Summary
Nyligen kartlagt vi de tredimensionella (3D) rumsliga platserna av transportvägarna för olika proteiner translocating inuti primära cilier i levande celler. Här lever detta papper Detaljer den experimentella setup, processen för biologiska prover och dataanalyser för 3D super-upplösning fluorescensen imaging strategi nyligen tillämpats i primära cilier.
Abstract
Den primära cilier är en mikrotubulära-baserade utstick på ytan av många eukaryota celler och innehåller ett unikt komplement av proteiner som fungerar kritiskt i cell motilitet och signalering. Eftersom flimmerhåren är oförmögna att syntetisera sina egna protein, behöver nästan 200 unika ciliär proteiner vara trafikerade mellan cytosol och primära cilier. Det är dock fortfarande en teknisk utmaning att mappa tredimensionella (3D) platser för transport vägar för dessa proteiner i levande primära cilier på grund av begränsningarna i befintliga tekniker. För att erövra utmaningen, har nyligen vi utvecklat och sysselsatt en höghastighets virtuella 3D super-resolution mikroskopi, kallas enpunkts-edge-magnetiseringen sub diffraktion (hastighet) mikroskopi, för att fastställa transport vägar för 3D rumsliga position båda cytosoliska proteiner och membranproteiner i primära cilier av levande celler. I den här artikeln kommer vi att visa detaljerade inställningar för hastighet mikroskopi, beredning av celler som uttrycker fluorescens-protein-märkt ciliär proteiner, de enda-molekyl realtidsspårning av enskilda proteiner i levande cilie och prestationen av 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten kartor över transportvägar för ciliär proteiner.
Introduction
Eftersom anges av Ernst Abbe 1873, har upplösningen av konventionella ljusmikroskopi varit tros vara begränsad till ungefär 200 nm på grund av ljus diffraktion från mål1,2. För närvarande super-resolution ljusmikroskopi tekniker bryta denna begränsning och tillåta fångst av dynamiska bilder med sub diffraktion (< 200 nm) upplösning. Teknikerna generellt faller i två breda kategorier: stimulerat utsläpp utarmning (STED) mikroskopi baserat tillvägagångssätt, som genererar sub diffraktion belysning volym på grund av olinjära optiska svar av fluorophores i prover3; och photoactivated ljusmikroskopi (PALM) och stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)-baserade super resolution-teknik, som utnyttjar matematiska funktioner för att lokalisera centroids av fluorophores och sedan rekonstruera dessa centroids att bilda super-upplösning bilder4,5. För närvarande, på grund av den relativt okomplicerade optiska setup anställda PALM och STORM i stor utsträckning genom att aktivera endast en liten delmängd av fluorophores i varje bildruta i en lång video biologiska preparat. Detta möjliggör mer exakt lokalisering av 2D Gaussisk montering av fluorescerande plats, kallas den punkt sprida funktionen (PSF), av fluorescently-märkta proteiner i varje bildruta i videon. 2D platsen för varje fluorescently-märkt molekyl kan sedan vara ovanpå en enda tänkbar plan att skapa en super-upplösning bild av biologiska beredning1,2. Medan dessa singel-molekyl lokalisering, super-upplösning förhållningssätt till mikroskopi verkligen revolutionerade hur avbildning av biologiska prover utfördes, det finns fortfarande utmaningar som måste övervinnas. Till exempel kan STORM PALM uppnå sin bästa rumsliga upplösningar efter fixering av biologiska prover och därigenom presentera en statisk representation av fluorescently-märkta proteiner, som är en liknande begränsning av elektronmikroskopi. Dessutom, för att uppnå hög rumslig upplösning för varje fluorescently-märkt protein i levande celler, måste prover avbildas på mycket lång framerates som inte kan fånga protein dynamics. Det är därför nödvändigt att övervinna dessa huvudsakliga tekniska hinder.
