के लिए अनुमति देगा । डेटा विश्लेषण से पहले, व्यापक क्षेत्र रोशनी पर एकल अणु वीडियो superimposing एक उपयोगी मांयता कदम (चित्रा 3सी) है । उदाहरण के लिए, यदि लेज़र ठीक से संरेखित नहीं है, तो TZ के साथ सह-स्थानीयकृत करने के लिए कोई एकल अणु दिखाई देगा । पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए एक अन्य पूर्व-डेटा विश्लेषण सत्यापन चरण एकल अणु वीडियो (चित्र 3ई) की लंबाई पर TZ पर तीव्रता की जाँच करने के लिए है. इस तरह के विश्लेषण ' साजिश जेड अक्ष प्रोफ़ाइल ' समारोह का उपयोग कर ImageJ में जल्दी से किया जा सकता है । चित्रा 3एफ में चोटियों एक संकेत के साथ TZ पर एक अणु की उपस्थिति के अनुरूप करने के लिए ~ ५.० के शोर । यह ग्राफ भी सुनिश्चित करने में सक्षम है कि पर्याप्त photobleaching एकल अणुओं की अच्छी तरह से अलग आवृत्ति द्वारा सबूत के रूप में हुई है । चित्र 3 G एक कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात < ०.५ दर्शाता है । एक स्पष्टीकरण होगा कि सीधे TZ पर लेज़र संरेखित नहीं है । एक अन्य कारण यह हो सकता है कि लेजर प्रदीप्ति शक्ति भी कम हो. दोनों स्पष्टीकरण कम उत्तेजना में परिणाम और, इसलिए, TZ पर fluorophores के कम उत्सर्जन । इन जांचों के बाद बनाया गया है, एक अणु के 2d गाऊसी फिटिंग TZ (चित्रा 3एच) में अपने पथ का उत्पादन होगा । Superimposing कई पथ TZ (चित्रा 3मैं) में ब्याज की लेबल प्रोटीन के परिवहन मार्ग का उत्पादन होगा । चूंकि 2 डी गाऊसी फिटिंग डिटेक्टर पर पिक्सेल मूल्यों से मेल खाती है, एक्स, वाई एकल अणु डेटा TZ और प्राथमिक cilia की व्यापक क्षेत्र छवि के साथ विलय किया जा सकता है और आगे ब्याज स्थानीयकरण के प्रोटीन वर्णन (चित्रा 3जंमू ).
IFT20 IFT परिसर के एक घटक है, जो प्राथमिक cilia के अंदर microtubules साथ माल वहन करती है25। Arl13b-mCherry, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सिलिअरी मार्कर प्रोटीन प्राथमिक cilia लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था19. वाइड क्षेत्र महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दोनों Arl13b-mCherry और IFT20-GFP व्यक्त प्राथमिक पपनी छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था और फिर IFT20 के एक पूर्व GFP के बाद प्राथमिक cilia में व्यक्तिगत photobleaching-GFP प्रोटीन को ट्रैक करने के लिए माइक्रोस्कोपी की गति के लिए बंद गति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4A-4c) के रोशन क्षेत्र में एकल-अणु स्तर तक नीचे प्रतिदीप्ति.
