Summary
Nylig kartlagt vi tredimensjonale (3D) romlige plasseringen av transportveier for ulike proteiner translocating inne primære flimmerhårene i lever celler. Her live denne papir detaljer eksperimentelle oppsett, prosessen med biologiske prøver og data-analyser for 3D super-oppløsning fluorescens imaging tilnærming nylig brukt i primære flimmerhårene.
Abstract
Den primære Flimmerhår er en microtubule-baserte protrusion på overflaten av mange eukaryote celler og inneholder et unikt tilbud av proteiner som fungerer kritisk i cellen motilitet og signalering. Siden flimmerhårene er i stand til å syntetisere sin egen protein, må nesten 200 unike ciliary proteiner være trafikkerte mellom stoffer og primære flimmerhårene. Men det er fortsatt en teknisk utfordring å kartlegge tredimensjonale (3D) steder av transport for disse proteinene i live primære flimmerhårene på grunn av begrensningene av aktuelle eksisterende teknikker. For å erobre utfordringen, har nylig vi utviklet og ansatt en høyhastighets virtuelle 3D super-oppløsning mikroskopi, kalt ett-punkts kanten-eksitasjon sub Diffraksjon (hastighet) mikroskopi, for å finne transport trasé for 3D romlige hvor begge cytosolic og membran proteiner i primære flimmerhårene levende celler. I denne artikkelen vil vi vise detaljert oppsett av hastighet mikroskopi, utarbeidelse av celler som uttrykker fluorescens-protein-merket ciliary proteiner, enkelt-molekylet sanntidssporing av personlige proteiner i live Flimmerhår og prestasjoner 3D romlige sannsynlighet tetthet kart av transportveier for ciliary proteiner.
Introduction
Siden oppgitt av Ernst Abbe i 1873, har oppløsningen av konvensjonelle * lys vært antatt å være begrenset til ca 200 nm på grunn av lys Diffraksjon fra objektive1,2. Foreløpig super-oppløsning * lys teknikker bryte denne begrensningen og tillate fangst av dynamiske bilder med sub Diffraksjon (< 200 nm) oppløsning. Teknikkene generelt faller inn i to hovedkategorier: stimulert utslipp nedbryting (STED) mikroskopi basert tilnærminger, som genererer sub Diffraksjon belysning volum på grunn av lineære optisk reaksjon av fluorophores i prøver3; og photoactivated * lys (PALM) og Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)-basert super-oppløsning teknikker, som bruker matematiske funksjoner for å lokalisere centroids av fluorophores og deretter gjeninnføre disse centroids til super-oppløsning bilder4,5. For tiden, på grunn av relativt ukomplisert optisk stilling, er PALM og STORM mye ansatt av bare en undergruppe av fluorophores i hvert en lang video av en biologisk forberedelse. Dette gir mer nøyaktig lokalisering av 2D Gaussian montering av lysrør stedet, kalt funksjonen Poenget spredning (PSF), fluorescently-merket proteiner i rammene av videoen. 2D plasseringen av hver fluorescently-merket molekyl kan deretter bli oppå et enkelt tenkelig fly å produsere en super-oppløsning bildet av biologiske forberedelse1,2. Mens disse single-molekylet lokalisering, super-oppløsning tilnærminger til mikroskopi sikkert revolusjonert hvordan avbilding av biologiske prøver ble utført, det er fortsatt utfordringer å overvinne. For eksempel kan STORM og PALM oppnå sine beste romlig oppløsning etter fiksering av biologiske prøver og dermed presentere en statisk fremstilling av fluorescently-merket proteiner, som er en lignende begrensning av elektronmikroskop. I tillegg for å oppnå høy romlig oppløsning for hver fluorescently-merket protein i lever celler, må prøver avbildes på svært lang framerates som ikke kan fange protein dynamics. Derfor er det nødvendig å overvinne disse viktigste tekniske hindrene.