För att erhålla en hög spatiotemporal upplösning som är väl lämpad för att påvisa snabba proteiner eller RNAs i levande celler, har vi utvecklat super-resolution mikroskopi hastighet i vårt laboratorium (figur 1)6,7, 8. flera stora tekniska framsteg i hastighet mikroskopi tidigare har aktiverat oss att framgångsrikt spåra nucleocytoplasmic transport av små molekyler, proteiner, mRNA och virus via native nukleära porstorlek komplex (NPC)6, 7 , 8. Sammanfattningsvis följande funktioner i hastighet mikroskopi används för att spåra snabbrörliga makromolekyler via sub mikrometer rotationssymmetrisk strukturer i levande celler, såsom NPC och primära cilier: (1) en lutande eller en vertikal belysning polyesterstapelfibrer möjliggör excitation av enstaka molekyler inom en liten diffraktion-limit volym i fokalplanet (figur 1). (2), lutande polyesterstapelfibrer kan kraftigt undvika out-of-fokus fluorescens och därmed förbättra signal-brus-förhållandet. (3) optiska densitet 100-500 kW / cm2 i belysningen polyesterstapelfibrer tillåter tusentals fotoner som ska samlas in från enda fluorophores med snabb detektering hastigheter (> 500 Hz). (4), snabbt upptäckten hastighet reducerar också kraftigt singel-molekyl rumsliga lokalisering felet (< 10 nm) vid fastställandet av de rumsliga banor av rörliga fluorescerande molekyler i levande celler, eftersom molekylär diffusion är en av viktigaste faktorerna orsakar ojämnheter på singel-molekyl lokalisering för att flytta molekyler. (5) väletablerade 2D till 3D transformation algoritmer kan vi ge 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten kartor över transportvägar för molekyler i NPC eller den primära cilier. Det är anmärkningsvärt att våra konverteringen mellan den kartesiska och cylindriska samordningssystem används för att generera en 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten karta i stället för 3D singel-molekyl spårning (figur 2). Elektronmikroskopi data har tidigare avslöjat att de NPC9,10 och primära cilier11 båda har en rotationssymmetrisk struktur. I princip bör slumpmässigt sprida molekyler rör sig genom den NPC eller primära cilier också ha rotationally symmetriska fördelningar. I figur 2visas ett stort antal slumpmässigt sprida molekyler inuti cylindern skulle generera rotationssymmetrisk distributioner på vyn tvärsnitt som i NPC, ytterligare resulterar i en ca enhetlig rumslig distribution inom varje liten delregion mellan två angränsande ringar (figur 2E). Denna enhetliga distribution leder att den rumsliga fördelningen längs θ dimension i cylindriska systemet är konstant. De 3D-koordinaterna (X, R, θ) kan då förenklas för att vara de 2D-koordinaterna (R, X, konstant). Egentligen är vår konverteringen mellan den kartesiska och cylindriska system från 2D (X, Y) till 2D (R, X, konstant). Den konstanta θ, hänvisar till den rumsliga density p i figur 2E, beräknas med hjälp av ekvation A
.
I slutändan, singel-molekyl spårning har bred tillämpning inom biologisk forskning, därför är det naturligt att en uppsjö av tekniker kommer att utvecklas för att fylla specifika biologiska nischer12,13,14. Så är fallet med hastighet mikroskopi. Tidigare, när tillsammans med en 3D transformation algoritm, denna teknik utvecklades lös 3D transportvägar av transiteras molekyler genom NPC, en sub-diffraction-stora och rotationally symmetriska biologiska struktur6. I detta papper visat primära cilier sig utmärkt modell organeller samt. Primära cilier är cylindriska, antenn-liknande organeller (~ 125 nm radie) att projektet från ytan av mest däggdjur celler15,16,17. De är ansvariga för att ta emot externa signaler och sända en intracellulär svar som vanligtvis förknippas med tillväxt och metabolism15,16. Därför flux av strukturella proteiner, återvinning av transmembrana receptorer, och överföring av intracellulära budbärare är vitala ansvar av primära cilier. Vid tidpunkt mellan den primära cilier och cellkroppen är en kritisk selektivitet barriär, kallas övergångszon eller TZ, genom vilken alla denna proteintransport ske11,18,19, 20. Förutom funktionen Usenets av TZ tros minst två processer, intraflagellar transport och passiv diffusion, vara ansvarig för förflyttning av protein genom denna region16,21, 22. från människors hälsa synpunkt, förlusten av primära cilier och efterföljande avregleringen av nedströms signalering är karakteristisk för många cancerformer. Dessutom är många genetiska sjukdomar, såsom Bardet-Biedl syndrom och polycystisk njursjukdom, associerade med defekt protein transport23. Både sub diffraktion begränsa storleken och den komplexa processen att selektiv proteintransport genom TZ gör den primära cilier ett favoritmål för denna teknik. I detta metoder papper, kommer vi att visa spårning av en ciliär transmembrane protein, somatostatin receptor 3 (SSTR3)24, märkt externt med Alexa Fluor 647 och en komponent i IFT, IFT2025, märkt med en smält GFP-molekyl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NIH-3T3 cell förberedelse för hastighet mikroskopi lagervara
- 1,5 veckor i förväg om experimentet, återställa en ny kultur av NIH-3T3-celler från en fryst lager av upptining vid 37 ° C och överföra cellerna till en 25 cm2 cell kultur kolv med 3 mL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 110 mg/mL natrium pyruvat, 2 mM glutamin, 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin/streptomycin.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Dela celler på 80% konfluens, om varannan dag, minst tre gånger innan experimentella dag för att säkerställa enhetligheten av cellcykeln. Trypsinize celler med 0,25% trypsin under 2 minuter vid 37 ° C, aspirera trypsin och ersätta den med 2 mL av medium. Pipett på medellång upprepade gånger för att bryta upp cell kluster, ta bort önskat antal celler och anpassa totalvolymen för media tillbaka upp till 3 mL.
