Summary
Récemment, nous avons cartographié les emplacements de spatiales en trois dimensions (3D) de voies de transport pour différentes protéines translocation à l’intérieur des cils primaires dans des cellules vivantes. Ici ce détails papier expérimental, le processus d’échantillons biologiques et les analyses de données pour la fluorescence 3D Super-resolution imaging approche nouvellement appliqués en live cils primaires.
Abstract
Le cil primaire est une saillie axée sur les microtubules sur la surface de nombreuses cellules eucaryotes et contient un complément unique de protéines cette fonction critique dans la motilité cellulaire et signalisation. Étant donné que les cils sont incapables de synthétiser ses propres protéines, près de 200 protéines ciliaires uniques doivent être victimes de la traite entre le cytosol et les cils primaires. Toutefois, il est toujours un défi technique pour mapper des lieux (3D) en trois dimensions des voies de transport pour ces protéines en direct cils primaires en raison des limites existant actuellement techniques. Pour conquérir le défi, récemment nous avons développé et utilisé une microscopie haute vitesse super-résolution 3D virtuel, appelée la microscopie monopoint bord-excitation auxiliaire diffraction (vitesse), pour déterminer l’emplacement dans l’espace 3D de voies de transport pour les deux cytosolique et les protéines membranaires des cils primaires de cellules vivantes. Dans cet article, nous allons démontrer la configuration détaillée de la microscopie de vitesse, la préparation des cellules exprimant les protéines ciliaires fluorescence-protéine-marquées, le suivi en temps réel de la molécule unique de protéines individuelles en direct CIL et la réalisation de densité de probabilité spatiale 3D cartes des itinéraires de transport pour les protéines ciliaires.
Introduction
Puisqu’a déclaré Ernst Abbe en 1873, la résolution de microscopie optique conventionnelle a cru être limitée à environ 200 nm en raison de la diffraction de la lumière de l’objectif1,2. Actuellement, les techniques de microscopie photonique Super-résolution briser cette limitation et permettent la capture d’images dynamiques avec résolution diffraction subsidiaire (< 200 nm). Les techniques généralement entrent dans deux grandes catégories : stimulée par des approches d’émission épuisement (STED) microscopie basée, qui génèrent des diffraction sous illumination volume en raison de la réponse optique non linéaire de fluorophores à échantillons3; et microscopie photonique photoactivation (PALM) et microscopie de reconstruction optique stochastique (tempête)-techniques de Super-résolution, qui utilisent des fonctions mathématiques pour localiser le centre de gravité des fluorophores et ensuite reconstituer ces centroïdes basées sur pour former la Super-résolution images4,5. Actuellement, en raison de la configuration optique relativement uncomplicated, PALM et tempête beaucoup travaillent en activant uniquement un petit sous-ensemble des fluorophores dans chaque image d’une vidéo longue d’une préparation biologique. Cela permet la localisation plus précise en 2D raccord gaussienne de la tache fluorescente, appelé la fonction de point propagation (PSF), de protéines marquées fluorescent dans chaque image de la vidéo. L’emplacement 2D de chaque molécule marquée fluorescent peut ensuite être superposé sur un seul plan d’imagerie pour produire une image de Super-résolution de la préparation biologique1,2. Tandis que ces molécules simples de localisation, Super-résolution approches à la microscopie certainement a révolutionné la mode d’exécution de l’imagerie d’échantillons biologiques, il y a encore des défis à surmonter. Par exemple, STORM et PALM peuvent réaliser leurs meilleures résolutions spatiales après fixation d’échantillons biologiques et ainsi présenter une représentation statique des protéines fluorescent marqué, qui est une restriction semblable de la microscopie électronique. En outre, pour parvenir à une résolution spatiale élevée pour chaque protéine fluorescent marqué dans des cellules vivantes, des échantillons doivent être copiés à des framerates très longs qui sont incapables de saisir la dynamique des protéines. Par conséquent, il est nécessaire pour surmonter ces obstacles techniques principales.