For å oppnå en høy spatiotemporal oppløsning som er velegnet for å oppdage raske proteiner eller RNAs i levende celler, har vi utviklet super-oppløsning mikroskopi hastighet i vårt laboratorium (figur 1)6,7, 8. flere store tekniske fremskritt i hastighet mikroskopi tidligere har aktivert oss å spore nucleocytoplasmic transport av små molekyler, proteiner, mRNA og virus igjennom innfødt kjernefysiske pore komplekser (NPC)6, 7 , 8. kort, følgende funksjoner i hastighet mikroskopi brukes til å spore raske makromolekyler gjennom sub mikrometer rotasjons symmetrisk strukturer i levende celler, for eksempel NPCer og primære flimmerhårene: (1) en tilbøyelig eller vertikal belysning PSF gjør magnetisering av enkelt molekyler innenfor et lite Diffraksjon limit volum i fokalplanet (figur 1). (2) tilbøyelig PSF kan unngå sterkt ut-av-fokus fluorescens og dermed forbedre signal-til-støy-forhold. (3) optisk tetthet på 100-500 kW / cm2 i belysning PSF lar tusenvis av fotoner inn fra enkelt fluorophores med rask oppdagelsen hastigheter (> 500 Hz). (4) rask oppdagelsen hastighet også reduserer single-molekylet romlige lokalisering feilen (< 10 nm) å bestemme romlige baner av flytte fluorescerende molekyler i levende celler, fordi Diffusjon er en av viktigste faktorene forårsaker feil av enkelt-molekylet lokalisering for å flytte molekyler. (5) well-established 2D til 3D transformasjon algoritmer gir oss å gi 3D romlige sannsynlighet tetthet kart av transportveier for molekyler i NPC eller den primære Flimmerhår. Det er bemerkelsesverdig at våre konverteringen mellom det kartesiske og sylindriske koordinering systemet brukes til å generere en 3D romlige sannsynlighet tetthet kart i stedet for 3D single-molekylet sporing (figur 2). Tidligere har elektronmikroskop data avdekket at NPC9,10 og primære Flimmerhår11 begge har en rotasjons symmetrisk struktur. I prinsippet bør tilfeldig spre molekyler flytte gjennom NPC eller primære Flimmerhår også ha rotasjons symmetrisk distribusjoner. Som vist i figur 2, et høyt antall tilfeldig spre molekyler inne i sylinderen vil generere rotasjons symmetrisk distribusjoner på tverrsnittvisningen som i NPC, ytterligere resulterer i en ca uniform romlige distribusjon i hver liten sub region mellom to nabokommunene ringene (figur 2E). Denne jevn fordeling fører at den romlige fordelingen langs θ dimensjon i sylindriske systemet er konstant. Deretter kan 3D-koordinatene (R, X, θ) forenkles skal 2D-koordinater (R, X, konstant). Egentlig er vår konverteringen mellom det kartesiske og sylindriske systemer fra 2D (X, Y) til 2D (R, X, konstant). Den konstant θ, refererer til de romlige tetthet p i figur 2E, beregnes ved hjelp av ligning A
.
Til slutt, enkelt-molekylet sporing har bred anvendelse i biologiske, dermed er det naturlig at en mengde teknikker vil bli utviklet for å fylle spesifikke biologiske nisjer12,13,14. Slik er tilfellet med hastighet mikroskopi. Tidligere, når kombinert med en 3D transformasjon algoritme, denne teknikken ble utviklet for å løse 3D transport ruter av transitt molekyler gjennom NPCer, en sub-diffraction-størrelse og rotasjons symmetrisk biologiske struktur6. I dette papiret vist primære flimmerhårene å være utmerket modell organeller også. Primære flimmerhårene er sylindrisk, antenne-lignende organelles (~ 125 nm radius) at prosjektet fra overflaten av mest pattedyr celler15,16,17. De er ansvarlig for å motta eksterne signaler og oversender en intracellulær respons vanligvis assosiert med vekst og metabolisme15,16. Derfor flux strukturelle proteiner, resirkulering av transmembrane reseptorer, og overføring av intracellulær budbringere er viktig ansvar primære flimmerhårene. Tidspunktet mellom primære flimmerhårene og celle kroppen er en kritisk selektivitet barriere, kalt overgang sone eller TZ, som alle denne protein transporten må være11,18,19, 20. I tillegg til TZ gating funksjon antas minst to transport prosesser, intraflagellar transport og passiv diffusjon, å være ansvarlig for flytting av protein gjennom denne regionen16,21, 22. fra en helse-synspunkt, tap av primære flimmerhårene og påfølgende dereguleringen nedstrøms signalnettverk er karakteristisk for mange kreft. I tillegg er mange genetiske sykdommer, som Bardet-Biedl syndrom og polycystic nyresykdom, forbundet med defekt protein transport23. Både sub Diffraksjon grensen størrelse og den komplekse prosessen med selektiv protein transport gjennom til TZ gjør primære flimmerhårene en ettertraktet mål for denne teknikken. I denne metoder papir, vil vi vise sporing av en ciliary transmembrane protein, somatostatin reseptor 3 (SSTR3)24, merket eksternt med Alexa Fluor 647 og en del av IFT, IFT2025, merket med et smeltet GFP molekyl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NIH-3T3 celle forberedelse til hastighet mikroskopi fra lager
- 1,5 uker før eksperimentet, gjenopprette en fersk kultur NIH-3T3 celler fra en frossen lager ved tining på 37 ° C og overføre cellene til en 25 cm2 celle kultur kolbe med 3 mL av Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 110 mg/mL natrium pyruvate, 2 mM glutamin, 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin/streptomycin.