Obs: NIH-3T3 var tidigare genetiskt manipulerade för att uttrycka NPHP-4, ett protein som lokaliserar till TZ26, smält på C terminus till mCherry. mCherry är en fluorophore som kan vara upphetsad med 561 nm belysning att kvantitativt lokalisera TZ selektivitet barriären och orientera den primära cilier. - Två dagar innan experimentet, plattan cellerna i en 35 mm glas botten skålen på 60-70% konfluens med 1,5 mL samma medium som steg 1,1 och återgå cellerna till inkubatorn.
- En dag innan experimentet, transfect kemiskt cellerna med önskade Plasmiden. Blanda 500-1000 ng av önskade plasmiden (se not nedan) i ett 1:2.5 förhållande med transfection reagens i 0,25 mL minskade serum media utan antibiotika för 30 min. Aspirera media från 35 mm glas botten maträtt och ersätta den med 0,25 mL plasmiden / transfection reagens mix plus en extra 1,25 mL minskade serum media utan antibiotika. Minskad serum media tjänar syftet att underlätta en framgångsrik transfection, förmå primära cilier tillväxt, samt att hålla cellerna vid liv länge nog för att utföra experiment. Återgå celler till inkubatorn för experimentet på följande dag.
Obs: När du utför singel-molekyl spårning av IFT20, en plasmid som innehåller en genetiskt modifierad IFT20 smält på sitt C-terminus till GFP är begagnade25. När du utför singel-molekyl spårning av SSTR3, en plasmid som innehåller en genetiskt modifierad SSTR3 smält på dess N-terminalen till en acceptor peptid (AP)-domän och C terminus till GFP är begagnade22. Förutom den SSTR3 konstruktionen, en plasmid som innehåller biotin ligase BirA måste uttryckas Co och transfection media måste kompletteras med 10 µM biotin. BirA fäster sedan biotin till domänen AP nyligen syntetiserade AP-SSTR3-GFP molekyler på nivån av ER. Alexa647 konjugerat till tre av de fyra biotin-bindande platserna på streptividin, i genomsnitt, kan sedan kompletteras till media före imaging fluorescently etikett AP-SSTR3-GFP molekylerna på utsidan av cellen22,27 . GFP och AlexaFluor647 används i denna metod; Övriga fluorescerande sonder kan dock användas om de har likaså hög foto-stabilitet och quantum avkastning. - Om använder den externt-märkt SSTR3 bygga, ta bort media från glas botten skålen 1 h innan experimentet, tvätta cellen 5 gånger med 1 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och tillsätt 1 mL minskade serum media kompletteras med 1 µM Alexa647 konjugerat streptividin.
- Inte mer än 15 min innan experimentet, ta bort medier från glas botten skålen och tvätta transfekterade och märkta cellerna 5 gånger med 1 mL PBS.
- Placera 1 mL imaging buffert (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) i glas botten skålen.
Obs: I imaging bufferten, cellerna är lönsamt för längre än 3 h. Därför utförs endast 2 h experiment på varje maträtt.
2. hastighet mikroskopi
Obs: Hastighet mikroskopi inställningen omfattar en inverterad fluorescens Mikroskop utrustat med en 1,4-NA 100 × Oljeimmer apokromatiska objektiv, 35 mW 633 nm han-Ne laser, 50 mW halvledar-488-nm och 561-nm Laser, en på-chip multiplikation vinst kostnad-tillsammans-enhetens kamera och en Mikroskop mjukvaran packe för datainsamling och bearbetning (figur 1). För enskild kanal imaging, GFP, mCherry och Alexa647 exciteras av 488 nm, 561 nm eller 633 nm lasrar, respektive. Enda molekyl spårning, används enda punkt belysning för att spåra enskilda fluorescently-märkta molekyler. För epifluorescence imaging placeras en konkav lins i sökvägen laser belysning att expandera balken till ett enhetlig fält av belysning. Fluorescens utsläppen är samlas in av samma mål, filtreras av ett dikroiskt filter (405/488/561/635) och ett utsläpp filter (405/488/561/635) och avbildas med ovanstående CCD kameran på 500 för enda molekyl spårning eller 2 Hz för epifluorescence imaging.
