Summary
Recientemente nos asignan la ubicación espacial (3D) tridimensional de rutas de transporte para diversas proteínas translocación dentro de cilios primarios en células vivas. Aquí en este detalles de papel la configuración experimental, el proceso de muestras biológicas y el análisis de datos para la fluorescencia de super-resolución 3D imagen enfoque recién aplicados en viven cilios primarios.
Abstract
El cilio primario es una protrusión de microtubule-basado en la superficie de muchas células eucariotas y contiene un complemento único de proteínas esa función crítica en la motilidad celular y señalización. Cilios son incapaces de sintetizar su propia proteína, cerca de 200 proteínas ciliares únicas necesitan ser objeto de trata entre el citosol y los cilios primarios. Sin embargo, sigue siendo un desafío técnico para asignar lugares de (3D) tridimensionales de vías de transporte de estas proteínas en vivo cilios primarios debido a las limitaciones existentes en la actualidad técnicas. Para conquistar el reto, recientemente hemos desarrollado y emplearon un microscopio de alta velocidad super-resolución 3D virtual, llamado microscopia de la secundario-difracción (velocidad) de solo punto borde-excitación, para determinar la ubicación espacial 3D de vías de transporte para tanto citosólica y proteínas de la membrana de los cilios primarios de células vivas. En este artículo, le mostraremos la configuración detallada de la microscopia de la velocidad, la preparación de las células que expresan proteínas ciliares marcado con la proteína de la fluorescencia, el seguimiento en tiempo real de una sola molécula de proteínas individuales en vivo cilio y el logro de de densidad de probabilidad espacial 3D mapas de rutas de transporte ciliar proteínas.
Introduction
Como afirma Ernst Abbe en 1873, la resolución de la microscopía de luz convencional ha sido cree que limitada a aproximadamente 200 nm debido a la difracción de la luz del objetivo1,2. En la actualidad, técnicas de microscopía de superresolución rompen esta limitación y permiten la captura de imágenes dinámicas con la resolución de la secundario-difracción (< 200 nm). Las técnicas generalmente caen en dos amplias categorías: estimuló la emisión (STED) el agotamiento basado en la microscopia enfoques, generan volumen de iluminación sub-difracción debido a la respuesta óptica no lineal de fluoróforos en muestras3; y microscopia ligera fotoactivado (PALM) y microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta)-basado en técnicas de súper-resolución, que utilizan funciones matemáticas para localizar los centroides de fluoróforos y luego reconstituir estos centroides para formar imágenes de súper-resolución4,5. Actualmente, debido a la configuración óptica relativamente sin complicaciones, Palma y tormenta son ampliamente empleados por activar sólo un pequeño subconjunto de fluoróforos en cada fotograma de un video largo de una preparación biológica. Esto permite la localización más exacta por ajuste gaussiano 2D del spot fluorescente, denominada la función de extensión de punto (PSF), de proteínas marcada con fluorescencia en cada fotograma del vídeo. La ubicación 2D de cada molécula marcada con fluorescencia puede entonces se superponen en un solo plano de proyección de imagen para producir una imagen de súper-resolución de la preparación biológica1,2. Mientras estos localización de una sola molécula, enfoques de super-resolución microscopía revolucionaron sin duda cómo se realizó la proyección de imagen de las muestras biológicas, todavía hay retos que superar. Por ejemplo, tormenta y la palma pueden alcanzar sus mejores resoluciones espaciales después de la fijación de muestras biológicas y así presentar una representación estática de las proteínas marcada con fluorescencia, que es una limitación similar de la microscopia electrónica. Además, para conseguir alta resolución espacial para cada proteína marcada con fluorescencia en células vivas, las muestras deben ser reflejadas en tasa de fotogramas muy largo que es capaces de captar la dinámica de la proteína. Por lo tanto, es necesario superar estos obstáculos técnicos principales.