- Inkuber cellene på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Dele cellene på 80% confluency, om annenhver dag, minst tre ganger før eksperimentelle dag å sikre ensartethet innen celle syklus. Trypsinize celler med 0,25% trypsin i 2 minutter på 37 ° C, Sug opp trypsin og erstatte den med 2 mL medium. Pipetter medium å bryte opp cellen klynger, fjerne ønsket antall celler og tar totale volumet av media tilbake opptil 3 mL.
Merk: NIH-3T3 var tidligere genetisk konstruert for å uttrykke NPHP-4, et protein som regionaliserer til TZ26, smeltet endestasjonen C til mCherry. mCherry er en fluorophore som kan være glade med 561 nm belysning kvantitativt lokalisere TZ selektivitet barrieren og orientere primære flimmerhårene. - To dager før eksperimentet plate cellene i en 35 mm glass bunnen rett på 60-70% confluency med 1,5 mL av samme medium som skritt 1.1 og tilbake cellene til inkubator.
- En dag før eksperimentet, kjemisk transfect cellene med den ønskede plasmider. Bland 500-1000 ng av den ønskede plasmider (se Note nedenfor) i et 1:2.5 forhold med transfection reagensen i 0,25 mL redusert serum media uten antibiotika for 30 min. leveringstanken medier fra 35 mm glass bottom rett og erstatte den med 0,25 mL plasmider / Hva reagens blanding pluss en ekstra 1,25 mL redusert serum media uten antibiotika. Redusert serum media tjener formålet tilrettelegge en vellykket transfection, inducing primære flimmerhårene vekst, samt å holde cellene i live lenge nok til å utføre eksperimentet. Tilbake celler til inkubator for eksperimentet dagen.
Merk: Når du utfører én-molekylet sporing av IFT20, en plasmider inneholder en genetisk endret IFT20 smeltet ved endestasjonen sin C til GFP er brukt25. Når du utfører én-molekylet sporing av SSTR3, en plasmider inneholder en genetisk endret SSTR3 smeltet ved endestasjonen sin N en acceptor peptid (AP) domene og C-terminus til GFP er brukt22. SSTR3-konstruere en plasmider inneholder biotin ligase BirA må uttrykkes co og hva media må suppleres med 10 µM biotin. BirA legger deretter biotin AP domenet nylig syntetisert AP-SSTR3-GFP molekyler på nivå med ER. Alexa647 konjugert til tre av de fire biotin bindende områdene på streptavidin, i gjennomsnitt kan deretter bli supplert til media før imaging fluorescently etiketten AP-SSTR3-GFP-molekyler på den ytre overflaten av den cellen22,27 . GFP og AlexaFluor647 brukes i denne metoden. andre fluorescerende sonder kan imidlertid brukes hvis de har tilsvarende høy bilde-stabilitet og quantum gi. - Hvis bruker den eksternt-merket SSTR3 konstruksjonen, Fjern media fra glass bunnen rett 1t før eksperimentet, vaske cellen 5 ganger med 1 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS) og legge 1 mL av redusert serum media supplert med 1 µM Alexa647 konjugert streptavidin.
- Ikke mer enn 15 min før eksperimentet, fjerne media fra glass bunnen rett og vask transfekterte og merket cellene 5 ganger med 1 mL av PBS.
- Sted 1 mL av tenkelig buffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) i glass bunnen rett.
Merk: I tenkelig buffer, cellene er levedyktig lenger enn 3 h. Derfor utføres bare 2t eksperimenter på hver rett.
2. fart mikroskopi
Merk: SPEED mikroskopi oppsettet inkluderer en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med en 1.4-NA 100 × oljeneddyp apochromatic målsetting, en 35 mW 633 nm han-Ne laser, 50 mW fast 488-nm og 561-nm lasere, en på prosessoren multiplikasjon gevinst kostnad-sammen-enhet kamera og en mikroskop programvarepakke for datainnsamling og behandling (figur 1). For individuell kanal bildebehandling, GFP, mCherry og Alexa647 er begeistret av 488 nm, 561 nm eller 633 nm lasere, henholdsvis. For ett molekyl sporing brukes enkeltpunkt belysning til å spore fluorescently-merket molekyler. For epifluorescence avbildning plasseres en konkav linse i laser belysning banen å utvide strålen i en enhetlig felt av belysning. Fluorescens utslippene er samlet inn av samme mål, filtrert av en dichroic (405/488/561/635) og et utslipp filter (405/488/561/635) og fotografert med over CCD kamera drift ved 500 Hz for ett molekyl sporing eller 2 Hz i epifluorescence bildebehandling.