Pour obtenir une haute résolution spatio-temporelle qui est bien adaptée pour détecter les protéines rapides ou ARN dans des cellules vivantes, nous avons développé la microscopie de Super-résolution vitesse dans notre laboratoire (Figure 1)6,,7, 8. plusieurs avancées techniques majeures en microscopie de vitesse précédemment nous ont permis de suivre avec succès les transport nucléocytoplasmique de petites molécules, protéines, ADN messagère et virus par native nucléaire pore complexes (NPC)6, 7 , 8. en bref, les fonctionnalités suivantes de microscopie de vitesse seront utilisées pour suivre les macromolécules rapides par le biais de structures cône d’éclairage symétrique sous micromètre dans des cellules vivantes, telles que les PNJ et les cils primaires : (1) une tendance ou un l’éclairage vertical PSF permet l’excitation des molécules simples dans un volume de la petite limite de diffraction dans le plan focal (Figure 1) ; (2), les fibres discontinues de polyesters incliné peut éviter grandement fluorescence out-of-focus et donc d’améliorer le rapport signal-bruit. (3), la densité optique de 100 à 500 kW / cm2 dans l’illumination PSF permet à des milliers de photons à collecter des fluorophores unique avec des vitesses de détection rapide (> 500 Hz). Vitesse de détection (4), le jeûne réduit aussi considérablement l’erreur de localisation spatiale de molécules simples (< 10 nm) pour déterminer les trajectoires spatiales des molécules fluorescentes en mouvement dans des cellules vivantes, car la diffusion moléculaire est l’un des principaux facteurs imperfections de la localisation de la molécule unique pour le déplacement des molécules à l’origine. Algorithmes de transformation (5) bien établie 2D à la 3D pour nous permettent de fournir des cartes de densité de probabilité spatiale 3D des itinéraires de transport pour les molécules dans le NPC ou cil primaire. Il convient de noter que notre processus de conversion entre le cartésien et le système de coordination cylindrique est utilisé pour générer un suivi de molécules simples densité de probabilité spatiale 3D carte plutôt que 3D (Figure 2). Auparavant, la microscopie électronique données ont révélé que le NPC9,10 et le cil primaire11 tous les deux ont une structure par rotation symétrique. En principe, diffusant au hasard des molécules se déplaçant à travers le NPC ou cil primaire devrait également avoir des distributions de cône d’éclairage symétrique. Comme illustré à la Figure 2, un nombre élevé de diffusion au hasard des molécules à l’intérieur de la bouteille générerait des distributions cône d’éclairage symétrique à la vue de coupe transversale que celle dans le NPC, encore ayant pour résultat une sensiblement uniforme spatiale distribution au sein de chaque sous-région infime entre deux anneaux voisins (Figure 2E). Cette répartition uniforme entraîne que la distribution spatiale le long de la dimension θ dans le système cylindrique est constante. Puis les coordonnées 3D (R, X, θ) peuvent être simplifiées pour les coordonnées 2D (R, X, constante). En fait, notre processus de conversion entre le cartésien et les systèmes cylindriques est de la 2D (X, Y) en 2D (R, X, constante). La constante θ, fait référence à la densité spatiale p dans la Figure 2E, est calculée en utilisant l’équation A
.
En fin de compte, suivi de la molécule unique a large application dans la recherche biologique, il est donc naturel qu’une pléthore de techniques est développée pour remplir les niches biologiques spécifiques12,13,14. Tel est le cas avec la microscopie de vitesse. Auparavant, lorsqu’il est couplé avec un algorithme de transformation 3D, cette technique a été développée pour résoudre les voies de transport 3D de molécules à travers les PNJ, une symétrie de révolution et sous-sous-diffraction-taille de la structure biologique6en transit. Dans cet article, cils primaires sont avérés organites excellent modèle aussi bien. Cils primaires sont des organites cylindriques, antenne-like (rayon de ~ 125 nm) qui projettent de la surface des cellules mammifères plus15,16,17. Ils sont responsables de recevoir des signaux externes et de transmettre une réponse intracellulaire, généralement associée à la croissance et le métabolisme15,16. Par conséquent, du flux des protéines structurales, recyclage des récepteurs transmembranaires et la transmission des messagers intracellulaires est des responsabilités vitales des cils primaires. À la jonction entre les cils primaires et le corps cellulaire est une barrière de sélectivité critique, appelée zone de transition ou TZ, grâce auquel tous les transports de cette protéine doivent avoir lieu à11,18,19, 20. En plus de la fonction blocage de la TZ, au moins deux processus de transport, intraflagellaire transport et diffusion passive, sont considérés comme responsables de la circulation des protéines à travers cette région16,,21, 22. du point de vue de la santé humaine, la perte des cils primaires et déréglementation ultérieure de la signalisation en aval est caractéristique de nombreux cancers. En outre, beaucoup de maladies génétiques, comme le syndrome de Bardet-Biedl et maladie polykystique des reins, est associés à la protéine défectueuse transport23. La taille limite de diffraction sous tant le processus complexe de transport des protéines sélectif par le biais de la TZ faire les cils primaires une cible de choix pour cette technique. Dans cet article des méthodes, nous allons démontrer le suivi d’une protéine transmembranaire ciliaire, récepteurs de la somatostatine 3 (SSTR3)24, marquées extérieurement à Alexa Fluor 647 ainsi qu’une composante de l’IFT, IFT2025, marquée avec une molécule GFP fusionnée.