Para obtener una alta resolución espacio-temporal que está bien preparado para detectar movimiento rápido proteínas o ARN en células vivas, hemos desarrollado la microscopía de superresolución velocidad en nuestro laboratorio (figura 1)6,7, 8. varios avances técnicos importantes en microscopía de velocidad previamente nos han permitido rastrear con éxito transporte NUCLEOCITOPLASMÁTICO de pequeñas moléculas, proteínas, mRNA y virus a través de nativos nuclear poro complejos (PNJ)6, 7 , 8. brevemente, se utilizarán las siguientes características de la microscopia de la velocidad para seguir el rápido movimiento de macromoléculas a través de estructuras rotationally simétrico secundario-micrómetro en células vivas, como NPCs y cilios primarios: (1) una inclinación o un iluminación vertical PSF permite la excitación de las moléculas individuales dentro de un volumen pequeño del límite de difracción en el plano focal (figura 1); (2) el PSF inclinado puede evitar grandemente la fluorescencia fuera de enfoque y así mejorar la relación señal a ruido. (3) la densidad óptica de 100-500 kW / cm2 en la iluminación PSF permite miles de fotones a recogerse en solo fluoróforos con velocidades de detección rápida (> 500 Hz). Velocidad de la detección (4) el ayuno también reduce el error de localización espacial de una sola molécula (< 10 nm) en la determinación de las trayectorias espaciales de mover moléculas fluorescentes en células vivas, ya que la difusión molecular es uno de los principales factores que causan las imperfecciones de la localización de una sola molécula de moléculas en movimiento. Algoritmos de transformación (5) consolidada 2D a 3D nos permiten ofrecer mapas de densidad de probabilidad espacial 3D de rutas de transporte para las moléculas en el NPC o el cilio primario. Cabe mencionar que nuestro proceso de conversión entre el cartesiano y el sistema de coordinación cilíndrico se usa para generar una densidad de probabilidad espacial 3D mapa en lugar de 3D sola molécula seguimiento (figura 2). Anteriormente, datos de microscopía electrónica han revelado que el NPC9,10 y el cilio primario11 ambos tienen una estructura de simetría de rotación. En principio, difusión al azar de moléculas en movimiento a través del NPC o cilio primario debe tener distribuciones rotationally simétricas. Como se muestra en la figura 2, un número elevado de difusión al azar de las moléculas dentro del cilindro podría generar distribuciones rotationally simétricas en la vista de corte transversal que en el NPC, aún más dando como resultado un aproximadamente uniforme espacial distribución dentro de cada subregión muy pequeño entre dos anillos vecinos (figura 2E). Esta distribución uniforme conduce que la distribución espacial a lo largo de la dimensión θ en el sistema cilíndrico es constante. Entonces las coordenadas 3D (X, R, θ) se pueden simplificar para las coordenadas 2D (R, X, constante). En realidad, nuestro proceso de conversión entre el cartesiano y los sistemas cilíndricos es de 2D (X, Y) 2D (R, X, constante). El θ constante, se refiere a la densidad espacial p en la figura 2E, se calcula utilizando la ecuación A
.
En definitiva, una sola molécula seguimiento tiene amplia aplicación en la investigación biológica, por lo tanto, es natural que se desarrollará una gran cantidad de técnicas para llenar nichos biológicos específicos12,13,14. Tal es el caso de microscopía de la velocidad. Anteriormente, cuando se combina con un algoritmo de transformación 3D, esta técnica se desarrolló para resolver rutas de transporte 3D de moléculas a través de los PNJs, una estructura biológica rotationally simétricos y sub-diffraction-tamaño6en tránsito. En este papel, cilios primarios aparecen ser organelos excelente modelo así. Cilios primarios son orgánulos cilíndricos, antena-como (~ 125 radio de nm) que se proyectan desde la superficie de las células mamíferas más15,16,17. Son responsables de recibir las señales externas y transmitir una respuesta intracelular típicamente asociada con el crecimiento y metabolismo15,16. Por lo tanto, del flujo de proteínas estructurales, reciclaje de receptores transmembranales y la transmisión de los mensajeros intracelulares son responsabilidades vitales de los cilios primarios. En la coyuntura entre los cilios primarios y el cuerpo celular es una barrera crítica de la selectividad, llamada zona de transición o TZ, a través del cual este transporte de la proteína debe ocurrir11,18,19, 20. Además de la función bloquea de la TZ, al menos dos procesos de transporte, Transporte intraflagelar y difusión pasiva, se cree que son responsables del movimiento de la proteína a través de esta región16,21, 22. desde un punto de vista de salud humana, la pérdida de cilios primarios y posterior desregulación de señalización corriente abajo es característica de muchos tipos de cáncer. Además, muchas enfermedades genéticas, como síndrome de Bardet-Biedl y enfermedad de riñón policística, están asociadas con la proteína defectuosa transporte23. El tamaño límite de sub- difracción y el complejo proceso de transporte de la proteína selectiva a través de la TZ hacen los cilios primarios el primer objetivo de esta técnica. En este trabajo métodos, demostramos el seguimiento de una proteína transmembrana ciliar, receptor de somatostatina 3 (SSTR3)24, marcado externamente con un componente de IFT, IFT2025, marcado con una molécula GFP fusionada y Alexa Fluor 647.