- Påføre glass bunnplaten til scenen av mikroskopet og finner en celle som er riktig å uttrykke de ønskede konstruksjoner. Når en egnet cellen har blitt funnet, justere NPHP4-mCherry stedet ved foten av primære flimmerhårene med plasseringen på tenkelig flyet som tilsvarer av laser enkeltpunkt belysning.
- Ta et epifluorescence bilde av NPHP4-mCherry og IFT20-GFP eller AP-SSTR3-GFP ved hjelp av funksjonen "Knepp" i kategorien "Kamera" "fokus" vinduet hvis bruker digital mikroskopi programvarepakken (se Tabell for materiale).
Merk: Disse bildene vil fungere som en referanse for de etterfølgende ett molekyl stedene. - Når referanse bildene er oppnådd, lokalt redusere konsentrasjonen av merket enkelt molekyler. Foto-blekemiddel til TZ med 1 mW laser lys for 20 s eller til fluorescens intensiteten er tilnærmet de bakgrunn fluorescens.
Merk: Når nøyaktig konsentrasjonen kan kontrolleres, 0.1-1 nM merket enkelt molekyler brukes. - For å forberede ett molekyl sporing, redusere laser belysning kraften til ~0.15 mW for enkelt molekyler merket med GFP eller ~0.5 mW for molekyler merket med Alexa647.
- Så snart laser makt og tenkelig parametere angis, maksimal gevinst og intensivering og 2 ms bildefrekvens, for enkel molekyl bildebehandling, engasjere riktig belysning laser og registrere ikke-photobleached, merket enkelt molekyler som de er transportert gjennom photobleached regionen TZ ved å klikke "Stream" i kategorien "Kamera" "fokus" vinduet.
Merk: Ikke mer enn 2 min video skal bli slått for å minimere virkningene av ciliary drift til et ubetydelig nivå. - Etter ett molekyl videoinnspilling, behandle videoer med en 2D Gaussian passende algoritmen, som glimt av Gelles Lab, som nettopp regionaliserer centroid av hver enkelt molekyl eksitasjon PSF i et omfatter område av interesse (AOI).
- Merk alle ett molekyl med presisjon < 10 nm og korrigere midten av flimmerhårene basert på distribusjon av ett molekyl steder utstyrt med en 2D Gaussisk funksjon.
Merk: Ved hjelp av 2D 3D transformasjon algoritme, 3D transport ruter av IFT20-GFP og AP-SSTR3 tydelig vises på ciliary axonemal eller ciliary membran, henholdsvis.
3. 2D til 3D transformasjon
- Når flere tusen steder for transitt molekyler (signal til støy forhold > 11) i Flimmerhår er samlet, merker du den lange aksen til Flimmerhår som X-dimensjonen. Lage et Y dimensjon histogram av steder og få bin summene i 10 nm intervaller.