- Anbringa glas bottenplattan på scenen av Mikroskop och leta upp en cell som korrekt uttrycker önskad konstruktioner. När en lämplig cell har hittats, justera NPHP4-mCherry plats vid basen av den primära cilier med platsen på imaging planet som motsvarar laserns enda punkt belysning.
- Fånga en epifluorescence bild av NPHP4-mCherry och IFT20-GFP eller AP-SSTR3-GFP med funktionen ”Snap” i fliken ”kamera” i fönstret ”fokus” om använder digital mikroskopi programpaketet (se Tabell för material).
Obs: Dessa bilder kommer att fungera som en referens för de efterföljande enda molekyl platserna. - När referensbilder erhålls, lokalt minska koncentrationen av märkt enstaka molekyler. Foto-bleker TZ med 1 mW laser belysning för 20 s eller tills fluorescensintensiteten ligger nära bakgrunden fluorescens.
Obs: När den exakta koncentrationen kan kontrolleras, 0,1-1 nM märkt enstaka molekyler används. - För att förbereda enda molekyl spårning, minska laser belysning strömmen till ~0.15 mW för enstaka molekyler märkta med GFP eller ~0.5 mW för molekyler märkta med Alexa647.
- Så snart lasereffekten och imaging parametrar anges, maximal vinst och intensifiering och 2 ms bildhastighet, för enda molekyl imaging, engagera lämplig belysning laser och registrera icke-photobleached, märkt enstaka molekyler som de transporteras genom den photobleached regionen av TZ genom att klicka på knappen ”ström” på fliken ”kamera” i fönstret ”fokus”.
Obs: Inte mer än 2 min video bör fångas för att minimera effekterna av ciliär drift till en försumbar nivå. - Efter att fånga den enda molekyl videon, bearbeta videor med en 2D Gaussisk montering algoritm, såsom glimt av Gelles Lab, som exakt lokaliserar centroiden av varje enskild molekylens excitation polyesterstapelfibrer i ett omfattande område av intresse (AOI).
- Välj alla enda molekyl platser med precision < 10 nm och korrigera mitten av cilier baserat på fördelningen av enda molekyl platser utrustade med 2D Gaussisk funktion.
Obs: Genom att använda 2D till 3D transformation algoritm, de 3D transportvägarna av IFT20-GFP och AP-SSTR3 rutter visas tydligt på ciliär axonemal eller ciliär membran, respektive.
3. 2D till 3D Transformation
- När flera tusen lokaliseringar för transiteras molekyler (signal brus baserat > 11) i cilie samlas in, väljer du den långa axeln av cilie som X-dimensionen. Gör ett Y dimension histogram av platser och få de bin belopp i 10 nm steg.