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Protocol
1. NIH-3T3 preparación de células para la microscopia de la velocidad de la acción
- 1,5 semanas antes el experimento, recupera un cultivo fresco de las células NIH-3T3 de un stock congelado descongelación a 37 º C y transfiriendo las células a un matraz de cultivo celular de 25 cm2 con 3 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 110 mg/mL piruvato de sodio, 2 mM glutamina, suero bovino fetal 10% y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Incube las células a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
- Dividir celdas en el 80% de confluencia, sobre cada dos días, por lo menos tres veces antes del día experimental para asegurar la homogeneidad del ciclo celular. Trypsinize células con tripsina 0.25% por 2 min a 37 ° C, Aspire tripsina y reemplazarlo con 2 mL de medio. Pipeta el medio repetidamente para romper para arriba racimos de célula, quitar el número deseado de células y llevar el volumen total de los medios de comunicación de nuevo hasta 3 mL.
Nota: NIH-3T3 previamente fueron genéticamente modificados para expresar entre-4, una proteína que se localiza a la TZ26, fundida en la terminal C a mCherry. mCherry es un fluoróforo que puede ser excitado con 561 iluminación nm localizar cuantitativamente la barrera de la selectividad TZ y orientar los cilios primarios. - Dos días antes del experimento, placa las células en un fondo de cristal de 35 mm plato en confluencia de 60-70% con 1,5 mL del mismo medio como paso 1.1 y vuelva las células a la incubadora.
- Un día antes del experimento, químicamente transfectar las células con el plásmido deseado. Mezclar 500-1000 ng de plásmido deseado (ver Nota más abajo) en una proporción de 1: 2.5 con el reactivo de transfección en 0,25 mL de suero reducido medio sin antibióticos durante 30 minutos medios aspirado desde los 35 mm de vidrio, plato de fondo y reemplazarlo con el plásmido de 0.25 mL / mezcla de reactivo de transfección y una extra 1,25 mL de medios suero reducido sin antibióticos. Suero reducido los medios de comunicación sirven para facilitar una exitosa transfección, induciendo el crecimiento de cilios primarios, así como mantener las células vivas lo suficiente para llevar a cabo el experimento. Vuelva las células a la incubadora para el experimento al día siguiente.
Nota: Cuando se realiza el seguimiento de una sola molécula de IFT20, un plásmido que contiene que un IFT20 genéticamente fusionado en su terminal C a GFP es usada25. Cuando se realiza una sola molécula de SSTR3, un plásmido que contiene un SSTR3 genéticamente fusionado en su N terminal a un dominio de receptor péptido (AP) y terminal C a GFP es usado22. Además de la construcción de SSTR3, un plásmido que contiene el ligase de la biotina BirA debe expresarse conjuntamente y los medios de comunicación de transfección deben complementarse con biotina μm 10. BirA luego conecta biotina el dominio AP de recién sintetizadas moléculas AP-SSTR3-GFP en el nivel de la sala de emergencia. Alexa647 conjugado a tres de los cuatro sitios de unión a biotina de estreptavidina, en promedio, puede completarse entonces a los medios de comunicación antes de la proyección de imagen a la etiqueta fluorescente las moléculas AP-SSTR3-GFP en la superficie externa de la célula22,27 . GFP y AlexaFluor647 se utilizan en este método; sin embargo, otras sondas fluorescentes pueden utilizarse si tienen semejantemente alta foto-estabilidad y rendimiento cuántico. - Si utiliza el constructo SSTR3 externamente marcados, eliminar los medios de comunicación de la parte inferior de vidrio plato 1 h antes del experimento, lavan la celda 5 veces con 1 mL de tampón fosfato salino (PBS) y añadir 1 mL de suero reducidos medios suplementados con 1 μm Alexa647 conjugado estreptavidina.
- No más de 15 minutos antes del experimento, eliminar los medios de comunicación desde el plato de fondo de cristal y lave las células transfected y etiquetadas 5 veces con 1 mL de PBS.
- Coloque 1 mL de tampón de proyección de imagen (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 m m de NaOAc, MgOAc, de 2 mM 1 mM EGTA, pH 7.3) en el plato de fondo de vidrio.
Nota: En el buffer de imagen, las células son viables por no más de 3 h. Por lo tanto, sólo 2 h de experimentos se realizan en cada plato.
2. microscopia de velocidad
Nota: La configuración de la microscopia de velocidad incluye un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un objetivo apocromática 1,4-NA 100 x inmersión en aceite, un láser de He-Ne de nm 35 que se 633 mW, 50 mW 488 nm y 561-nm láser de estado sólido, un aumento de la multiplicación de la en-viruta dispositivo de carga acoplada la cámara y un paquete de software del microscopio para adquisición de datos y el procesamiento (figura 1). Para la proyección de imagen de canal individual, GFP, mCherry y Alexa647 son excitados por 488 nm, 561 nm, o 633 nm, respectivamente. Para el rastreo de molécula única, único punto de iluminación se utiliza para rastrear moléculas individuales marcada con fluorescencia. Para la proyección de imagen de epifluorescencia, se coloca una lente cóncava en el camino de iluminación láser para expandir el haz en un campo uniforme de la iluminación. Las emisiones de fluorescencia son recogidas por el mismo objetivo, filtradas por un filtro dicroico (405/488/561/635) y un filtro de emisión (405/488/561/635) y fotografiadas con la cámara CCD arriba operando a 500 Hz para el seguimiento de la molécula sola o 2 Hz para proyección de imagen de epifluorescencia.