Merk: 2D til 3D transformasjon kan bli vurdert av hånd eller programvare eller programmeringsspråk. Forfatterne har implementert transformasjonen i Matlab og Python 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen viser dataene innhentet utføre hastighet mikroskopi på TZ av primære flimmerhårene å studere transportruten av SSTR3 forbundet med en ~ 15 nm eksterne linker til Alexa647 (Figur 3A). Det tjener dobbelt formål på bekrefter 3D transformasjon algoritmen. Alexa647 bør bare etiketten i ytre overflaten av den primære Flimmerhår og derfor 3D transportruten skulle avsløre en høy tetthet transportrute på denne plasseringen. NIH-3T3 stabilt uttrykke NPHP3-mCherry på til TZ må transfekterte med AP-SSTR3-GFP og ruges i henhold til ovennevnte protokollen med streptavidin-konjugerte Alexa647. Bredt felt bildebehandling av mCherry brukes til å lokalisere TZ mens GFP brukes til å sikre at en celle har uttrykt den ønskede SSTR3 konstruksjonen. Dessuten er bredt felt avbildning av Alexa647 etiketten bruker 633 nm belysning nødvendig for å bekrefte at cellen har riktig uttrykt BirA plasmider og har absorbert tilstrekkelig biotin fra media. Positiv bekreftelse er preget av en synlig Flimmerhår forskjellig fra bakgrunnen fluorescens (Figur 3B). Effektiv merking av AP-SSTR3-GFP-konstruksjon med streptavidin-konjugerte Alexa647 kan bare oppstå under disse forholdene. Når positiv bekreftelse av selektiv merking av av primære Flimmerhår av Alexa647 er oppnådd, kan photobleaching og enkelt belysning av TZ med en 633 nm laser enkelt molekyler å bli visualisert. Før dataanalyse er legge ett molekyl videoen på bredt felt belysning en nyttig valideringstrinnet (Figur 3C). For eksempel Hvis laseren ikke er riktig justert, vises ingen enkelt molekyler å co lokalisere med til TZ. En annen før data analyse valideringstrinnet å sikre en tilstrekkelig signal-til-støy-forhold er å kontrollere intensiteten på til TZ over lengden av ett molekyl video (Figur 3E). Slik analyse kan utføres raskt i ImageJ funksjonen 'plot z aksen profil'. Toppene i Figur 3F tilsvarer utseendet til et enkelt molekyl på til TZ med et signal-til-støy av ~ 5.0. Denne grafen er også i stand til å sikre at nok photobleaching har oppstått noe som gjenspeiles av godt separert hyppigheten av enkelt molekyler. Figur 3 G viser lav signal-til-støy forholdet < 0,5. En forklaring ville være at laseren ikke justeres direkte på TZ. En annen grunn kan være at laser belysning kraften er for lavt. Både forklaringer føre lav eksitasjon, og derfor lave utslipp av fluorophores på til TZ. Etter at disse kontrollene er utført, vil 2D Gaussian montering av enkelt molekyler produsere sine baner i TZ (Figur 3H). Legge mange baner vil produsere transportruten av merket protein interesse til TZ (Figur 3jeg). Siden 2D Gaussian montering tilsvarer bildepunktverdiene på detektoren, x, kan y ett molekyl data flettes med bredt felt bildet av TZ og primære flimmerhårene ytterligere illustrerer protein av interesses lokalisering (Figur 3J ).
IFT20 er en komponent av IFT komplekset, som Last langs piskehale som henger i primære flimmerhårene25. Arl13b-mCherry, et protein som brukte ciliary markør ble brukt til å merke primære flimmerhårene19. Wide-field epi-fluorescens mikroskopi brukt å image den primære Flimmerhår uttrykke både Arl13b-mCherry og IFT20-GFP og deretter byttet til hastighet mikroskopi spore individuelle IFT20-GFP proteiner i primære flimmerhårene etter en pre-photobleaching av GFP fluorescens ned enkelt-molekylet nivå innen belysning hastighet mikroskopi (Figur 4-4 vekselstrøm).
Til slutt, kan hundrevis av enkelt-molekylet IFT20-GFP steder med en systematical lokalisering presisjon på < 16 nm fås fra den primære Flimmerhår av en levende celle (Figur 4D). Ifølge våre simulering, 250 enkel molekyl steder med en radius på 95 nm var nok til å generere en pålitelig 3D transportrute (figur 5). En endelig beslutning av IFT20-GFP transportruten er basert på tusenvis av enkelt-molekylet IFT20-GFP steder fra ti flimmerhårene (Figur 4E). Siden primære flimmerhårene har en struktur med roterende symmetri, ble 2D til 3D transformasjon algoritmen brukt i 2D beregnede dataene. Interessant, 3D romlige sannsynlighet tetthet kart fra IFT20 indikerte at bare et enkelt høy tetthet område med en ~ 60-nm bredde nådde ~ 95 nm langs radius av primære flimmerhårene (Figur 4E). Denne høy tetthet regionen trolig regionaliserer sammen med de axonemal piskehale som henger, med den kjente plasseringen av IFT ruten (Figur 4F).