अंतत:, सैकड़ों एकल-अणु IFT20-GFP स्थानों की एक व्यवस्थित स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ < 16 एनएम की प्राथमिक पपनी से प्राप्त किया जा सकता है एक जीवित सेल (चित्रा 4डी) । हमारे अनुकरण के अनुसार, ९५ एनएम के एक त्रिज्या के साथ २५० एकल अणु स्थानों के लिए एक विश्वसनीय 3 डी परिवहन मार्ग (चित्रा 5) उत्पंन करने के लिए पर्याप्त था । IFT20-GFP परिवहन मार्ग का अंतिम निर्धारण दस cilia (चित्रा 4ई) से एकत्र किए गए हजारों एकल-अणु IFT20-GFP स्थानों पर आधारित है । चूंकि प्राथमिक cilia घूर्णन समरूपता के साथ एक संरचना के अधिकारी, 3 डी रूपांतरण एल्गोरिथ्म के लिए 2d अनुमानित डेटा 2d करने के लिए लागू किया गया था । दिलचस्प है, 3 डी स्थानिक संभाव्यता IFT20 के घनत्व नक्शे संकेत दिया है कि केवल एक उच्च घनत्व के साथ एक क्षेत्र ~ ६० एनएम चौड़ाई प्राथमिक cilia (चित्रा 4) के दायरे के साथ ~ ९५ एनएम पर नुकीला । इस उच्च घनत्व क्षेत्र की संभावना सह axonemal microtubules के साथ स्थानीयकरण, IFT मार्ग के ज्ञात स्थान के साथ समझौते में (चित्रा 4एफ) ।
चित्र 1 . गति माइक्रोस्कोपी के सरलीकृत योजनाबद्ध. एक ऊर्ध्वाधर (पथ 1) या एक झुका (पथ 2) बिंदु फैल समारोह के लिए फोकल विमान में एकल fluorophore अणुओं रोशन किया जाता है । "डी" ऊर्ध्वाधर रोशनी लेजर बीम जो उद्देश्य और कोण रोशनी जो उद्देश्य के किनारे पर रोशनी लेजर ध्यान केंद्रित द्वारा हासिल की है के केंद्र के माध्यम से गुजरता के बीच की दूरी को संदर्भित करता है । दो या अधिक पराबैंगनीकिरण एक ऑप्टिकल हेलिकॉप्टर द्वारा विनियमित करने के लिए एक पर बंद उत्तेजना मोड के लिए एक ही अणुओं को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है एनपीसी ने या प्राथमिक पपनी के माध्यम से पारगमन । बंद समय से कम दस गुना है लक्षित अणुओं पर fluorophore लेबल के photobleaching समय से अधिक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . 3 डी रूपांतरण की प्रक्रिया के लिए 2 डी का चित्रमय प्रदर्शन । योजनाबद्ध, उदाहरण के लिए, यदि वे केंद्रीय लुमेन (ए-एफ) या एक परिधीय क्षेत्र (जी एल) के भीतर फैलाना एक ट्यूब के अणुओं के लिए 3 डी परिवर्तन एल्गोरिथ्म के लिए 2d प्रदर्शित करता है । (एक) एक ट्यूब के अंदर बेतरतीब ढंग से फैलाना अणुओं के आदर्श 3 डी स्थानिक स्थानों एक बेलनाकार समंवय प्रणाली (आर, एक्स, θ) में समंवित किया जा सकता है । गति में, केवल 3 डी घनत्व नक्शा अंततः 2d स्थानिक स्थानों से गणना की है । हालांकि, यह एक आदर्श मामले को वर्णन है कि 3 डी घनत्व नक्शा बराबर है कि 2d या 3 डी स्थानिक स्थानों जाना जाता है । (ख) एक में 3 डी आणविक स्थानों एक काटीज़ियनवादी समंवय प्रणाली में एक 2d विमान पर पेश कर रहे है (एक्स, वाई, जेड) माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा । (ग) एक साथ एक साथ एक्स आयाम में सिलेंडर से एक बहुत पतले स्लाइस (Δx) कट । (घ) सी में दिखाए गए स्लाइस में 3d स्थानिक स्थानों को एक संकीर्ण 2d क्षेत्र के भीतर पेश किया जा सकता है । (ङ) सी में दर्शाए गए पतले स्लाइस में सभी स्थानों का क्रास-सेक्शन व्यू इन स्थानों को गाढ़ा छल्ले के बीच उप क्षेत्रों में वर्गीकृत किया जा सकता है । उच्च संख्या को देखते हुए सिलेंडर में बेतरतीब ढंग से वितरित अणुओं और कटौती बहुत पतली टुकड़ा, स्थानों के स्थानिक घनत्व (पीमैं) प्रत्येक उप क्षेत्र में दो पड़ोसी के छल्ले के बीच (Si) रोटेशन सममित और वर्दी होगा । इन स्थानों आगे डी में Y आयाम के साथ पेश किया जा सकता है । यदि Y आयाम वाले स्थान j स्तंभों वाले हिस्टोग्राम में संकुलित हैं. प्रत्येक स्तंभ (अज) में स्थानों की कुल संख्या के बराबर है, जो कि (F) में दिखाए गए के रूप में प्रयोग रूप से मापी जा सकती है । 