- Fije la placa inferior a la etapa del microscopio y localizar una célula que expresa correctamente las construcciones deseadas. Una vez que se ha encontrado un celular adecuado, alinee el punto mCherry NPHP4 en la base de los cilios primarios con la ubicación en el plano de proyección de imagen que corresponde a la iluminación del punto único del láser.
- Capturar una imagen de epifluorescencia de mCherry NPHP4 y IFT20-GFP o AP-SSTR3-GFP utilizando la función "Snap" en la pestaña de "Cámara" de la ventana de "Controles de enfoque" Si utiliza el paquete de software de microscopia digital (véase Tabla de materiales).
Nota: Estas imágenes actuará como referencia para la ubicación subsiguiente a la sola molécula. - Una vez que se obtienen las imágenes de referencia, localmente reducen la concentración de las moléculas individuales etiquetadas. Foto-blanquee el TZ con 1 mW láser de iluminación para 20 s o hasta que la intensidad de fluorescencia es cercano de la fluorescencia de fondo.
Nota: Cuando la concentración precisa puede ser controlada, 0.1-1 nM etiquetada las moléculas individuales se utilizan. - Para prepararse para el seguimiento de molécula simple, reducir el poder de iluminación láser de ~0.15 mW para las moléculas individuales con GFP o ~0.5 mW para moléculas con Alexa647.
- Tan pronto como la potencia del láser y los parámetros de la proyección de imagen son conjunto, máxima ganancia e intensificación y velocidad de fotogramas de 2 ms, imagen de molécula única, realizar el láser de iluminación adecuada y registrar no photobleached, etiquetado como moléculas individuales que son transportados a través de la región de photobleached de la TZ haciendo clic en el botón "Stream" en la pestaña de "Cámara" de la ventana de "Controles de foco".
Nota: No más de 2 minutos de video debe ser capturado para minimizar los efectos de ciliar deriva a un nivel insignificante. - Después de capturar el video de sola molécula, procesa los videos usando un algoritmo de ajuste gaussiano 2D, como la visión por el laboratorio de Gelles, que precisamente se localiza el centroide de la excitación de cada molécula individual PSF en una zona que abarca de interés (AOI).
- Seleccione todas las ubicaciones de molécula única con precisión < 10 nm y corregir el centro de cilios basado en la distribución de localidades de molécula única dispone de una función Gaussiana 2D.
Nota: Usando 2D para algoritmo de transformación 3D, las rutas de transporte 3D de rutas IFT20-GFP y AP-SSTR3 claramente aparecen en la membrana ciliar ciliar o axonemal, respectivamente.
3. 2D a 3D transformación
- Una vez que se recogen varias miles localizaciones de moléculas (señal a ruido ratio > 11) en tránsito en el cilio, seleccione el eje largo del cilio como la dimensión de X. Hacer un histograma de dimensión Y de los lugares y obtener las sumas de bin en 10 incrementos de nm.
Nota: El 2D a 3D transformación pueden evaluarse por la mano o cualquier software o lenguaje de programación. Los autores han aplicado con éxito la transformación en Matlab y Python 2.7.
