Summary
Recentemente abbiamo mappato le posizioni spaziali (3D) tridimensionale delle vie di trasporto per varie proteine dispostamento all'interno ciliari in cellule vive. Qui questo dettagli di carta la messa a punto sperimentale, il processo di campioni biologici e l'analisi dei dati per la fluorescenza 3D Super-resolution imaging approccio appena applicati in live ciliari.
Abstract
Il cilio primario è una protrusione microtubule-basato sulla superficie di molte cellule eucariotiche e contiene un unico complemento delle proteine tale funzione criticamente nella motilità cellulare e di segnalazione. Poiché le ciglia sono incapaci di sintetizzare le proprie proteine, quasi 200 unici ciliare proteine devono essere oggetto di traffico tra il citosol e ciglia primarie. Tuttavia, è ancora una sfida tecnica per mappare le tridimensionale (3D) posizioni delle vie di trasporto per queste proteine in vivo ciliari a causa delle limitazioni attualmente esistenti tecniche. Per vincere la sfida, recentemente abbiamo sviluppato e impiegato una microscopia ad alta super-risoluzione 3D virtuale ad alta velocità, definita microscopia Sub-diffrazione (velocità) singolo punto bordo-eccitazione, per determinare la posizione spaziale 3D delle vie di trasporto per entrambi citosolici e proteine di membrana in ciglia primarie di cellule vive. In questo articolo, ci dimostrerà la configurazione dettagliata di microscopia di velocità, la preparazione delle cellule che esprimono proteine ciliari fluorescenza-proteina-identificate, l'inseguimento in tempo reale di singola molecola di singole proteine in vivo Cilio e il raggiungimento di densità di probabilità spaziale 3D mappe delle vie di trasporto per le proteine ciliari.
Introduction
Quanto affermato da Ernst Abbe nel 1873, la risoluzione di microscopia chiara convenzionale è stata creduta di essere limitato a circa 200 nm a causa della diffrazione della luce dall' obiettivo1,2. Attualmente, le tecniche di microscopia di Super-risoluzione rompono questa limitazione e permettono di catturare immagini dinamiche con risoluzione sub-diffrazione (< 200 nm). Le tecniche rientrano generalmente in due grandi categorie: stimolato gli approcci di microscopia basata di svuotamento (STED) emissione, che generano volume di illuminazione di Sub-diffrazione dovuto la risposta ottica non lineare di fluorofori in campioni3; e fotoattivazione microscopia (PALM) e microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM)-basato su tecniche di Super-risoluzione, che utilizzano funzioni matematiche per localizzare i centroidi di fluorofori e quindi ricostituire questi centroidi per formare super-risoluzione immagini4,5. Attualmente, a causa del relativamente semplice setup ottico, PALM e tempesta sono ampiamente impiegati attivando solo un piccolo sottoinsieme di fluorofori in ogni fotogramma di un video lungo di una preparazione biologica. Questo consente per la localizzazione più precisa di raccordo 2D gaussiana dello spot fluorescente, definito la funzione di diffusione del punto (PSF), di proteine fluorescente etichettati in ogni fotogramma del video. La posizione 2D di ogni molecola fluorescente etichettati quindi possa essere sovrapposti su un unico piano di formazione immagine per produrre un'immagine di Super-risoluzione del biologico preparazione1,2. Mentre questi localizzazione singola molecola, approcci di Super-risoluzione per la microscopia certamente rivoluzionato come imaging di campioni biologici è stata eseguita, ci sono ancora sfide da superare. Ad esempio, tempesta e PALM può raggiungere i loro migliori risoluzioni spaziali dopo la fissazione dei campioni biologici e presentano quindi una rappresentazione statica delle proteine con etichetta fluorescente, che è una limitazione simile di microscopia elettronica. Inoltre, per ottenere un'alta risoluzione spaziale per ogni proteina fluorescente-labeled in cellule vive, i campioni devono essere imaged al framerate molto lungo che non sono in grado di catturare proteina dinamiche. Pertanto, è necessario per superare questi ostacoli tecnici principali.