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Protocol
1. NIH-3 t 3 préparation de cellules pour la microscopie de vitesse du stock
- 1,5 semaines avant l’expérience, récupérer une culture fraîche de NIH-3 t 3 cellules d’un stock congelé en dégel à 37 ° C et de transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire de2 de 25 cm avec 3 mL de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 110 mg/mL pyruvate de sodium, 2 mM de glutamine, sérum de veau fœtal 10 % et 1 % la pénicilline/streptomycine.
- Incuber les cellules à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
- Diviser les cellules à confluence de 80 %, environ tous les deux jours, au moins trois fois avant jour expérimentale afin d’assurer l’homogénéité du cycle cellulaire. Trypsinize des cellules avec de la trypsine de 0,25 % pendant 2 min à 37 ° C, aspirer la trypsine et remplacez-le par 2 mL de milieu. Pipette de la moyenne à plusieurs reprises à briser les agrégats cellulaires, enlever le nombre de cellules voulu et porter le volume total des médias en arrière jusqu'à 3 mL.
NOTE : NIH-3 t 3 ont été précédemment génétiquement modifiées pour exprimer NPHP-4, une protéine qui se localise à la TZ26, soudés à l’extrémité C terminale de mCherry. mCherry est un fluorophore qui peut être excité avec une illumination 561 nm quantitativement peut localiser la barrière de sélectivité TZ et orienter les cils primaires. - Deux jours avant l’expérience, plaque les cellules dans un fond de verre de 35 mm plat à la confluence de 60-70 % avec 1,5 mL du milieu même comme étape 1.1 et remettez les cellules dans l’incubateur.
- Un jour avant l’expérience, transfecter chimiquement les cellules avec le plasmide désiré. Mélanger 500-1000 ng de plasmide désiré (voir la Note ci-dessous) dans un rapport de 1 : 2.5 avec le réactif de transfection dans 0,25 mL de médias de sérum réduit sans antibiotiques pour 30 min. médias d’aspirer de la 35 mm verre plat bas et remplacez-le par le plasmide de 0,25 mL / mélange de réactif de transfection plus une supplémentaire 1,25 mL de médias de sérum réduit sans antibiotiques. Médias de sérum réduit vise à faciliter une transfection réussie, induisant la croissance des cils primaires, ainsi que maintenir les cellules en vie assez longtemps pour réaliser expérience. Remettez les cellules dans l’incubateur pour l’expérience le lendemain.
Remarque : Lorsque vous effectuez le suivi de simple-molécule de IFT20, un plasmide contenant qu'un IFT20 génétiquement modifiés soudés à son extrémité C terminale de GFP est utilisé25. Lorsque vous effectuez la molécule unique suivi de SSTR3, un plasmide contenant un SSTR3 génétiquement modifiés soudés à son terminus de N à un domaine de peptide (AP) accepteur et C terminus à GFP est utilisé22. En plus de la construction de SSTR3, un plasmide contenant la ligase biotine BirA doit être exprimé conjointement et les médias de transfection doivent être complétées par 10 biotine µM. BirA joint puis biotine au domaine d’AP de molécules d’AP-SSTR3-GFP nouvellement synthétisées au niveau du re. Alexa647 conjugué à trois des quatre sites biotine-liaison streptavidine, en moyenne, peut ensuite être complété à la presse avant d’imagerie à fluorescent étiquette les molécules d’AP-SSTR3-GFP sur la surface externe de la cellule22,27 . GFP et AlexaFluor647 sont utilisés dans cette méthode ; Toutefois, autres sondes fluorescentes peuvent servir s’ils ont de même photo-une stabilité élevée et quantum yield. - Si à l’aide de la construction SSTR3 marqués à l’extérieur, retirez le support du fond verre plat 1 h avant l’expérience, laver la cellule 5 fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajoute 1 mL de médias de sérum réduit additionné de 1 µM Alexa647 conjugués streptavidine.
- Pas plus de 15 min avant l’expérience, retirez le support du verre plat fond et laver les cellules transfectées et marqués 5 fois avec 1 mL de PBS.
- Placer 1 mL de tampon d’imagerie (20 mM HEPES, 110 mM KACO, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) dans le plat de fond de verre.
Remarque : Dans la mémoire tampon d’imagerie, les cellules sont viables pour ne plus que 3 h. Par conséquent, seulement 2 h d’expériences sont effectuées sur chaque plat.
2. microscopie de vitesse
Remarque : La configuration de microscopie de vitesse comprend un microscope à fluorescence inversé équipé d’un objectif apochromatique de 1,4-NA 100 ×-immersion dans l’huile, 35 laser de He-Ne mW à 633 nm, 50 mW à l’état solide 488 nm et 561 nm lasers, un gain de multiplication sur puce charge-coupled device caméra et un progiciel de microscope pour l’acquisition de données et de traitement (Figure 1). Pour l’imagerie par voie individuelle, GFP, mCherry et Alexa647 sont excités par 488 nm, 561 nm ou lasers à 633 nm, respectivement. Pour le suivi de la molécule unique, éclairage point unique est utilisé pour suivre des molécules individuelles marquées fluorescent. Pour l’imagerie de fluorescence incidente, une lentille concave est placée dans le chemin d’illumination laser à étendre le faisceau dans un champ uniforme d’illumination. L’émission de fluorescence est recueillies par le même objectif, filtrée par un filtre dichroïque (405/488/561/635) et un filtre d’émission (405/488/561/635) et imagées avec la caméra CCD ci-dessus fonctionnant à 500 Hz pour le suivi de la molécule unique ou 2 Hz pour imagerie de fluorescence incidente.