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Representative Results
Esta sección muestra los datos obtenidos de la realización de microscopia de la velocidad en la TZ de cilios primarios para el estudio de la ruta de transporte de SSTR3 conectados por un ~ 15 nm externos vinculador Alexa647 (figura 3A). Sirve el doble propósito de verificar el algoritmo de transformación 3D. Alexa647 debe sólo etiqueta la superficie externa del cilio primario y por lo tanto, la ruta de transporte 3D debe revelar una ruta de transporte de alta densidad en ese lugar. NIH-3T3 expresando estable NPHP3 mCherry en el TZ debe ser transfectadas con GFP-SSTR3-AP e incubados según el protocolo anteriormente con conjugado estreptavidina-Alexa647. Proyección de imagen de gran campo de la etiqueta mCherry se utiliza para localizar el TZ mientras la GFP se utiliza para asegurar que una célula ha expresado la construcción deseada de SSTR3. Además, proyección de imagen de gran campo de la etiqueta Alexa647 iluminación nm 633 es necesario para confirmar que la célula ha expresado correctamente el plásmido BirA y ha absorbido suficiente biotina de los medios de comunicación. Confirmación positiva se caracteriza por un cilio visible distinto de la fluorescencia del fondo (figura 3B). Etiquetado eficiente de la construcción de la AP-SSTR3-GFP con conjugado estreptavidina-Alexa647 sólo puede ocurrir bajo estas condiciones. Una vez que se ha obtenido una confirmación positiva de etiquetado selectivo del cilio primario por Alexa647, fotoblanqueo y punto de iluminación de la TZ con un 633 nm láser permitirá moléculas individuales ser visualizados. Antes del análisis de datos, superponiendo el video sola molécula en la iluminación de campo es un paso de validación útil (figura 3C). Por ejemplo, si el láser no está correctamente alineado, no moléculas individuales parece localizar conjuntamente con la TZ. Otro paso de validación de análisis de pre-datos para garantizar una adecuada relación señal-ruido es comprobar la intensidad en el TZ a lo largo de la molécula sola video (figura 3E). Dicho análisis pueden realizarse rápidamente en ImageJ mediante la función 'trazar el perfil del eje de z'. Los picos en la figura 3F corresponden a la apariencia de una sola molécula en el TZ con un señal a ruido de ~ 5.0. Este gráfico también es capaz de asegurar que se ha producido suficiente fotoblanqueo según lo evidenciado por la frecuencia bien separada de las moléculas individuales. Figura 3 G muestra un cociente signal-to-noise bajo < 0.5. Una explicación sería que el láser no está alineado directamente sobre el TZ. Otra razón puede ser que la energía de la iluminación del laser es demasiado baja. Ambas explicaciones causar excitación baja y, por lo tanto, baja emisión de los fluoróforos en la TZ. Después de realizadas estas comprobaciones, ajuste gaussiano 2D de las moléculas solo producirá sus trayectorias en el TZ (figura 3H). Superposición de muchas trayectorias producirá la ruta de transporte de la proteína marcada del interés en el TZ (figura 3). Puesto que el ajuste gaussiano 2D corresponde a los valores de píxel del detector, la x, se pueden combinar datos de molécula única y con la imagen de campo amplio de la TZ y cilios primarios para ilustrar aún más la proteína de la localización de interés (figura 3J ).
IFT20 es un componente del IFT complejo, que transporta carga a lo largo de los microtúbulos en cilios primarios25. Arl13b-mCherry, una proteína del marcador ciliar ampliamente utilizado fue utilizado para etiquetar cilios primarios19. Microscopía de amplio campo epi-fluorescencia fue utilizado a la imagen el cilio primario expresando Arl13b mCherry y IFT20-GFP y luego cambió a la microscopía de la velocidad para realizar un seguimiento individuales proteínas IFT20-GFP en los cilios primarios después de una pre-fotoblanqueo de GFP fluorescencia a nivel de una sola molécula en el área de iluminación de la microscopia de la velocidad (figura 4A-4 C).
Con el tiempo, cientos de una sola molécula GFP IFT20 locales con una precisión de localización sistemática de < 16 nm pueden obtenerse desde el cilio primario de una célula viva (figura 4D). Según nuestra simulación, 250 solo lugares de molécula con un radio de 95 nm fue suficiente para generar una ruta de transporte 3D confiable (figura 5). Una determinación final de la ruta de transporte IFT20-GFP se basa en miles de una sola molécula GFP IFT20 lugares de diez cilios (figura 4E). Puesto que cilios primarios poseen una estructura con simetría rotacional, el 2D al algoritmo de transformación 3D fue aplicado a los datos proyectados 2D. Interesantemente, los mapas de densidad de probabilidad espacial 3D de IFT20 indicaron que solamente una sola región de alta densidad con una anchura de ~ 60 nm alcanzó ~ 95 nm a lo largo del radio de cilios primarios (figura 4E). Esta región de alta densidad probablemente se localiza conjuntamente con los microtubules axonemal, de acuerdo con la ubicación conocida de la ruta IFT (figura 4F).