Per ottenere un'alta risoluzione spazio-temporale che è particolarmente adatta per la rilevazione di proteine veloci o RNA in cellule vive, abbiamo sviluppato la microscopia di Super-risoluzione velocità nel nostro laboratorio (Figura 1)6,7, 8. diverse importanti progressi tecnici nella microscopia di velocità precedentemente ci hanno permesso di monitorare con successo trasporto nucleocytoplasmic di piccole molecole, proteine, mRNA e virus tramite nativo nucleare poro complessi (NPC)6, 7 , 8. brevemente, le seguenti funzionalità di microscopia di velocità verrà utilizzata per tenere traccia di macromolecole veloci attraverso le strutture simmetria rotazionale sub-micrometrica in cellule vive, come NPC e ciglia primarie: (1) un inclinato o un illuminazione verticale PSF consente l'eccitazione di singole molecole all'interno di un volume piccolo limite di diffrazione nel piano focale (Figura 1); (2), il PSF inclinato può evitare notevolmente out-of-focus fluorescenza e quindi migliorare il rapporto segnale-rumore. (3), la densità ottica di 100-500 kW / cm2 nell'illuminazione PSF permette a migliaia di fotoni per essere raccolti dal singolo fluorofori con velocità veloce rilevamento (> 500 Hz). Velocità di rilevazione (4), il digiuno inoltre notevolmente riduce l'errore di localizzazione spaziale di singola molecola (< 10 nm) nel determinare le traiettorie spaziali di molecole fluorescenti in movimento in cellule vive, perché la diffusione molecolare è uno dei principali fattori causando le imperfezioni della singola molecola localizzazione per lo spostamento di molecole. Algoritmi di trasformazione (5) ben consolidate 2D a 3D ci permettono di fornire mappe di densità di probabilità spaziale 3D delle vie di trasporto per le molecole in NPC o il cilio primario. È interessante nota che il nostro processo di conversione tra il cartesiano e il sistema di coordinamento cilindrico viene utilizzato per generare una densità di probabilità spaziale 3D mappa anziché 3D tracking della singola molecola (Figura 2). In precedenza, dati di microscopia elettronica hanno rivelato che la NPC9,10 e il cilio primario11 entrambi hanno una struttura simmetria rotazionale. In linea di principio, in modo casuale diffondere molecole si muove attraverso il NPC o il cilio primario dovrebbe anche avere distribuzioni simmetriche rotazionale. Come illustrato nella Figura 2, un elevato numero di molecole all'interno del cilindro di diffusione in modo casuale genererebbe simmetriche rotazionale distribuzioni la vista di sezione trasversale come quello nel NPC, ulteriore conseguente un circa uniforme spaziale distribuzione all'interno di ogni sub-regione molto piccola tra due anelli adiacenti (Figura 2E). Questa distribuzione uniforme porta che la distribuzione spaziale lungo dimensione θ nel sistema cilindrico è costante. Quindi le coordinate 3D (X, R, θ) possono essere semplificate per essere le coordinate 2D (R, X, costante). In realtà, il nostro processo di conversione tra il cartesiano e i sistemi cilindrici è da 2D (X, Y) a 2D (R, X, costante). Il θ costante, la densità spaziale p in Figura 2,Esi riferisce, viene calcolata utilizzando l'equazione A
.