- Apposer la plaque de fond de verre sur la scène du microscope et localiser une cellule qui exprime bien les constructions désirées. Une fois qu’une cellule appropriée a été trouvée, aligner la tache NPHP4-mCherry à la base des cils primaires avec l’emplacement sur le plan d’imagerie qui correspond à l’éclairage seul point laser.
- Capturer une image de fluorescence incidente de NPHP4-mCherry et IFT20-GFP ou AP-SSTR3-GFP en utilisant la fonction « Snap » dans l’onglet « Appareil photo » de la fenêtre de « Focus » commandes si vous utilisez le progiciel microscopie numérique (voir Table des matières).
NOTE : Ces images agira comme une référence pour les emplacements de la molécule unique ultérieures. - Une fois que les images de référence sont obtenues, localement de réduire la concentration de molécules uniques marqués. Photo-eau de Javel le TZ avec 1 éclairage de laser mW pendant 20 s ou jusqu'à ce que l’intensité de la fluorescence est proche de celle de la fluorescence de fond.
Remarque : Lorsque la concentration précise peut être contrôlée, 0,1-1 nM étiqueté molécules simples sont utilisés. - Pour se préparer pour le suivi de la molécule unique, réduire la puissance d’illumination laser à ~0.15 mW pour des molécules simples étiqueté avec GFP ou ~0.5 mW pour des molécules marquées avec Alexa647.
- Dès que la puissance du laser et l’imagerie des paramètres sont ensemble, gain maximum et intensification et cadence de 2 ms, pour l’imagerie de la molécule unique, engager le laser éclairage approprié et d’enregistrer des non-photobleached, étiqueté molécules simples qui sont transportés par le biais de la région de photobleached de la TZ en cliquant sur le bouton « Stream » dans l’onglet « Appareil photo » de la fenêtre « Mise au point des commandes ».
Remarque : Pas plus de 2 min de vidéo devraient être saisie afin de minimiser les effets de la dérive ciliaire à un niveau négligeable. - Après la capture de la vidéo de la molécule unique, traiter les vidéos à l’aide d’un algorithme d’ajustement gaussien 2D, telles que l’aperçu par le laboratoire de Gelles, qui justement se localise le centre de gravité de l’excitation de chaque molécule fibres discontinues de polyesters dans une zone englobante d’intérêt (AOI).
- Sélectionnez tous les emplacements de la molécule unique avec une précision < 10 nm et rectifier le Centre des cils basé sur la distribution des molécules simples emplacements équipé d’une fonction gaussienne 2D.
Remarque : En utilisant 2D pour l’algorithme de transformation 3D, les itinéraires 3D des itinéraires IFT20-GFP et AP-SSTR3 sont clairement montrées sur membrane axonème ou ciliaire ciliaire, respectivement.
3. 2D à 3D Transformation
- Une fois plusieurs mille localisations pour transiter des molécules (signal/bruit ratio > 11) dans le CIL sont recueillies, sélectionnez l’axe longitudinal du CIL comme X-dimension. Faire un histogramme de dimension Y des emplacements et d’obtenir les sommes bin incréments de 10 nm.
Remarque : La 2D à la 3D transformation peuvent être évalués à la main ou n’importe quel logiciel ou langage de programmation. Les auteurs ont mené à bien la transformation en Matlab et Python 2.7.