Figura 1 . Esquema simplificado de la microscopia de la velocidad de. Vertical (ruta 1) o una función de propagación punto inclinado (ruta 2) se utiliza para iluminar solo fluoróforo moléculas en el plano focal. "d" se refiere a la distancia entre el rayo láser de iluminación vertical que pasa por el centro del objetivo y ángulo de iluminación que se consigue centrándose el laser de la iluminación en el borde del objetivo. Dos o más láseres regulados por un interruptor óptico que un modo de la excitación de encendido y apagado se utilizan para rastrear las moléculas solo transita por la APN o el cilio primario. El tiempo apagado es por lo menos diez veces más tiempo que el fotoblanqueo de la etiqueta de fluoróforo en las moléculas específicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Demostración gráfica de 2D al proceso de conversión 3D. Esquemas de demuestran el 2D al algoritmo de transformación 3D de moléculas, por ejemplo, si difunden dentro de la luz central (A-F) o de una región periférica (G-L) de un tubo. (A) ubicación espacial 3D ideal de difusión al azar de las moléculas dentro de un tubo puede ser coordinado en un sistema de coordinación cilíndricos (R, X, θ). En velocidad, solamente el mapa de la densidad 3D se calcula al final de las ubicaciones espaciales 2D. Sin embargo, éste es un caso idealizado para ilustrar que el mapa de la densidad 3D es equivalente si se conocen las ubicaciones espaciales 2D o 3D. (B) las localizaciones moleculares 3D en un son proyectan en un plano 2D en un sistema de coordinación cartesiana (X, Y, Z) por proyección de imagen de la microscopia. (C) una rebanada muy fina (Δx) corte el cilindro en el A lo largo de x dimensión. (D) las localizaciones espaciales 3D en la rebanada que se muestra en C pueden proyectarse dentro de una estrecha región 2D. (E) vista sección transversal de todos los lugares en la rebanada delgada que se muestra en C. Estas ubicaciones se pueden agrupar en subregiones entre anillos concéntricos. Dado el alto número moléculas aleatoriamente distribuidas en el cilindro y el corte rebanada muy fina, la densidad espacial de los lugares (pi) en cada subregión (Si) entre dos anillos vecinos será rotationally simétrico y uniforme. Estas ubicaciones pueden proyectarse más en 1D a lo largo de la dimensión Y. Si las ubicaciones a lo largo de la dimensión Y están agrupadas en un histograma con las columnas de j. El número total de ubicaciones en cada columna (Aj) es igual a 
, que pueden ser experimentalmente medidos como se muestra en (F). (G-L) Igual que el anterior, el proceso de transformación se presenta para las moléculas dentro de una región periférica de un tubo de difusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Ubicación espacial 3D de la ruta de transporte para SSTR3 en vivo cilios primarios asignados por microscopia velocidad. (A) gráfico representación de la microscopia de velocidad aplicada al seguimiento de SSTR3 GFP-etiquetado a través de la TZ marcada por mCherry NPHP4. (B) epifluorescencia imagen de NPHP4-mCherry (rojo), AP-SSTR3-GFP (green), Alexa647 utilizó para etiquetar externamente AP-SSTR3-GFP (blanco) y la última imagen fusionada. Barra de escala: 2 μm. (C) el seguimiento de un solo etiquetado Alexa 647 AP-SSTR3-GFP (blanco) que pasa por el campo de iluminación del punto de cuatro fotogramas (2 ms/marco). Barra de escala: 2 μm. (D) sola molécula trayectoria (blanco) de (C) se sobrepone a la imagen de epifluorescencia de NPHP4-mCherry (rojo) y AP-SSTR3-GFP (green). Barra de escala: 2 μm. (E) blanco discontinua destaca cuadrado centrado en el área de iluminación de punto único en el TZ. Barra de escala: 2 μm. (F) del fotón Conde vs marco número gráfico para una sola molécula de video con una alta relación señal a ruido determinado dividiendo la máxima fluorescencia de la molécula única dividida por la fluorescencia de fondo. (G) del fotón Conde vs Marco gráfico número para una sola molécula de video con una baja relación señal a ruido. (H) trayectoria de (E) y (D) localizado en cada marco por ajuste gaussiano 2D y superpuesta a una representación gráfica exacta de la TZ, también localizado por ajuste gaussiano 2D. El proceso de ajuste gaussiano 2D ajusta una función Gaussiana para las dimensiones X e Y del perfil de intensidad de un área de interés (AOI) que abarca la distribución espacial de la molécula sola PSF.