Obs: 2D till 3D omvandling kan utvärderas av hand eller någon programvara eller programmeringsspråk. Författarna har framgångsrikt genomfört omvandlingen i både Matlab och Python 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt visar de uppgifter som erhållits från att utföra hastighet mikroskopi på TZ av primära cilier att studera transport rutten av SSTR3 ansluten av en ~ 15 nm externa länkare till Alexa647 (figur 3A). Det tjänar det dubbla syftet att verifiera 3D transformation algoritmen. Alexa647 bör endast etikett den yttre ytan av den primära cilier och därför 3D transportvägen bör avslöja en hög densitet transportsträcka på den platsen. NIH-3T3 stabilt uttrycker NPHP3-mCherry på TZ måste transfekterade med AP-SSTR3-GFP och ruvade enligt ovanstående protokoll streptividin-konjugerad Alexa647. Brett fält avbildning av mCherry etiketten används för att lokalisera TZ medan GFP används för att säkerställa att en cell har uttryckt den önska SSTR3 konstruktion. Dessutom är brett fält avbildning av den Alexa647 etiketten med 633 nm belysning nödvändigt att bekräfta att cellen har korrekt uttryckt BirA plasmiden och har absorberat tillräckligt biotin från media. Positiv bekräftelse kännetecknas av en synlig cilie skiljer sig från bakgrunden fluorescensen (figur 3B). Effektiv märkning av den AP-SSTR3-GFP konstruktionen med streptividin-konjugerad Alexa647 kan endast ske under dessa förhållanden. När positiv bekräftelse av selektiv märkning av den primära cilier av Alexa647 har erhållits, gör fotoblekning och enda punkt belysning av TZ med 633 nm laser att enstaka molekyler att visualiseras. Innan dataanalys är överlagras enda molekyl videon på brett fält belysningen en användbar valideringsstegen (figur 3C). Till exempel om lasern inte justeras korrekt, visas ingen enstaka molekyler att lokalisera tillsammans med TZ. En annan före data analys validering steg för att säkerställa en tillräcklig signal-brus-förhållande är att kontrollera intensiteten på TZ över längden av den enda molekylen video (figur 3E). Sådan analys kan utföras snabbt i ImageJ med funktionen 'Rita z axel profil'. Topparna i figur 3F motsvarar en enda molekyl på TZ utseende med en signal-brus-~ 5.0. Denna graf är också ägnad att säkerställa att tillräckligt fotoblekning har inträffat vilket framgår av väl avskilda frekvensen av enstaka molekyler. Figur 3 G visar en låg signal-brus-förhållande på < 0,5. En förklaring skulle vara att lasern inte justeras direkt på TZ. En annan orsak kan vara att laser belysning kraften är för låg. Båda förklaringar resultera i låg excitation och, därför, låga utsläpp av fluorophores på TZ. Efter dessa kontroller har gjorts, kommer att 2D Gaussisk montering av de enstaka molekylerna producera deras banor i TZ (figur 3H). Överlagras många banor kommer att producera transportvägen av märkta proteinet av intresse i TZ (figur 3jag). Eftersom 2D Gaussisk tillbehöret motsvarar pixelvärdena på detektorn, x, kan y enda molekyl data slås samman med brett fält bilden av TZ och primära cilier för att ytterligare illustrera proteinet av intresses lokalisering (figur 3J ).
IFT20 är en komponent i den IFT komplex, som bär Last längs mikrotubuli inuti primära cilier25. Arl13b-mCherry, ett protein som utbredda ciliär markör användes att märka primära cilier19. Wide-fältet epi-fluorescensmikroskopi användes till bild den primära cilier uttrycker både Arl13b-mCherry och IFT20-GFP och sedan bytte till hastighet mikroskopi att spåra enskilda IFT20-GFP proteiner i primära cilier efter en pre-fotoblekning av GFP fluorescens ner till singel-molekyl nivå inom belysning hastighet mikroskopi (figur 4A-4 C).
Så småningom, kan hundratals singel-molekyl IFT20-GFP platser med en systematisk lokalisering precision < 16 nm erhållas från den primära cilier i en levande cell (figur 4D). Enligt våra simulering, 250 enda molekyl platser med en radie av 95 nm var tillräckligt för att generera en tillförlitlig 3D transportled (figur 5). Ett slutgiltigt fastställande av IFT20-GFP transportled bygger på tusentals singel-molekyl IFT20-GFP platser samlas in från tio cilier (figur 4E). Sedan primära cilier äger en struktur med rotational symmetri, tillämpades 2D till 3D transformation algoritm till 2D beräknade data. Intressant, 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten kartlägger av IFT20 anges att endast en enda hög densitet region med en ~ 60-nm bredd nådde ~ 95 nm längs radien av primära cilier (figur 4E). Denna hög densitet region sannolikt lokaliserar tillsammans med de axonemal mikrotubuli, i samförstånd med den kända platsen av sträckan IFT (figur 4F).