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Representative Results
Cette section illustre les données obtenues de l’exécution de microscopie de vitesse à la TZ de cils primaires pour étudier l’itinéraire de transport de SSTR3 relié par un linker externe de ~ 15 nm à Alexa647 (Figure 3A). Il a pour double objectif de la vérification de l’algorithme de transformation 3D. Alexa647 ne doit être l’étiquette de la surface extérieure du cil primaire et par conséquent, l’itinéraire de transport 3D devrait révéler un itinéraire de transport haute densité à cet endroit. NIH-3 t 3 NPHP3-mCherry à la TZ exprimant de manière stable doit être transfectées avec AP-SSTR3-GFP et incubé selon le protocole ci-dessus avec conjugué streptavidine Alexa647. L’imagerie grand champ de l’étiquette de mCherry est utilisé pour localiser le TZ, tandis que la GFP est utilisée pour garantir qu’une cellule a exprimé la construction SSTR3 désirée. En outre, l’imagerie grand champ de l’étiquette de Alexa647 en 633 nm éclairage est nécessaire pour confirmer que la cellule a bien exprimé le plasmide BirA et a absorbé suffisamment biotine dans les médias. Confirmation positive se caractérise par un cil visible distinct de la fluorescence de fond (Figure 3B). Un étiquetage efficace de la construction de l’AP-SSTR3-GFP avec conjugué streptavidine Alexa647 ne peut se produire dans ces conditions. Une fois obtenue une confirmation positive de marquage sélectif du cil primaire de Alexa647, photobleaching et illumination de point unique de la TZ avec un laser à 633 nm permettra des molécules simples à visualiser. Avant l’analyse des données, superposant la vidéo seule molécule sur l’éclairage grand champ est une étape de validation utile (Figure 3C). Par exemple, si le laser n’est pas bien aligné, sans molécules simples apparaîtra à localiser conjointement avec le TZ. Une autre étape de la validation données pré analyse afin d’assurer un ratio signal-bruit adéquat est de vérifier l’intensité à la TZ sur toute la longueur de la molécule unique vidéo (Figure 3E). Une telle analyse peut être effectuée rapidement dans ImageJ en utilisant la fonction « tracer le profil d’axe z ». Les pics dans la Figure 3F correspondant à l’apparition d’une seule molécule à la TZ avec un signal-bruit du ~ 5. 0. Ce graphique est également capable d’assurer qu’assez photoblanchiment a eu lieu comme en témoigne la fréquence bien séparée des molécules simples. Figure 3 G montre un faible ratio signal-bruit de < 0,5. Une explication serait que le laser n’est pas aligné directement sur le TZ. Une autre raison peut être que la puissance d’éclairage de laser est trop faible. Les deux explications entraînent excitation faible et, par conséquent, faible émission des fluorophores à la TZ. Après que ces contrôles ont été effectués, 2D raccord gaussienne des molécules simples produiront leurs trajectoires dans le TZ (Figure 3H). Superposer plusieurs trajectoires produira l’itinéraire de transport de la protéine marquée d’intérêt dans le TZ (Figure 3j’ai). Puisque le montage gaussien 2D correspond à la valeur des pixels sur le détecteur, le x, données seule molécule y peuvent être fusionnées avec l’image grand champ des TZ et cils primaires pour mieux illustrer la protéine de la localisation de l’intérêt (Figure 3J ).
IFT20 est une composante de l’IFT complexe, qui transporte des marchandises le long des microtubules à l’intérieur de cils primaires25. Arl13b-mCherry, une protéine marqueur ciliaire largement utilisé a été utilisé pour étiqueter des cils primaires19. Microscopie à champ large épifluorescente a été utilisée afin d’imager le cil primaire exprimant les Arl13b-mCherry et IFT20-GFP et puis passer à la microscopie de vitesse pour effectuer le suivi des protéines IFT20-GFP individuelles dans les cils primaires après un pré-photoblanchiment de GFP fluorescence jusqu’au niveau de la molécule unique dans le domaine de l’éclairage de la microscopie de vitesse (Figure 4A-4 C).
Par la suite, des centaines de lieux IFT20-GFP molécule unique avec une précision de localisation systématique de < 16 nm peuvent provenir de cil primaire d’une cellule direct (Figure 4D). Selon notre simulation, 250 simples lieux de la molécule avec un rayon de 95 nm a été suffisant pour générer un itinéraire de transport fiable de 3D (Figure 5). Une décision définitive de l’itinéraire de transport IFT20-GFP est basée sur des milliers d’endroits IFT20-GFP de molécules simples récoltés dix cils (Figure 4E). Puisque les cils primaires possèdent une structure avec une symétrie rotationnelle, la 2D à l’algorithme de transformation 3D a été appliquée aux données projetées 2D. Fait intéressant, les cartes de densité de probabilité spatiale 3D de IFT20 a indiqué que seulement une seule région Haute densitée avec une largeur d’environ 60 nm a culminé à environ 95 nm le long du rayon des cils primaires (Figure 4E). Cette région de haute densitée probable se localise conjointement avec les microtubules axonème, en accord avec l’emplacement connu de l’itinéraire de l’IFT (Figure 4F).