(G-L) इसके बाद के संस्करण के रूप में इसी तरह, परिवर्तन की प्रक्रिया एक ट्यूब के एक परिधीय क्षेत्र के भीतर फैलाना अणुओं के लिए प्रस्तुत किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . 3 डी SSTR3 के लिए परिवहन मार्ग के स्थानिक स्थान लाइव प्राथमिक cilia गति माइक्रोस्कोपी द्वारा मैप पर. (क) NPHP4-mCherry द्वारा चिह्नित TZ के माध्यम से GFP-tagged SSTR3 की ट्रैकिंग के लिए लागू किया जा रहा गति माइक्रोस्कोपी का ग्राफ़िकल प्रस्तुतिकरण. (ख) NPHP4 की Epifluorescence छवि-mCherry (लाल), एपी-SSTR3-GFP (हरा), Alexa647 बाह्य लेबल एपी-SSTR3-GFP (सफेद), और अंतिम विलय छवि के लिए इस्तेमाल किया । स्केल बार: 2 µm. (ग) एक Alexa ६४७ की ट्रैकिंग-लेबल एपी SSTR3-GFP (सफेद) कि चार फ्रेम (2 ms/फ्रेम के लिए बिंदु रोशनी क्षेत्र के माध्यम से गुजरता है) । स्केल बार: 2 µm. (D) एकल अणु पथ (सफेद) से (C) आरोपित की epifluorescence छवि पर NPHP4-mCherry (लाल) और एपी-SSTR3-GFP (हरा). स्केल बार: 2 µm. (ई) सफेद डैश्ड स्क्वायर पर एक बिंदु रोशन के क्षेत्र पर प्रकाश डाला TZ पर केंद्रित । स्केल बार: 2 µm. (च) फोटॉन गिनती बनाम एक एक अणु वीडियो के लिए फ्रेम संख्या ग्राफ शोर अनुपात के लिए एक उच्च संकेत के साथ पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति द्वारा विभाजित एकल अणु की अधिकतम प्रतिदीप्ति विभाजित द्वारा निर्धारित । (छ) फोटॉन गणना बनाम शोर अनुपात के लिए एक कम संकेत के साथ एक अणु वीडियो के लिए फ्रेम संख्या ग्राफ । (ज) से पथ (ई) और (घ) 2d गाऊसी फिटिंग और आरोपित के एक सटीक चित्रमय प्रतिनिधित्व पर भी 2d गाऊसी फिटिंग द्वारा स्थानीयकृत द्वारा प्रत्येक फ्रेम में स्थानीयकृत । 2 डी गाऊसी फिटिंग प्रक्रिया ब्याज के एक क्षेत्र (AOI) एक अणु की पीएसएफ को शामिल की तीव्रता प्रोफाइल के एक्स और वाई आयामों को एक गाऊसी समारोह में फिट बैठता है. (I) 2 डी सुपर संकल्प २२० व्यक्तिगत Alexa Fluor ६४७ के स्थानिक वितरण-लेबल एपी-SSTR3-GFP एक प्राथमिक पपनी से एकत्र स्थानों । (ञ) सुपर-रिज़ॉल्यूशन एकल अणु स्थानों से (I) आरोपित की epifluorescence छवि पर NPHP4-mCherry (लाल) और एपी-SSTR3-GFP (हरा). स्केल बार: 2 µm. (K) एक 2d द्वारा 3d रूपांतरण एल्गोरिथ्म, Alexa Fluor ६४७ के स्थानिक संभाव्यता घनत्व वितरण-आर आयाम के साथ प्राथमिक cilia पर एपी-SSTR3-GFP-लेबल प्राप्त किया गया था । गाऊसी समारोह फिटिंग, Alexa Fluor ६४७-लेबल पर आधारित एपी SSTR3-GFP मुख्य रूप से सिलिअरी झिल्ली पर एक पूर्ण चौड़ाई के साथ 131 ± 3 एनएम के एक त्रिज्या पर स्थित 24 ± 1 एनएम के आधे अधिकतम (FWHM) । (एल) के स्थानिक संभाव्यता घनत्व वितरण के पार अनुभाग देखें (ग्रीन बादल) Alexa Fluor ६४७-लेबल एपी-SSTR3-GFP प्राथमिक cilia पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . 3 डी IFT20 के लिए परिवहन मार्ग के स्थानिक स्थान के अंदर लाइव प्राथमिक cilia गति माइक्रोस्कोपी द्वारा मैप. (A-C) Arl13b की प्रतिनिधि छवि-mCherry (क) और IFT20-GFP (ख) एक NIH3T3 सेल में सह-व्यक्त और विलय (ग) । वृत्त (सियान) एक प्राथमिक पपनी पर गति माइक्रोस्कोपी के एकल बिंदु रोशनी के स्थान को इंगित करता है एक सेल के पक्ष (सफेद डैश्ड लाइनें) जिनके किनारों IFT20 द्वारा निर्धारित कर रहे हैं पर बढ़ी-कोशिका शरीर और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी में GFP प्रतिदीप्ति (नहीं दिखाया गया है) । स्केल बार: 10 µm. (घ) 2 डी सुपर संकल्प २८६ व्यक्तिगत IFT20-GFP एक ही प्राथमिक पपनी से एकत्र स्थानों के स्थानिक वितरण । (ङ) एक 2d द्वारा 3 डी रूपांतरण एल्गोरिथ्म के लिए, आर आयाम के साथ प्राथमिक cilia अंदर IFT20-GFP के स्थानिक संभाव्यता घनत्व वितरण प्राप्त की है । गाऊसी समारोह फिटिंग के आधार पर, IFT20-GFP मुख्य रूप से 95 ± 1 एनएम के एक त्रिज्या पर एक पूर्ण चौड़ाई 56 ± 5 एनएम के आधे अधिकतम (FWHM) के साथ पता लगाने । (च) स्थानिक संभाव्यता घनत्व वितरण (हरे बादलों) के पार धारा दृश्य प्राथमिक cilia में IFT20-GFP, में योजनाबद्ध के साथ मढ़ा ज. स्केल बार: १०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 . सिमुलेशन 2d एक 3 डी परिवर्तन एल्गोरिदम के लिए एक विश्वसनीय 3d स्थानिक संभाव्यता घनत्व नक्शा उत्पन्न करने के लिए 2 डी एकल अणु स्थानों की न्यूनतम संख्या का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. (क) १०० अभिकलन-एकल अणु स्थानों बेतरतीब ढंग से एक रेडियल घनत्व सामांय ९५ एनएम पर केंद्रित वितरण से नमूना उत्पंन (IFT20 के प्राथमिक परिवहन मार्ग हमारे प्रयोगों में निर्धारित करने के लिए इसी) । 16 एनएम के स्थानीयकरण परिशुद्धता σ = 16 एनएम के साथ एक सामांय वितरण से नमूना द्वारा प्रत्येक एकल अणु स्थान के लिए अनुकरणीय है । के रूप में चित्रा 2सीमें दिखाया गया है, x आयाम में एक बहुत पतली स्लाइस (Δx) परिवर्तन एल्गोरिदम के लिए प्रयोग किया जाता है और इसलिए एक्स आयाम गणना जनित 2 डी एकल अणु स्थानों में नहीं दिखाया गया है । (ख) वाई के बीच परिवर्तन आयामी परियोजना डेटा और 3 डी आर आयामी घनत्व पांच अलग नकली डेटा सेट के लिए 3 डी आर आयामी घनत्व के हिस्टोग्राम उत्पन्न (प्रत्येक १०० अंक के साथ). इसके बाद के संस्करण की संख्या चरम स्थिति ± फिटिंग त्रुटि है । (सी-डी) सिमुलेशन २५० एकल अणु स्थानों पर आधारित परिणाम । (E-F) सिमुलेशन ५०० एकल अणु स्थानों पर आधारित परिणाम । (G-I) औसत 3d घनत्व हिस्टोग्राम १००-, २५०-और ५०० अंक सिमुलेशन क्रमशः । त्रुटि पट्टियां हिस्टोग्राम बिन ऊंचाइयों में परिवर्तनशीलता का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि चोटी के ऊपर की संख्या औसत पीक स्थिति ± मानक विचलन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल प्राथमिक पपनी, एक सेलुलर संकेत organelle है कि कुशल प्रोटीन परिवहन पर अत्यधिक निर्भर है की गति माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णन । गति माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट-लेबल अणुओं के लिए उच्च संकल्प (< 10 एनएम) स्थान प्रदान कर सकते हैं क्योंकि वे टीज़र पर केंद्रित एकल बिंदु रोशनी के माध्यम से गुजरते हैं । पहले यह एनपीसी ने6,7,8के माध्यम से प्रोटीन की तस्करी का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । हालांकि, यह किसी भी उप विवर्तन सेलुलर गुहा के माध्यम से अध्ययन की तस्करी के लिए बढ़ाया जा सकता है । इस तकनीक में अंय उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीक पर एक फायदा यह है कि यह लाइव सेल सिस्टम में एकल प्रोटीन परिवहन की गतिशीलता पर कब्जा करने में सक्षम है < 10 एनएम और < 2 ms, क्रमशः के एक स्थानिक और लौकिक संकल्प पर । एक और लाभ यह है कि एक ही फ्लोरोसेंट-लेबल ब्याज की एक प्रोटीन और अभिकर्मक, प्रोटीन स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक आम आणविक