Figur 1 . Förenklad Schematisk av hastighet mikroskopi. En vertikal (bana 1) eller en lutande (bana 2) punkt spridning funktion används för att belysa enda fluorophore molekyler i fokalplanet. ”d” avser avståndet mellan vertikal belysning laserstrålen som passerar genom mitten av målet och vinklad belysning vilket uppnås genom att fokusera belysning lasern på kanten av målet. Två eller flera lasrar som regleras av en optisk chopper till har en på-av magnetiseringen läge används för att spåra de enstaka molekyler som transiteras genom NPC eller den primära cilier. Av. tiden är minst tio gånger längre än fotoblekning tiden av fluorophore etiketten på riktade molekylerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Grafiska demonstration av 2D till 3D konverteringsprocessen. Scheman visar 2D till 3D transformation algoritm för molekyler, till exempel om de diffusa inom centrala lumen (A-F) eller en perifer region (G-L) i ett rör. (A) perfekt 3D rumsliga placering av slumpmässigt sprida molekyler inuti en tub kan samordnas i en cylindrisk samordningssystem (R, X, θ). I hastighet beräknas bara 3D täthet kartan slutligen från 2D rumsliga platser. Detta är dock en idealiserad fall att illustrera att 3D täthet kartan är motsvarande om de 2D eller 3D rumsliga platserna är kända. (B) 3D molekylär platser under A projiceras på ett 2D-plan i ett Cartesian samordningssystem (X, Y, Z) av mikroskopi imaging. (C) en mycket tunn skiva (Δx) skär från cylindern i A längs x dimension. (D) 3D rumsliga platser i segmentet visas i C kan projiceras inom en smal 2D region. (E) tvärsnitt Visa alla platser i den tunn skiva som visas i C. Dessa platser kan grupperas i underregionerna mellan koncentriska ringar. Med tanke på hög-nummer slumpmässigt distribuerade molekylerna i cylindern och skär väldigt tunn skiva, rumsliga tätheten av platser (pjag) i varje underregion (Si) mellan två angränsande ringar blir rotationally symmetriska och enhetlig. Dessa platser kan projiceras ytterligare till 1D längs Y dimensionen. Om platserna längs Y dimension är grupperade i ett histogram med j kolumner. Det totala antalet platser i varje kolumn (Aj) är lika med 
, som kan mätas experimentellt som visas i (F). (G-L) Liknande som ovan, omvandlingsprocessen presenteras för molekyler sprida inom en perifer region i ett rör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . 3D rumsliga läge av transportvägen för SSTR3 på levande primära cilier mappas av hastighet mikroskopi. (A) grafisk representation av hastighet mikroskopi tillämpas för spårning av GFP-märkta SSTR3 genom den TZ präglas av NPHP4-mCherry. (B) Epifluorescence bild av NPHP4-mCherry (röd), AP-SSTR3-GFP (grön), Alexa647 som brukade externt etikett AP-SSTR3-GFP (vit), och den slutliga sammanslagna bilden. Skalstapeln: 2 µm. (C) spårning av en enda Alexa 647-märkta AP-SSTR3-GFP (vit) som passerar genom fältet belysning för fyra ramar (2 ms/ram). Skalstapeln: 2 µm. (D) enda molekyl bana (vit) från (C) ovanpå epifluorescence bilden av NPHP4-mCherry (röd) och AP-SSTR3-GFP (grön). Skalstapeln: 2 µm. (E) vit streckad fyrkantig höjdpunkter området enda punkt belysning centreras på TZ. Skalstapeln: 2 µm. (F) fotonen räkna vs ram nummer grafen för en enda molekyl som video med hög signal-brus-förhållande som bestäms genom att dividera den maximala fluorescensen av den enda molekyl dividerat med den bakgrund fluorescensen. (G) fotonen räkna vs ram nummer grafen för en enda molekyl video med en låg signal-brus-förhållande. (H) bana från (E) och (D) lokaliserad i varje bildruta av 2D Gaussisk montering och ovanpå en korrekt grafisk representation av TZ, också lokaliserad genom 2D Gaussisk montering. 2D Gaussisk montering processen passar en Gaussisk funktion till X och Y dimensioner av intensitet profilen av ett område av intresse (AOI) som omfattar den enda molekylens PSF.(I) 2D super-resolution rumslig distribution av 220 enskilda Alexa Fluor 647-märkt AP-SSTR3-GFP platser samlas in från en enda primära cilier. (J) super-upplösning enda molekyl platser från (I) ovanpå epifluorescence bilden av NPHP4-mCherry (röd) och AP-SSTR3-GFP (grön). Skalstapeln: 2 µm. (K) av en 2D till 3D transformation algoritm, rumsliga sannolikhetsdensiteten fördelningen av Alexa Fluor 647-märkta AP-SSTR3-GFP på primära cilier längs dimensionen R erhölls. Baserat på Gaussisk funktion montering, Alexa Fluor 647-märkta AP-SSTR3-GFP primärt ligger på ciliär membranet på en radie av 131±3 nm med en full bredd högst hälften (FWHM) 24±1 Nm. (L) tvärsnitt Visa rumsliga sannolikhetsdensiteten fördelningen (gröna moln) av Alexa Fluor 647-märkta AP-SSTR3-GFP på primära cilier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . 3D rumsliga läge av transportvägen för IFT20 inuti levande primära cilier mappas av hastighet mikroskopi. (A-C) Representativ bild av Arl13b-mCherry (A) och IFT20-GFP (B) samarbete uttryckt i en NIH3T3 cell och den sammanslagna (C). Cirkeln (cyan) indikerar platsen för enpunkts-belysning av hastighet mikroskopi på en primära cilier växte på sidan av en cell (vita streckade linjer) vars kanter bestäms av IFT20-GFP fluorescens i cellkroppen och ljusa fält belysning (inte visas). Skalstapeln: 10 µm. (D) 2D super-resolution rumslig distribution av 286 enskilda IFT20-GFP platser samlas in från en enda primära cilier. (E) genom en 2D till 3D transformation algoritm erhålls rumsliga sannolikhetsdensiteten fördelningen av IFT20-GFP inuti primära cilier längs dimensionen R. Baserat på Gaussisk funktion montering, lokalisera IFT20-GFP primärt på en radie av 95±1 nm med en full bredd högst hälften (FWHM) 56±5 nm. (F) tvärsnitt Visa rumsliga sannolikhetsdensiteten fördelningen (gröna moln) av IFT20-GFP i primära cilier, övertäckt med schematiskt i H. skalstapeln: 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Simulering var används för att beräkna det minsta antalet 2D singel-molekyl platser att generera en tillförlitlig 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten karta för 2D till 3D transformation algoritmer. (A) 100 beräkningsmässigt genererade singel-molekyl platser slumpmässigt prov från en radiell densitet normalfördelning centrerad på 95 nm (motsvarande primära transport rutten av IFT20 bestäms i våra experiment). Lokalisering precision 16 nm simuleras för varje singel-molekyl plats genom stickprov från en normalfördelning med σ = 16 nm. Som visas i figur 2C, en mycket tunn skiva (Δx) i den X-dimensionen används för omvandling algoritmer och därför X dimensionen visas inte beräkningsmässigt genererade 2D singel-molekyl platser. (B) förändring mellan Y-dimensionell projektdata och 3D R-dimensionell densitet generera histogram av 3D R-dimensionell densiteter för fem olika simulerade data set (vardera 100 poäng). Numret ovan är den peak position ± montering fel. (C-D) Simuleringsresultaten baserat på 250 singel-molekyl platser. (E-F) Simuleringsresultaten baserat på 500 singel-molekyl platser. (G-I) Genomsnittliga 3D density histogram från 100 - 250- och 500-punkter simuleringar respektive. Felstaplar representera variationen i histogrammet bin höjderna medan numret ovanför toppen är den genomsnittliga peak position ± standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver tillämpningen av hastighet mikroskopi till den primära cilier, en cellulär signalering organell som är starkt beroende av effektiv proteintransport. HASTIGHET mikroskopi kan ge hög upplösning (< 10 nm) platser för fluorescently-märkta molekyler när de passerar genom den enda punkt belysning centreras på TZ. Den har tidigare använts för att studera proteinet människohandel genom den NPC6,7,8. Det kan dock förlängas för att studera handeln via någon sub diffraktion cellulära hålighet. Denna teknik har en fördel över andra högupplösta avbildningstekniker i att det ska kunna fånga dynamiken i enda proteintransport i levande cellsystem med rumsliga och temporal upplösning av < 10 nm och < 2 ms, respektive. En annan fördel är att man måste bara fluorescently-etikett ett protein av intresse och uttrycka bygga via transfection, en gemensam strategi för molekylärbiologi att studera protein lokalisering, börja utföra hastighet mikroskopi. Man måste hålla i minnet att den enda punkt belysningen med en högeffekts laser är funktionen som ger de väl separerade, hög upplösning enda molekyl platserna. Dock detta även begränsar området belysning och gör tekniken lämpar sig inte för brett fält lokalisering. Lyckligtvis finns det många brett fält super upplösning tekniker för utredarna att välja på om så önskas. En annan punkt att överväga är att HASTIGHETEN mikroskopi endast fångar platser flytta enstaka molekyler. Kombination med FRAP, som kan fastställa andelen av totala molekyler som är mobila, kan därför vara ett användbart tillägg till analys.