Figure 1 . Schéma simplifié de la microscopie vitesse. Une verticale (voie 1) ou une fonction de propagation point incliné (chemin 2) est utilisée pour illuminer les molécules fluorophore seul dans le plan focal. « d » désigne la distance entre le faisceau de laser éclairage vertical qui traverse le centre de l’objectif et l’illumination oblique qui est obtenue en mettant l’accent l’illumination laser sur le bord de l’objectif. Deux ou plusieurs lasers réglementées par un hacheur optique d’avoir un mode de marche-arrêt de l’excitation sont utilisés pour suivre les molécules simples qui transitent par les PNJ ou cil primaire. Le temps d’arrêt est au moins dix fois plu que le temps de photoblanchiment de l’étiquette de fluorophore sur les molécules ciblées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Une démonstration graphique 2D au processus de conversion 3D. Schémas démontrent la 2D à l’algorithme de transformation 3D de molécules, par exemple, s’ils diffusent dans la lumière centrale (A-F) ou une région périphérique (G-L), d’un tube. (A) les meilleurs emplacements spatiales 3D de diffuser au hasard des molécules à l’intérieur d’un tube peuvent être coordonnés dans un système de coordination cylindriques (R, X, θ). En vitesse, seulement la carte de densité 3D au bout du compte est calculée qu’à partir les emplacements spatiaux 2D. Il s’agit cependant d’un cas idéal pour illustrer que la carte de densité 3D est l’équivalent si les emplacements spatiaux 2D ou 3D sont connus. (B) les emplacements moléculaires 3D en A sont projetées sur un plan 2D dans un système de coordination cartésiennes (X, Y, Z) par imagerie microscopie. (C) une très fine tranche (Δx), coupez le cylindre en A le long dimension x. (D) les emplacements spatiales 3D dans la tranche montré C peuvent être projetées dans une région étroite 2D. (E) vue de coupe transversale de tous les endroits dans la fine tranche montré C. Ces emplacements peuvent être regroupés dans les sous-régions entre les anneaux concentriques. Étant donné les nombre élevé de molécules distribués aléatoirement dans le cylindre et la coupe très fine tranche, la densité spatiale des lieux (pje) dans chaque sous-région (Si) entre deux anneaux voisins soient par rotation symétriques et homogènes. Ces emplacements peuvent être projetées plus loin en 1D le long de la dimension Y. Si les emplacements le long de la dimension Y sont groupés dans un histogramme avec des colonnes j. Le nombre total d’endroits dans chaque colonne (Aj) est égal à 
, qui peut être mesuré expérimentalement comme indiqué au point F. (G-L) Similaires comme ci-dessus, le processus de transformation est présenté pour les molécules diffusant au sein d’une région périphérique d’un tube. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Emplacement spatial 3D de l’itinéraire de transport pour SSTR3 sur live cils primaires mappé par microscopie vitesse. (A) représentation graphique de microscopie de vitesse appliquée au suivi de GFP-étiquetée SSTR3 par le biais de la TZ marquée par NPHP4-mCherry. (B) épifluorescence image de NPHP4-mCherry (rouge), AP-SSTR3-GFP (green), Alexa647 utilisé pour étiqueter externe AP-SSTR3-GFP (blanc) et l’image fusionnée finale. Echelle : 2 µm. (C) suivi d’un seul marqué Alexa 647 AP-SSTR3-GFP (blanc) qui traverse le champ d’éclairage point pour quatre images (2 ms/frame). Echelle : 2 µm. (D) seule molécule trajectoire (blanc) de (C) superposé à l’image de fluorescence incidente de NPHP4-mCherry (rouge) et AP-SSTR3-GFP (vert). Echelle : 2 µm. blanc (E) pointillés carrés faits saillants, la zone d’illumination de point unique centrée sur le TZ. Echelle : 2 µm. (F) Photon comte vs, châssis numéro graphique pour une seule molécule de vidéo avec un haut rapport signal sur bruit déterminé en divisant la fluorescence maximale de la molécule unique, divisée par la fluorescence de fond. (G) photon comte vs chassis numéro graphique pour une seule molécule de vidéo avec un faible rapport signal sur bruit. (H) la trajectoire de (E) et (D) localisés dans chaque cadre de montage gaussien 2D et superposée à une représentation graphique précise de la TZ, également localisé en installant gaussien 2D. Le processus d’ajustement gaussien 2D correspond à une fonction gaussienne pour les dimensions X et Y du profil d’une zone d’intérêt (AOI) englobant la distribution spatiale de Super-résolution 2D PSF.