जीव विज्ञान दृष्टिकोण के माध्यम से निर्माण एक्सप्रेस, गति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन शुरू करने के लिए होगा । एक ध्यान में रखना चाहिए कि एक उच्च शक्ति लेजर के साथ एक बिंदु रोशनी की सुविधा है कि अच्छी तरह से अलग, उच्च संकल्प एकल अणु स्थानों प्रदान करता है । हालांकि, यह भी रोशनी क्षेत्र सीमा और व्यापक क्षेत्र स्थानीयकरण के लिए उपयुक्त नहीं तकनीक बनाता है । सौभाग्य से, वहां जांचकर्ताओं के लिए कई व्यापक क्षेत्र सुपर संकल्प तकनीक के लिए अगर वांछित से चुन रहे हैं । एक और बात पर विचार करना है कि गति माइक्रोस्कोपी केवल एक अणु चलती के स्थानों पर कब्जा । इसलिए, FRAP के साथ संयोजन है, जो कुल अणुओं है कि मोबाइल के अंश निर्धारित कर सकते हैं, विश्लेषण के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त हो सकता है ।
काटीज़ियनवादी और बेलनाकार समन्वय प्रणाली के बीच रूपांतरण की प्रक्रिया 3 डी एकल अणु ट्रैकिंग पर आधारित एक 3 डी देखने के बजाय एक आभासी 3 डी संभाव्यता घनत्व नक्शा उत्पन्न करने के लिए है । विस्तार में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा से पता चला है कि प्राथमिक cilia एक घूर्णन सममित संरचना है जो कुछ त्रिज्या के साथ एक समान अणु वितरण उत्पंन कर सकता है । इस वर्दी वितरण की ओर जाता है कि बेलनाकार प्रणाली में θ आयाम के साथ स्थानिक वितरण स्थिर है । फिर 3d निर्देशांक (r, x, θ) को 2d निर्देशांक (r, x, स्थिरांक) होना सरल हो सकता है. दरअसल, काटीज़ियनवादी और बेलनाकार सिस्टम के बीच हमारे रूपांतरण की प्रक्रिया 2d (x, Y) से 2d (R, x, स्थिरांक) तक है । लगातार θ, स्थानिक घनत्व पीको संदर्भित करता है, समीकरण एक(
चित्रा 2) का उपयोग करके गणना की है । एक मैट्रिक्स कैलकुलेटर का प्रयोग करें वेक्टर की गणना करने के लिए, जो पार धारा 
दृश्य6में पड़ोसी गाढ़ा छल्ले के बीच रिश्तेदार क्षेत्रों के साथ मेल खाती है,7एजे स्थिति जंमू में कुल संपर्क साइटों एस प्रयोगों से सीधे मापा; इस प्रकार, पीमैं, आरमैंमें बातचीत साइटों की स्थानिक संभावना घनत्व, मैट्रिक्स समीकरण को सुलझाने के द्वारा गणना की जा सकती है एक।
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम के संदर्भ छवि अधिग्रहण और एकल अणु वीडियो के बीच माइक्रोस्कोपी सेटअप के किसी भी गड़बड़ी को कम करने के लिए है । यदि कोई भी आंदोलन होता है, तो यह संभव नहीं है कि epifluorescence इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त किए गए प्राथमिक cilia के ultrastructure को आत्मविश्वास से एकल अणु स्थानों को मैप किया जाए. एक अंय आवश्यक कदम के लिए पर्याप्त रोशनी के क्षेत्र photobleach को स्थानीय रूप से फ्लोरोसेंट की एकाग्रता कम एक अणुओं पर इतना नहीं है कि जनसंख्या पूरी तरह से photobleached है । SSTR3 के मामले में, प्रसार गुणांक घुलनशील अणुओं की तुलना में धीमी है और photobleached क्षेत्र में वापस संयुक्त राष्ट्र photobleached SSTR3 अणुओं की आबादी के आंदोलन के दो मिनट से अधिक समय तक हो जाएगा, जो परे सिलिअरी बहाव एक गैर नगण्य कारक है । यदि photobleaching के उचित स्तर पर पाने के लिए मुश्किल है और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के एक उच्च स्तर अभी भी मौजूद है, एक angled रोशनी लेजर के लिए फ्लोरोसेंट एक अणुओं है कि ऊपर और नीचे उत्साहित है लेबल की राशि को कम किया जा सकता है इमेजिंग विमान । यह पृष्ठभूमि को कम करने और प्रत्येक कब्जा एकल अणु के लिए संकेत करने के लिए शोर अनुपात में सुधार होगा.