In ultima analisi, rilevamento di singola molecola ha un'ampia applicazione nella ricerca biologica, così, è naturale che una pletora di tecniche sarà sviluppata per riempire nicchie biologiche specifiche12,13,14. Tale è il caso con microscopia di velocità. In precedenza, quando accoppiato con un algoritmo di trasformazione 3D, questa tecnica è stata sviluppata per risolvere i percorsi di trasporto 3D di transito attraverso gli NPC, una struttura biologica rotationally simmetrici e sub diffraction-dimensioni6molecole. In questa carta, ciglia primarie è dimostrato di essere organelli eccellente modello pure. Ciliari sono cilindrici, antenna-come organelli (raggio di ~ 125 nm) che proiettano dalla superficie delle cellule più mammiferi15,16,17. Sono responsabili per la ricezione di segnali esterni e trasmettere una risposta intracellulare in genere associata a crescita e metabolismo15,16. Di conseguenza, flusso di proteine strutturali, riciclo di recettori transmembrana e trasmissione di messaggeri intracellulari è responsabilità vitale delle ciglia primarie. Nel punto di giunzione tra le ciglia primarie e il corpo cellulare è una barriera di selettività critico, chiamata la zona di transizione o TZ, attraverso il quale tutto questo trasporto di proteine deve verificarsi11,18,19, 20. Oltre alla funzione di gating del TZ, almeno due processi di trasporto, trasporto intraflagellare e diffusione passiva, si pensiero siano responsabili del movimento della proteina attraverso questa regione16,21, 22. dal punto di vista della salute umana, la perdita delle ciglia primarie e conseguente deregolamentazione di segnalazione a valle è caratteristica di molti cancri. Inoltre, molte malattie genetiche, come la sindrome di Bardet-Biedl e malattia del rene policistico, sono associati con proteina difettosa trasporto23. Sia la dimensione del limite di Sub- diffrazione e il complesso processo di trasporto selettivo di proteine attraverso la TZ rendono le ciglia primarie un obiettivo primario per questa tecnica. In questa carta di metodi, dimostreremo il tracciamento di una proteina transmembrana ciliare, recettore della somatostatina 3 (SSTR3)24, etichettati esternamente con Alexa Fluor 647 e un componente dell'IFT, IFT2025, etichettati con una molecola GFP fusa.
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Protocol
1. NIH 3T3-preparazione delle cellule per microscopia di velocità da stock
- 1,5 settimane in anticipo l'esperimento, recuperare una coltura fresca delle cellule NIH 3T3 da uno stock congelato scongelamento a 37 ° C e trasferendo le cellule di un matraccio di cultura cellulare2 25 cm con 3 mL dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) addizionata di 110 mg/mL piruvato di sodio, la glutamina 2mm, 10% siero bovino fetale e 1% di penicillina/streptomicina.
- Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
- Dividere le celle al confluency di 80%, circa ogni due giorni, almeno tre volte prima di giorno sperimentale per garantire omogeneità del ciclo cellulare. Tripsinizzano cellule con tripsina 0,25% per 2 min a 37 ° C, aspirare tripsina e sostituirlo con 2 mL di terreno. Pipetta il medium più volte per spezzare mazzi delle cellule, rimuovere il numero di celle desiderato e portare il volume totale dei media indietro fino a 3 mL.
Nota: NIH-3T3 precedentemente erano geneticamente per esprimere NPHP-4, una proteina che si localizza alla TZ26, fusa al capolinea C a mCherry. mCherry è un fluoroforo che possa essere eccitato con illuminazione a 561 nm per localizzare quantitativamente la barriera di selettività TZ e orientare le ciglia primarie. - Due giorni prima dell'esperimento, piastra le cellule in un fondo di vetro 35mm piatto al confluency di 60-70% con 1,5 mL di terreno stesso come passo 1.1 e restituiscono le cellule nell'incubatore.
- Un giorno prima dell'esperimento, transfect chimicamente le cellule con il plasmide desiderata. Mescolare 500-1000 ng del plasmide desiderato (vedere la Nota qui sotto) in un rapporto di 1: 2,5 con reagente di transfezione in 0,25 mL di media riduttori del siero senza antibiotici per 30 min media aspirato da 35 mm vetro piatto fondo e sostituirlo con il plasmide di 0,25 mL / mix di reagente di transfezione più un extra 1,25 mL di media riduttori del siero senza antibiotici. Riduttore del siero media serve allo scopo facilitare una successo transfezione, che inducono la crescita di ciglia primarie, come pure mantenere le cellule viva abbastanza a lungo per eseguire l'esperimento. Riporre le cellule nell'incubatore per l'esperimento il giorno seguente.