(I) de la molécule unique de 220 individuels intensité marqué Alexa Fluor 647 AP-SSTR3-GFP emplacements prélevé un seul cil primaire. (J) Super-résolution seule molécule emplacements de (I) superposés à l’image de fluorescence incidente de NPHP4-mCherry (rouge) et AP-SSTR3-GFP (vert). Echelle : µm 2. (K) par un algorithme de transformation 3D en 2D, la distribution de densité de probabilité spatiale de marqué Alexa Fluor 647 AP-SSTR3-GFP sur cils primaires selon la dimension R a été obtenue. Basé sur une fonction gaussienne d’ajustage, marqués à l’Alexa Fluor 647 AP-SSTR3-GFP principalement situé sur la membrane ciliaire dans un rayon de 131±3 nm avec une pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) de 24±1 nm. (L) vue de la coupe transversale de la distribution de densité de probabilité spatiale (Nuage vert) d’Alexa Fluor 647 marquée AP-SSTR3-GFP sur cils primaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Emplacement spatial 3D de l’itinéraire de transport pour IFT20 à l’intérieur direct cils primaires mappé par microscopie vitesse. (A-C) Image représentative de Arl13b-mCherry (A) et IFT20-GFP (B) conjointement exprimée dans une cellules NIH3T3 and the fusionnée (C). Le cercle (cyan) indique l’emplacement de l’éclairage ponctuel de microscopie de vitesse sur un cil primaire a progressé sur le côté d’une cellule (lignes pointillées blanches) dont les bords sont déterminés par fluorescence IFT20-GFP dans le corps cellulaire et l’éclairement lumineux zone (pas montré). Barre d’échelle : 10 µm. (D) 2D Super-résolution distribution spatiale des 286 emplacements individuels de IFT20-GFP prélevé un seul cil primaire. (E) par une 2D à l’algorithme de transformation 3D, on obtient la distribution de densité de probabilité spatiale de IFT20-GFP à l’intérieur des cils primaires selon la dimension de R. Basé sur le raccord de la fonction gaussienne, IFT20-GFP localiser principalement dans un rayon de 95±1 nm avec une pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) de 56±5 nm. (F) vue de coupe transversale de la distribution de densité de probabilité spatiale (nuages verts) de IFT20-GFP dans des cils primaires, superposées avec le schéma dans la barre d’échelle H. : 100 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Simulation a permis d’estimer le nombre minimal d’emplacements de molécules simples 2D pour générer une carte de densité de probabilité spatiale 3D fiable pour la 2D avec les algorithmes de transformation 3D. (A) les 100 lieux de molécule unique généré par le calcul l’échantillon au hasard d’une distribution normale de densité radiale centrée à 95 nm (correspondant à l’itinéraire de transport primaire de IFT20 déterminé dans nos expériences). Précision de localisation de 16 nm est simulé pour chaque emplacement de molécules simples par échantillonnage d’une distribution normale avec σ = 16 nm. Tel qu’illustré en Figure 2C, une très fine tranche (Δx) dans la dimension X est utilisé pour des algorithmes de transformation et donc la dimension X ne figure pas dans les emplacements des molécules simples 2D généré par le calcul. (B) transformation entre les données de projet Y-dimensionnelles et densité R-dimensionnel 3D génèrent des histogrammes des densités de R-dimensionnel 3D pour cinq ensembles de données simulées différentes (chacune avec 100 points). Le nombre ci-dessus est le pic position ± erreur de montage. (C-D) Résultats de simulation basés sur 250 sites de molécules simples. (E-F) Résultats de simulation basés sur 500 emplacements de molécules simples. (G-I) Moyenne des histogrammes 3D densité issues de simulations de 100, 250 et 500 points respectivement. Barres d’erreur représentent la variabilité dans les hauteurs de bin histogramme tandis que le nombre au-dessus de la crête est l’écart-type ± pointe moyenne position. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit l’application de la microscopie de vitesse pour le cil primaire, un organite cellulaire de signalisation qui est fortement tributaire de transport des protéines efficaces. Microscopie de vitesse peut fournir des emplacements (< 10 nm) pour des molécules marquées fluorescent haute résolution lorsqu’ils traversent l’éclairage seul point centré sur le TZ. Auparavant, il a été appliqué à l’étude de la protéine le trafic à travers les NPC6,7,8. Toutefois, il peut être prolongé afin d’étudier le trafic par le biais de toute cavité cellulaire de diffraction sous. Cette technique a un avantage sur les autres techniques d’imagerie à haute résolution, car il est capable de capturer la dynamique du transport des protéines unique dans les systèmes de cellules vivantes avec une résolution spatiale et temporelle de < 10 nm et < 2 ms, respectivement. Un autre avantage est que l'on doit seul fluorescent-label une protéine d’intérêt et exprimer la construction par l’intermédiaire de transfection, une approche commune de la biologie moléculaire à l’étude de localisation des protéines, pour commencer l’exécution de microscopie de vitesse. Il faut garder à l’esprit que l’illumination de point unique avec un laser de haute puissance est la fonctionnalité qui contient les adresses de molécule unique bien séparées à haute résolution. Toutefois, cette aussi limite le domaine de l’éclairage et la technique ne convient pas pour la localisation de grand champ. Heureusement, il existe de nombreuses techniques de résolution super de grand champ pour les enquêteurs à choisir si vous le souhaitez. Un autre point à considérer est que microscopie vitesse saisit uniquement les emplacements de déplacement des molécules simples. Par conséquent, association avec la PAF, qui permet de déterminer la fraction des molécules totales qui sont mobiles, peut être un complément utile à l’analyse.