Konverteringen mellan den kartesiska och cylindriska samordningssystemet är att generera en virtuell 3D sannolikhetsdensiteten karta i stället för att en 3D-vy baserat på 3D singel-molekyl-tracking. I detalj, har elektronmikroskopi data visat att de primära Cilierna har en rotationssymmetrisk struktur som skulle kunna generera en enhetlig molekyl fördelning längs viss radie. Denna enhetliga distribution leder att den rumsliga fördelningen längs θ dimension i cylindriska systemet är konstant. De 3D-koordinaterna (X, R, θ) kan då förenklas för att vara de 2D-koordinaterna (R, X, konstant). Egentligen är vår transform process mellan den kartesiska och cylindriska system från 2D (X, Y) till 2D (R, X, konstant). Den konstanta θ, hänvisar till den rumsliga density p, beräknas med hjälp av ekvation A
(figur 2). Använd en matrix-kalkylator för att beräkna vektorn 
, vilket motsvarar med de relativa områdena mellan angränsande koncentriska ringar i tvärsnitt Visa6,7sadek totala interaktion webbplatser på position j mätt direkt från experiment; Således, pjag, rumsliga sannolikhetsdensiteten interaktion webbplatser på rjag, kan beräknas genom att lösa ekvationen matris av A.
Ett avgörande steg i protokollet är att minimera någon störning av mikroskopi setup mellan referens bild förvärv och enda molekyl video. Om någon rörelse uppstår, går det inte att tryggt mappa de enda molekyl platserna till den ultrastruktur av de primära Cilierna som erhölls via epifluorescence imaging. Ett annat viktigt steg är att photobleach området i belysning nog lokalt minska koncentrationen av fluorescently märkt enstaka molekyler men inte så mycket som befolkningen är helt photobleached. När det gäller SSTR3, den diffusionskoefficienten är långsam jämfört med lösliga molekyler och förflyttning av en befolkning på un-photobleached SSTR3 molekyler tillbaka in i photobleached-området kommer att vara längre än två minuter, den tid efter vilken ciliär drivan är en försumbar faktor. Om rätt nivå av fotoblekning är svårt att uppnå en hög nivå av bakgrunden fluorescens är fortfarande närvarande och en vinklad belysning laser kan användas för att minska mängden fluorescently märkt enstaka molekyler som är glada över och under den bildplanen. Detta kommer att minska bakgrunden och förbättra förhållandet signal-brus för varje fångade enda molekyl.
Sammanfattningsvis är hastighet mikroskopi kunna genomföras lätt på konventionella mikroskopi uppställningar genom tillsats av en laser belysning källa, associerade speglar och höghastighets CCD kamera. Den huvudsakliga befordran över andra liknande tekniker är benägen lasern som kraftigt reducerar den bakgrunden fluorescensen och 2D-till-3D transformation algoritmen som rekonstruerar 3D rumsliga sannolikhetsdensiteten kartan från 2D singel-molekylen platser. Ur biologisk synvinkel behövs ingen extra märkning förutom en fluorophore-konjugerat protein av intresse. Dessa funktioner kan HASTIGHETEN mikroskopi att spåra enstaka molekyler med hög spatiotemporal (5-10 nm, 0,4-2 ms) upplösning som de trafik genom en sub mikrometer bio-hålighet eller bio-kanal med rotationally symmetriska strukturer. Tillsammans med en 3D sannolikhetsdensiteten omvandling algoritm, kan de 3D transportvägarna av märkta proteiner bestämmas genom hålighet eller kanal. Tillämpningen av denna teknik har använts tidigare att skilja 3D transportvägar av proteiner och RNA genom NPC och, här, visar vi att 3D transport av en transmembrane protein, SSTR3 och ett cytosoliskt protein, IFT20, kan uppnås i TZ av primära cilier. Andra super upplösning tekniker, såsom 3D-STORM, erhållit x, y, z positioner för enstaka molekyler genom att placera en cylindrisk lins i den optiska vägen vilket skapar en asymmetrisk distorsion av polyesterstapelfibrer som singel-molekyl beroende på dess position ovanför eller nedanför i fokalplanet28. Ett annat framsteg får försöka genomföra virtuella pinhole-teknik för att minska bredden på utsläpp polyesterstapelfibrer och därmed öka upplösning ytterligare. De ovanstående teknikerna kunde genomföras på hastighet mikroskopi ganska lätt. Sammantaget ger hastighet mikroskopi en unik metod att samtidigt fastställa transport kinetik på singel-molekyl nivå och 3D karta över transport vägar spatiotemporal med super hög upplösning för inter - eller intra-organell molekylär människohandel under vissa omständigheter i levande cellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) och Dr Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) för att tillhandahålla vissa plasmider. Projektet stöddes av anslag från National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 och GM122552 till West).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