Figur 1 . Forenklet skjematisk av hastighet mikroskopi. En loddrett (bane 1) eller en tilbøyelig (bane 2) punkt spredning funksjon brukes til å belyse enkelt fluorophore molekyler i fokalplanet. "d" refererer til avstanden mellom loddrette belysning laserstrålen som går gjennom midten av målet og vinklet belysning som oppnås ved å fokusere laseren belysning på kanten av målet. To eller flere lasere regulert av en optisk helikopter har en-på-eksitasjon-modus brukes til å spore enkelt molekylene transitt gjennom NPC eller den primære Flimmerhår. Av tiden er minst ti-fold lengre enn photobleaching av fluorophore på målrettet molekyler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Grafisk demonstrasjon av 2D til 3D konverteringsprosessen. Skjematisk vise 2D til 3D transformasjon algoritme for molekyler, for eksempel hvis de diffus i de sentrale lumen (A-F) eller en ekstern region (G-L) av et rør. (A) ideelle 3D romlige steder av tilfeldig spre molekyler inni et rør kan være koordinert i en sylindrisk samordning system (R, X, θ). I fart beregnes til slutt bare 3D tetthet kartet fra 2D romlige steder. Men er dette en idealisert sak å illustrere at 3D tetthet kartet er tilsvarende om 2D eller 3D romlige stedene er kjent. (B) 3D molekylær steder i en er projisert på et 2D fly i et kartesisk samordning system (X, Y, Z) av mikroskopi tenkelig. (C) en svært tynn skive (Δx) kuttet fra sylinderen i A langs x-dimensjon. (D) 3D romlige steder i sektoren i C kan projiseres innenfor et smalt 2D område. (E) tverrsnittvisningen av alle steder i tynne skive i C. Disse stedene kan grupperes i underregionene mellom konsentriske ringer. Gitt de high-nummer tilfeldig fordelte molekylene i sylinderen og kuttet veldig tynn skive, romlige tettheten av steder (pjeg) i hvert delområde (Si) mellom to nabokommunene ringer blir rotasjons symmetrisk og uniform. Disse stedene kan sendes videre til 1D langs Y-dimensjonen. Hvis plasseringene langs Y dimensjon er gruppert i et histogram med j kolonner. Totalt antall steder i hver kolonne (Aj) er lik 
, som kan være eksperimentelt målt som vist i (F). (G-L) Samme som ovenfor, transformasjonsprosessen presenteres for molekyler spre innenfor et ytre område av et rør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . 3D romlige plassering av transportruten for SSTR3 på live primære flimmerhårene tilordnet av hastighet mikroskopi. (A) grafisk fremstilling av hastighet mikroskopi brukes til sporing av GFP-merket SSTR3 gjennom TZ preget av NPHP4-mCherry. (B) Epifluorescence bilde av NPHP4-mCherry (rød), AP-SSTR3-GFP (grønn), Alexa647 som eksternt merket AP-SSTR3-GFP (hvit), og det endelige flettede bildet. Skala bar: 2 µm. (C) sporing av en enkelt Alexa 647-merket AP-SSTR3-GFP (hvit) som passerer gjennom feltet punkt belysning for fire bilder (2 ms/ramme). Skala bar: 2 µm. (D) ett molekyl bane (hvit) fra (C) oppå epifluorescence bildet av NPHP4-mCherry (rød) og AP-SSTR3-GFP (grønn). Skala bar: 2 µm. (E) hvite stiplede kvadrat høydepunkter området enkeltpunkt belysning sentrert på TZ. Skala bar: 2 µm. (F) Foton telle vs ramme nummer graf for et enkel molekyl video med en høy signal til støyforhold beregnet ved å dele den maksimale fluorescensen av ett molekyl delt bakgrunn fluorescens. (G) Foton telle vs ramme nummer graf for et enkel molekyl video med et svakt signal til støyforhold. (H) banen fra (E) og (D) lokalisert i hver ramme av 2D Gaussian montering og oppå en nøyaktig grafisk gjengivelse av TZ, også lokalisert ved 2D Gaussian montering. 2D Gaussian tilpasningsprosessen passer en Gaussian funksjonen til X- og Y dimensjoner av intensitet profilen for et område av interesse (AOI) omfatter enkelt molekylets PSF.(I) 2D super-oppløsning romlige fordelingen av 220 personlige Alexa Fluor 647-merket AP-SSTR3-GFP steder samlet fra en enkelt primære Flimmerhår. (J) Super-oppløsning ett molekyl steder fra (I) oppå epifluorescence bildet av NPHP4-mCherry (rød) og AP-SSTR3-GFP (grønn). Skala bar: 2 µm. (K) av en 2D til 3D transformasjon algoritme, romlige sannsynlighet tetthet fordelingen av Alexa Fluor 647-merket AP-SSTR3-GFP på primære flimmerhårene langs R dimensjonen ble innhentet. Basert på Gaussian funksjonen montering, Alexa Fluor 647-merket AP-SSTR3-GFP primært ligger på ciliary membranen i en radius på 131±3 nm med en full bredde på halv maksimalt (FWHM) 24±1 nm. (L) tverrsnitt visning av romlige sannsynlighet tetthet distribusjon (grønn Sky) av Alexa Fluor 647-merket AP-SSTR3-GFP på primære flimmerhårene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . 3D romlige plassering av transportruten for IFT20 i live primære flimmerhårene tilordnet av hastighet mikroskopi. (A-C) Representativt bilde av Arl13b-mCherry (A) og IFT20-GFP (B) co-uttrykkes i en NIH3T3 celle og flettede (C). Sirkelen (cyan) angir plasseringen av ett-punkts belysning av hastighet mikroskopi på en primær Flimmerhår vokste på siden av en celle (hvite stiplede linjer) som kantene bestemmes av IFT20-GFP fluorescens i celle kroppen og lys feltet belysning (ikke vises). Skala bar: 10 µm. (D) 2D super-oppløsning romlige fordelingen av 286 enkeltsteder for IFT20-GFP samlet inn fra en enkelt primære Flimmerhår. (E) av en 2D 3D transformasjon algoritmen hentes romlige sannsynlighet tetthet distribusjon av IFT20-GFP inne primære flimmerhårene langs R dimensjonen. Basert på Gaussian funksjonen passer, finne IFT20-GFP hovedsakelig på en radius på 95±1 nm med en full bredde på halv maksimalt (FWHM) 56±5 nm. (F) tverrsnittvisningen av romlige sannsynlighet tetthet distribusjon (grønne skyer) av IFT20-GFP i primære flimmerhårene, kledde med skjematisk H. skala bar: 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Simuleringen ble brukt til å beregne antallet 2D single-molekylet steder å generere kart pålitelig 3D romlige sannsynlighet tetthet for 2D til 3D transformasjon algoritmer. (A) 100 beregningsmessig generert én-molekylet steder tilfeldig prøver fra en radial tetthet normalfordeling sentrert på 95 nm (tilsvarende den primære transportruten av IFT20 i vår eksperimenter). Lokalisering presisjon 16 nm simuleres for hver enkelt-molekylet plassering av prøvetaking fra en normalfordeling med σ = 16 nm. Som vist i figur 2C, en svært tynn skive (Δx) i X-dimensjon brukes for transformasjon algoritmer og derfor X dimensjonen vises ikke på beregningsmessig generert 2D single-molekylet steder. (B) transformasjon mellom Y-dimensjonale prosjektdata og 3D R-dimensjonale tetthet generere histogrammer for 3D R-dimensjonale tettheter for fem ulike simulert datasett (hver med 100 poeng). Tallet ovenfor er topp posisjon ± passende feil. (C-D) Simuleringen resultatene basert på 250 single-molekylet steder. (E-F) Simuleringen resultatene basert på 500 single-molekylet steder. (G-JEG) Gjennomsnittlig 3D tetthet histogrammer fra 100-, 250- og 500-poeng simuleringer henholdsvis. Feilfelt representerer variasjon i histogrammet bin høyder mens over toppen er gjennomsnittlige høyeste posisjon ± standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av hastighet mikroskopi til den primære Flimmerhår, en cellular signalnettverk organelle som er svært avhengig av effektiv protein transport. HASTIGHET mikroskopi kan gi høy oppløsning (< 10 nm) steder for fluorescently-merket molekyler idet de passerer gjennom enkeltpunkt belysning sentrert på TZ. Tidligere har det vært brukt for å studere protein smuglingen via NPC6,7,8. Men kan det utvides for å studere menneskehandel gjennom alle sub Diffraksjon mobilnettet hulrom. Denne teknikken har en fordel over andre høy-resolution tenkelig teknikker i at det er kjøpedyktig fange dynamikken i enkelt protein transport i levende celle systemer romlige og tidsmessige oppløsning av < 10 nm og < 2 ms, henholdsvis. En annen fordel er at man må bare fluorescently-label et protein av interesse og express Konstruer via transfection, en felles molekylærbiologi tilnærming til å studere protein lokalisering, for å begynne å utføre hastighet mikroskopi. Man må huske på at enkeltpunkt belysning med en høyeffekts laser er funksjonen som gir godt atskilt, høy oppløsning ett molekyl plasseringene. Men dette også begrenser området belysning og gjør teknikken ikke egnet for bredt felt lokalisering. Heldigvis er det mange bredt felt super oppløsning teknikker for etterforskerne å velge mellom hvis ønskelig. Et annet punkt å vurdere er at hastigheten mikroskopi bare fanger steder flytte enkelt molekyler. Derfor kan sammen med FRAP, som kan avgjøre brøkdel av totale molekyler som er mobile, være et nyttig tillegg til analyse.