Le processus de conversion entre le cartésien et le système de coordination cylindrique est de générer une carte de densité de probabilité 3D virtuel plutôt que d’une vue 3D basé sur le tracking 3D de molécules simples. En détail, la microscopie électronique données ont révélé que les cils primaires ont une structure cône d’éclairage symétrique qui pourrait générer une distribution de la molécule uniforme le long de certain rayon. Cette répartition uniforme entraîne que la distribution spatiale le long de la dimension θ dans le système cylindrique est constante. Puis les coordonnées 3D (R, X, θ) peuvent être simplifiées pour les coordonnées 2D (R, X, constante). En fait, notre processus de transformation entre le cartésien et les systèmes cylindriques est de la 2D (X, Y) en 2D (R, X, constante). La constante θ, fait référence à la densité spatiale p, est calculée en utilisant l’équation A
(Figure 2). Utiliser une calculatrice de matrices pour calculer le vecteur 
, qui correspond avec les surfaces relatives entre voisins des anneaux concentriques dans la section affichage6,7sAj les sites d’interaction total à la position j mesuré directement à partir des expériences ; Ainsi, pi, la densité de probabilité spatiale des sites interaction à ri, peuvent être calculée en résolvant l’équation matricielle de A.
Une étape cruciale dans le protocole est de minimiser toute perturbation de l’installation de microscopie entre l’acquisition d’images de référence et la seule molécule de vidéo. En cas de tout mouvement, il n’est pas possible de mapper avec confiance les emplacements de la molécule à l’ultrastructure des cils primaires qui fut obtenu par imagerie de fluorescence incidente. Une autre étape essentielle est de photobleach de la région d’éclairement assez pour réduire localement la concentration des molécules simples fluorescent étiquetés mais pas tant que la population n’est complètement photobleached. Dans le cas de SSTR3, le coefficient de diffusion est lent par rapport aux molécules solubles et le mouvement d’une population de molécules SSTR3 ONU-photobleached dans la zone de photobleached sera plu de deux minutes, le temps au-delà duquel la dérive ciliaire est un facteur non négligeable. Si le niveau correct de photoblanchiment est difficile à atteindre et un niveau élevé de la fluorescence de fond est toujours présent, un laser d’angle d’illumination peut-être servir à réduire la quantité de fluorescent étiquetés molécules simples qui sont excités au-dessus et au-dessous de la plan de l’imagerie. Cela réduira l’arrière-plan et améliorer le rapport signal-bruit pour chaque molécule capturé.
En résumé, microscopie de vitesse est capable d’être facilement mis en œuvre sur des configurations de microscopie conventionnelle par l’ajout d’une source d’illumination laser, miroirs associés et caméra haute vitesse CCD. Le progrès principal au cours d’autres techniques similaires sont le laser incliné, ce qui réduit considérablement la fluorescence de fond et l’algorithme de transformation de la 2D à 3D qui reconstitue la carte de densité de probabilité spatiale 3D de la molécule unique 2D emplacements. D’un point de vue biologique, aucun étiquetage supplémentaire outre une fluorophore conjugué protéine d’intérêt n’est nécessaire. Ces fonctionnalités permettent la microscopie suivre les molécules simples avec haute vitesse spatio-temporelle (5 à 10 nm, 0,4-2 ms) résolution comme ils trafic par un micromètre Sub bio-cavité ou bio-canal avec les structures de la symétrie de révolution. Couplé avec un algorithme de transformation de densité de probabilité 3D, les voies de transport 3D des protéines Tags peuvent être déterminées grâce à la cavité ou canal. L’application de cette technique a été précédemment utilisée pour distinguer les voies de transport 3D des protéines et des ARN par le biais de la PNC et, ici, nous montrons que le transport 3D d’une protéine transmembranaire, SSTR3 et une protéine cytosolique, IFT20, peut être atteint dans le TZ de cils primaires. Ont obtenu des autres techniques de super résolution, comme 3D-tempête, x, y, positions de z pour des molécules simples en plaçant une lentille cylindrique dans le chemin optique qui crée une distorsion asymétrique de la FSP seule molécule selon sa position au-dessus ou en dessous le plan focal28. Une autre avancée peut tenter d’intégrer la technologie virtual sténopé pour réduire la largeur de l’émission de fibres discontinues de polyesters et ainsi augmenter la résolution encore plus loin. Les techniques ci-dessus pourraient être appliquées sur la microscopie de vitesse assez facilement. Globalement, la microscopie vitesse fournit une approche unique pour déterminer simultanément cinétique du transport à molécule unique carte 3D et de niveau des voies de transport avec super-haute résolution spatio-temporelle pour inter - ou intra-organite trafic moléculaire dans certaines circonstances dans les systèmes de cellules vivantes.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) et Dr Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) pour fournir certains plasmides. Le projet a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 et GM122552 à W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
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