(I) 2D super-resolución de 220 individual etiquetado Alexa Fluor 647 AP-SSTR3-GFP localizaciones recogieron de un solo cilio primario. (J) súper resolución sola molécula lugares de (I) se sobrepone a la imagen de epifluorescencia de NPHP4-mCherry (rojo) y AP-SSTR3-GFP (green). Barra de escala: 2 μm. (K) por un algoritmo de transformación 3D 2D, la distribución espacial de densidad de probabilidad de Alexa Fluor 647-labeled AP-SSTR3-GFP en los cilios primarios a lo largo de la dimensión de R se obtuvo. Basado en la función Gaussiana, montaje, etiquetado Alexa Fluor 647 AP-SSTR3-GFP localizada principalmente en la membrana ciliar en un radio de 131±3 nm con un ancho total a media máximo (FWHM) de 24±1 nm. (L) vista corte transversal de la distribución espacial de densidad de probabilidad (nube verde) de etiquetado Alexa Fluor 647 AP-SSTR3-GFP en los cilios primarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Ubicación espacial 3D de la ruta de transporte para IFT20 dentro vivo cilios primarios asignados por microscopia velocidad. (A-C) Imagen representativa de mCherry Arl13b (A) y IFT20-GFP (B) Co expresado en una células NIH3T3 y combinado (C). El círculo (cian) indica que la ubicación de la iluminación de un solo punto de la microscopia de la velocidad en un cilio primario creció al lado de una celda (líneas discontinuas blancas) cuyos bordes están determinados por la fluorescencia de GFP IFT20 en el cuerpo de la célula y la iluminación de campo claro (no se muestra). Barra de escala: 10 distribución espacial de μm. (D) de super-resolución 2D de 286 localizaciones individuales de GFP IFT20 recogidas de un solo cilio primario. (E) por un algoritmo de transformación 3D 2D, se obtiene la distribución de densidad de probabilidad espacial de IFT20-GFP dentro de cilios primarios a lo largo de la dimensión de R. Basado en el ajuste de la función Gaussiana, IFT20-GFP sobre todo localizar en un radio de 95±1 nm con un ancho total a media máximo (FWHM) de 56±5 nm. (F) vista sección transversal de la distribución espacial de densidad de probabilidad (nubes verdes) de IFT20-GFP en los cilios primarios, con el esquema en la barra de H. escala: 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Simulación se utilizó para estimar el número mínimo de puntos 2D de una sola molécula para generar un mapa de densidad de probabilidad espacial 3D confiable para los 2D a los algoritmos de transformación 3D. (A) ubicaciones de una sola molécula generada computacionalmente la muestra al azar de una distribución normal de densidad radial centrada en 95 de 100 nm (correspondiente a la ruta de transporte principal de IFT20 determinado en nuestros experimentos). Precisión de localización de 16 nm es simulada para cada lugar de una sola molécula por muestreo de una distribución normal con σ = 16 nm. Como se muestra en la figura 2C, una rebanada muy fina (Δx) en la dimensión X se utiliza para los algoritmos de transformación y por lo tanto la dimensión de X no aparece en los lugares de una sola molécula 2D generado computacionalmente. (B) transformación entre dimensiones Y datos del proyecto y la densidad R-dimensional 3D generar histogramas de densidad R-dimensional 3D para cinco diferentes simulados conjuntos de datos (cada uno con 100 puntos). El número de arriba es la máxima posición ± error de montaje. (C-D) Resultados de la simulación basados en 250 lugares de una sola molécula. (E-F) Resultados de la simulación basados en 500 lugares de una sola molécula. (G-I) Promedio de histogramas de densidad 3D de simulaciones de 100, 250 y 500 puntos respectivamente. Barras de error representan variabilidad en las alturas de bin del histograma, mientras que el número por encima de la cima es la posición de máxima promedio ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe el uso de la microscopia de velocidad para el cilio primario, un orgánulo celular señalización que es altamente dependiente sobre el transporte eficiente de la proteína. Microscopia de velocidad puede proporcionar alta resolución ubicaciones (< 10 nm) para las moléculas marcada con fluorescencia a medida que pasan a través de la iluminación de punto único centrada en el TZ. Previamente se ha aplicado para estudiar la proteína trata mediante el NPC6,7,8. Sin embargo, se puede extender para estudiar el tráfico a través de cualquier cavidad celular secundario-difracción. Esta técnica tiene la ventaja sobre otras técnicas de imagen de alta resolución que es capaz de captar la dinámica de transporte de la proteína única en sistemas de células vivas con una resolución espacial y temporal de < 10 nm y < 2 ms, respectivamente. Otra ventaja es que uno debe solamente fluorescente marca una proteína de interés y expresar la construcción mediante transfección, un enfoque común de la biología molecular al estudio de localización de la proteína, para comenzar a realizar microscopía de velocidad. Hay que tener en cuenta que la iluminación de punto único con un láser de alta potencia es la característica que proporciona las ubicaciones de sola molécula bien separados, de alta resolución. Sin embargo, esto también limita el área de iluminación y hace que la técnica no es adecuado para la localización de campo ancho. Afortunadamente, hay muchas técnicas de super resolución de campo para investigadores elegir si se desea. Otro punto a considerar es que microscopia velocidad captura sólo lugares de movimiento de las moléculas individuales. Por lo tanto, la combinación con FRAP, que puede determinar la fracción de moléculas totales que son móviles, puede ser una adición útil al análisis.