Nota: Quando si esegue il rilevamento di singola molecola di IFT20, un plasmide contenente che un IFT20 geneticamente fuso al suo capolinea C GFP è usato25. Durante l'esecuzione di singola molecola rilevamento di SSTR3, un plasmide contenente un SSTR3 geneticamente fuso al suo capolinea N a un dominio di peptide (AP) acceptor e C terminale GFP è usato22. Oltre il costrutto SSTR3, un plasmide contenente la ligasi di biotina BirA deve essere co-espressi e i media di transfezione deve essere integrati con la biotina 10 µM. BirA attribuisce quindi biotina al dominio AP di recentemente sintetizzati molecole AP-SSTR3-GFP a livello dell'ER. Alexa647 coniugato a tre dei quattro siti di biotina-legante su streptavidina, in media, quindi può essere completata ai media prima di imaging a fluorescente etichetta le molecole di AP-SSTR3-GFP sulla superficie esterna della cella22,27 . GFP e AlexaFluor647 vengono utilizzati in questo metodo; Tuttavia, altre sonde fluorescenti possono essere utilizzate se hanno similmente alta fotostabilità e resa quantistica. - Se utilizzando il costrutto SSTR3 etichettati esternamente, rimuovere il supporto dal fondo di vetro piatto 1 h prima di esperimento, lavare la cella 5 volte con 1 mL di tampone fosfato salino (PBS) e aggiunta 1 mL di siero riduttore terreno completati con 1 µM Alexa647 coniugato streptavidina.
- Non più di 15 min prima dell'esperimento, rimuovere il supporto dal vetro piatto fondo e lavare le cellule trasfettate ed etichettate 5 volte con 1 mL di PBS.
- Posizionare 1 mL di tampone di imaging (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) nel piatto fondo di vetro.
Nota: Nel buffer di imaging, le cellule sono vitali per non più di 3 h. Di conseguenza, solo 2 h di esperimenti vengono eseguite su ogni piatto.
2. microscopia di velocità
Nota: L'impostazione della velocità della microscopia include un microscopio di fluorescenza invertito dotato di un obiettivo apocromatico di 1,4-NA 100 × immersione in olio, un 35 mW 633 nm laser a He-Ne, 50 mW 488 nm e 561 nm laser a stato solido, un guadagno di moltiplicazione su chip charge-coupled device fotocamera e un pacchetto di software di microscopio per acquisizione dati ed elaborazione (Figura 1). Per l'imaging di singolo canale, GFP, mCherry e Alexa647 sono eccitati da 488 nm, 561 nm, o 633 nm laser, rispettivamente. Per il rilevamento di singola molecola, unico punto illuminazione viene utilizzato per tenere traccia di singole molecole fluorescente etichettati. Per l'imaging di epifluorescenza, una lente concava viene inserita nel percorso di illuminazione laser per espandere il raggio in un campo uniforme di illuminazione. Le emissioni di fluorescenza sono raccolti dall'obiettivo stesso, filtrate da un filtro dicroico (405/488/561/635) e un filtro di emissione (405/488/561/635) e ripreso con la telecamera sopra a 500 Hz per l'inseguimento di singola molecola o 2 Hz per formazione immagine di epifluorescenza.
- Appone la piastra inferiore di vetro sul palco del microscopio e individuare una cellula che esprime correttamente i costrutti desiderati. Una volta che è stato trovato un cellulare adeguata, allineare la macchia NPHP4-mCherry alla base delle ciglia primarie con la posizione sul piano formazione immagine che corrisponde all'illuminazione di singolo punto del laser.
- Acquisire un'immagine di epifluorescenza del NPHP4-mCherry e IFT20-GFP o AP-SSTR3-GFP utilizzando la funzione "Snap" nella scheda "Fotocamera" della finestra "Focus controlli" se utilizza il pacchetto software di microscopia digitale (Vedi Tabella materiali).