सारांश में, गति माइक्रोस्कोपी आसानी से एक लेजर रोशनी स्रोत के अलावा द्वारा पारंपरिक माइक्रोस्कोपी setups पर लागू किया जा करने में सक्षम है, जुड़े दर्पण, और उच्च गति सीसीडी कैमरा । अंय इसी तरह की तकनीक पर मुख्य उंनति झुका लेजर जो बहुत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और 2d को कम कर देता है-3 डी परिवर्तन एल्गोरिथ्म जो 2d एकल अणु से 3 डी स्थानिक संभावना घनत्व नक्शे को खंगाला जाता है स्थानों. एक जैविक दृष्टिकोण से, ब्याज की एक fluorophore-संयुग्मित प्रोटीन के अलावा कोई अतिरिक्त लेबल की जरूरत है । इन सुविधाओं को गति माइक्रोस्कोपी उच्च spatiotemporal (5-10 एनएम, 0.4-2 एमएस) संकल्प के साथ एक उप के माध्यम से वे यातायात-माइक्रोमीटर जैव गुहा या घूर्णन सममित संरचनाओं के साथ जैव चैनल के साथ एक अणु को ट्रैक करने की अनुमति । एक 3 डी संभाव्यता घनत्व परिवर्तन एल्गोरिथ्म के साथ युग्मित, टैग प्रोटीन के 3 डी परिवहन मार्गों गुहा या चैनल के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है । इस तकनीक का आवेदन पहले एनपीसी के माध्यम से प्रोटीन और RNAs के 3 डी परिवहन मार्गों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और, यहां, हम बताते है कि एक transmembrane प्रोटीन के 3 डी परिवहन, SSTR3, और एक cytosolic प्रोटीन, IFT20, के TZ में प्राप्त किया जा सकता है प्राथमिक cilia. ऐसे 3 डी के रूप में अंय सुपर संकल्प तकनीक, तूफान, एक अणु के लिए एक्स, वाई, जेड पदों प्राप्त किया है ऑप्टिकल पथ में एक बेलनाकार लेंस रखकर जो एकल अणु पीएसएफ के ऊपर या नीचे अपनी स्थिति पर निर्भर करता है की एक विषम विकृति बनाता है फोकल विमान28। एक अंय अग्रिम के लिए आभासी pinhole प्रौद्योगिकी को लागू करने के लिए उत्सर्जन पीएसएफ की चौड़ाई कम करने और इस तरह आगे भी संकल्प बढ़ाने का प्रयास कर सकते हैं । इसके बाद के संस्करण तकनीक काफी आसानी से माइक्रोस्कोपी गति पर लागू किया जा सकता है । कुल मिलाकर, गति माइक्रोस्कोपी एक साथ एकल-अणु स्तर पर परिवहन कैनेटीक्स निर्धारित करने में एक अनूठा दृष्टिकोण प्रदान करता है और इंटर या इंट्रा-organelle आणविक तस्करी के लिए सुपर उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ परिवहन रास्ते के 3 डी मानचित्र लाइव सेल सिस्टम में कुछ परिस्थितियों के तहत ।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।
Acknowledgments
हम डॉ िईद्भस्टेन Verhey (मिशिगन विश्वविद्यालय, एन आर्बर) और डॉ ग्रेगरी Pazour (मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल के विश्वविद्यालय) कुछ plasmids प्रदान करने के लिए धंयवाद । इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH GM097037, GM116204 और GM122552 W.Y.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
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