El proceso de conversión entre el cartesiano y el sistema de coordinación cilíndrico es generar un mapa de densidad de probabilidad 3D virtual en lugar de una vista 3D basado en el seguimiento de una sola molécula 3D. En detalle, datos de microscopía electrónica han revelado que los cilios primarios tienen una estructura de simetría de rotación que podría generar una distribución uniforme de la molécula a lo largo de cierto radio. Esta distribución uniforme conduce que la distribución espacial a lo largo de la dimensión θ en el sistema cilíndrico es constante. Entonces las coordenadas 3D (X, R, θ) se pueden simplificar para las coordenadas 2D (R, X, constante). En realidad, nuestro proceso de transformación entre el cartesiano y los sistemas cilíndricos es de 2D (X, Y) 2D (R, X, constante). El θ constante, se refiere a la densidad espacial de p, se calcula utilizando la ecuación A
(figura 2). Utilizar una calculadora de matriz para calcular el vector de 
, que corresponde con las áreas de relativa entre vecinos anillos concéntricos en la sección vista6,7Aj s los sitios de interacción total en la posición j medidos directamente en experimentos; Por lo tanto, pi, la densidad de probabilidad espacial de los sitios de interacción de r, puedo calcular resolviendo la ecuación de la matriz de A.
Un paso crítico en el protocolo es reducir al mínimo cualquier perturbación de la instalación de microscopía entre la adquisición de imágenes de referencia y la video solo molécula. Si se produce cualquier movimiento, no es posible asignar con confianza los lugares sola molécula a la ultraestructura de los cilios primarios que se obtuvo a través de la proyección de imagen de epifluorescencia. Otro paso fundamental es photobleach el área de iluminación suficientemente para reducir localmente la concentración de las moléculas individuales fluorescencia marcadas pero no tanto que la población está completamente photobleached. En el caso de SSTR3, el coeficiente de difusión es lento en comparación con moléculas solubles y el movimiento de una población de las Naciones Unidas-photobleached SSTR3 moléculas hacia la zona de photobleached será más de dos minutos, el tiempo más allá de que la deriva ciliar es un factor no despreciable. Si es difícil alcanzar el nivel apropiado de fotoblanqueo y un alto nivel de fluorescencia de fondo sigue estando presente, se puede utiliza un láser de ángulo de iluminación para reducir la cantidad de fluorescencia etiquetadas moléculas individuales que se excitan por encima y por debajo de la plano de proyección de imagen. Esto reducirá el fondo y mejorar la relación señal a ruido para cada molécula individual capturado.
En Resumen, microscopia de velocidad puede implementarse fácilmente en configuraciones de microscopía convencional por la adición de una fuente de iluminación láser, espejos asociados y cámara CCD de alta velocidad. El principal avance sobre otras técnicas similares son el láser inclinado que reduce en gran medida la fluorescencia de fondo y el algoritmo de transformación de 2D a 3D que reconstruye el mapa de densidad de probabilidad espacial 3D de la solo-molécula 2D localizaciones. Desde un punto de vista biológico, no es necesario etiquetado extra además de una fluoróforo conjugada la proteína de interés. Estas características permiten la microscopia rastrear moléculas individuales con alta velocidad espaciotemporal (5-10 nm, 0.4-2 ms) resolución como ellos del tráfico a través de un secundario-micrómetro bio-cavidad o canal bio con estructuras rotationally simétricas. Junto con un algoritmo de transformación 3D de densidad de probabilidad, las rutas de transporte 3D de las proteínas etiquetadas pueden determinarse a través de la cavidad o canal. La aplicación de esta técnica se ha utilizado anteriormente para distinguir ejes 3D de proteínas y RNAs a través de la APN y, a continuación, mostramos que el transporte 3D de una proteína transmembrana, SSTR3 y una proteína citosólica, IFT20, puede lograrse en la TZ de cilios primarios. Otras técnicas de resolución super, como 3D-tormenta, han obtenido x, y, z las posiciones de las moléculas individuales mediante la colocación de una lente cilíndrica en la trayectoria óptica que crea una distorsión asimétrica de la solo-molécula PSF dependiendo de su posición por encima o por debajo de el plano focal28. Otro avance puede intentar implementar tecnología de agujero de alfiler virtual para reducir el ancho de la emisión de PSF y así aumentar la resolución aún más. Las técnicas anteriores podrían aplicarse en microscopia de velocidad muy fácilmente. En general, microscopia de velocidad proporciona un enfoque único al mismo tiempo determinar la cinética de transporte en una sola molécula plana y 3D mapa de vías de transporte con alta resolución espacio-temporal para el tráfico molecular de organelo inter o intra bajo ciertas circunstancias en sistemas de células vivas.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Agradecemos a Dr. Kristen Verhey (Universidad de Michigan, Ann Arbor) y el Dr. Gregory Pazour (Facultad de medicina de la Universidad de Massachusetts) para proporcionar algunos plásmidos. El proyecto fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud (NIH GM097037, GM116204 y GM122552 a W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
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