Konverteringen mellom det kartesiske og sylindriske koordinering systemet er å generere kart virtuelle 3D sannsynlig tetthet enn en 3D-visning basert på 3D single-molekylet sporing. I detalj, har elektronmikroskop data avdekket at primære flimmerhårene har en rotasjons symmetrisk struktur som kan generere en jevn molekyl distribusjon langs viss radius. Denne jevn fordeling fører at den romlige fordelingen langs θ dimensjon i sylindriske systemet er konstant. Deretter kan 3D-koordinatene (R, X, θ) forenkles skal 2D-koordinater (R, X, konstant). Egentlig er vår transformering prosess mellom det kartesiske og sylindriske systemer fra 2D (X, Y) til 2D (R, X, konstant). Den konstant θ, refererer til den romlige tetthet p, beregnes ved hjelp av ligning A
(figur 2). Bruk en matrise kalkulator for å beregne vektoren 
, som samsvarer med relativ områdene mellom nærliggende konsentriske ringer i tverrsnitt Vis6,7Aj s totale samhandling steder for posisjon j målt direkte fra eksperimenter; Således, pjeg, romlig sannsynlighet tettheten av webområdene samhandling på rjeg, kan beregnes ved å løse matrise ligningen av.
En avgjørende skritt i protokollen er å minimere eventuelle forstyrrelsene av mikroskopi mellom referanse bildeopptak og ett molekyl video. Hvis enhver bevegelse, er det ikke mulig å trygt tilordne ett molekyl plasseringene til ultrastructure av primære flimmerhårene som ble hentet via epifluorescence bildebehandling. Et annet viktig skritt er å photobleach området belysning nok lokalt redusere konsentrasjonen av fluorescently merket enkelt molekyler, men ikke så mye som befolkningen er helt photobleached. Ved SSTR3, diffusjon koeffisient er treg sammenlignet løselige molekyler og bevegelse av en befolkning av FN-photobleached SSTR3 molekyler tilbake i photobleached området vil være mer enn to minutter, tiden som den ciliary drift er en ikke-ubetydelig faktor. Hvis riktig nivå av photobleaching er vanskelig å oppnå og høy bakgrunn fluorescens er fortsatt til stede, en vinklet belysning laser kan brukes til å redusere fluorescently merket enkelt molekyler som er begeistret over og under den bildebehandling flyet. Dette vil redusere bakgrunnen og forbedre signal-til-støy forholdet for hvert fanget ett molekyl.
Oppsummert er hastighet mikroskopi kjøpedyktig gjennomføres lett på konvensjonelle mikroskopi oppsett med tillegg av en laser belysning kilde, tilknyttede speil og høyhastighets CCD kamera. Det største fremskrittet over andre lignende teknikker er tilbøyelig laser som reduserer bakgrunn fluorescens og 2D til 3D transformasjon algoritmen som rekonstruerer 3D romlige sannsynlighet tetthet kartet i 2D single-molekylet steder. Fra en biologisk ståsted, er ingen ekstra merking foruten et fluorophore-konjugerte protein av interesse nødvendig. Disse funksjonene tillater fart mikroskopi spore enkelt molekyler med høy spatiotemporal (5-10 nm, 0.4-2 ms) oppløsning som de trafikken gjennom en sub mikrometer bio-hulrom eller bio-kanalen med rotasjons symmetrisk strukturer. Sammen med en 3D sannsynlig tetthet transformasjon algoritme, bestemmes 3D transport ruter merket proteiner gjennom hulrom eller kanal. Bruk av denne teknikken har tidligere blitt brukt til å skille 3D transportveier proteiner og RNAs gjennom NPC, og her viser vi at 3D transport av en transmembrane protein, SSTR3 og en cytosolic proteiner, IFT20, oppnådd i TZ av primære flimmerhårene. Andre super-oppløsning teknikker, for eksempel 3D-STORM, har fått x, y, z stillinger for enkelt molekyler ved å plassere en sylindrisk linse i den optiske banen som skaper en asymmetrisk forvrengning av enkelt-molekylet PSF avhengig av plasseringen over eller under fokalplanet28. En annen forhånd kan prøve å implementere virtuelle pinhole teknologi for å redusere bredden på utslipp PSF og dermed øke oppløsningen ytterligere. De ovennevnte teknikkene kan implementeres på hastighet mikroskopi ganske lett. Samlet gir hastighet mikroskopi en unik tilnærming samtidig å bestemme transport kinetics på enkelt-molekylet nivå og 3D kart av transport med super høy spatiotemporal oppløsning for inter - eller intra-organelle molekylær smugling under visse forhold i levende celle systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) og Dr. Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) for å gi noen plasmider. Prosjektet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 og GM122552 til W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