Nota: Queste immagini agirà come un riferimento per le posizioni successive singola molecola. - Una volta ottenute le immagini di riferimento, localmente di ridurre la concentrazione di molecole singole con etichettate. Foto-candeggina la TZ con illuminazione di laser 1 mW per 20 s o fino a quando l'intensità di fluorescenza è vicina a quella di fluorescenza di fondo.
Nota: Quando la concentrazione precisa può essere controllata, 0.1-1 nM etichettato singole molecole sono utilizzati. - Per preparare per il rilevamento di singola molecola, ridurre la potenza di illuminazione del laser a ~0.15 mW per singole molecole etichettati con GFP o ~0.5 mW per molecole etichettata con Alexa647.
- Non appena la potenza del laser e parametri di imaging sono insieme, guadagno massimo e intensificazione e 2 ms frame rate, per l'imaging di singola molecola, coinvolgere il laser illuminazione appropriata e registrare non-photobleached, etichettato singole molecole che vengono trasportati attraverso la regione di photobleached del TZ facendo clic sul pulsante "Flusso" nella scheda "Fotocamera" della finestra "Controlli di messa a fuoco".
Nota: Non più di 2 min di video devono essere acquisite per ridurre al minimo gli effetti di deriva ciliare ad un livello trascurabile. - Dopo la cattura del video di singola molecola, elaborare i video utilizzando un algoritmo di raccordo gaussiana 2D, come scorcio dal laboratorio Gelles, che localizza con precisione il centroide di eccitazione di ogni singola molecola PSF in un'area che comprenda di interesse (AOI).
- Selezionare tutte le posizioni di singola molecola con precisione < 10 nm e correggere il centro delle ciglia basato sulla distribuzione delle posizioni di singola molecola dotata di una funzione gaussiana 2D.
Nota: Utilizzando 2D all'algoritmo di trasformazione 3D, 3D trasporto visualizzati i percorsi delle vie IFT20-GFP e AP-SSTR3 sono chiaramente sulla membrana ciliare axonemal o ciliare, rispettivamente.
3. 2D a 3D trasformazione
- Una volta mille diverse localizzazioni per molecole (segnale-rumore rapporto > 11) in transito nel Cilio sono raccolti, è possibile selezionare l'asse lungo del cilio come la dimensione X. Fare un istogramma di dimensione Y delle posizioni e procurarsi le somme bin in incrementi di 10 nm.
Nota: Da 2D a 3D trasformazione possono essere valutati da mano o qualsiasi software o linguaggio di programmazione. Gli autori hanno implementato con successo la trasformazione in Matlab e Python 2.7.
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Representative Results
Questa sezione illustra i dati ottenuti dall'esecuzione di microscopia di velocità presso la TZ delle ciglia primarie per studiare il percorso di trasporto di SSTR3 collegato da un linker esterno di nm ~ 15 a Alexa647 (Figura 3A). Esso ha il duplice scopo di verificare l'algoritmo di trasformazione 3D. Alexa647 dovrebbe solo etichetta la superficie esterna del cilio primario e di conseguenza, la via di trasporto 3D dovrebbe rivelare una via di trasporto ad alta densità in quella posizione. NIH-3T3 che esprimono stabilmente NPHP3-mCherry presso la TZ deve essere transfected con AP-SSTR3-GFP e incubate secondo il protocollo sopra con streptavidina coniugata Alexa647. Imaging a grande campo dell'etichetta mCherry utilizzata per localizzare il TZ mentre la GFP è utilizzata per assicurare che una cellula ha espresso il costrutto SSTR3 desiderato. Inoltre, ampio campo imaging dell'etichetta Alexa647 usando l'illuminazione di 633 nm è necessario confermare che la cellula ha espresso correttamente il plasmide di BirA e ha assorbito sufficiente biotina da parte dei media. Conferma positiva è caratterizzata da un visibile Cilio distinto dalla fluorescenza di fondo (Figura 3B). Etichettatura efficiente del costrutto AP-SSTR3-GFP con streptavidina coniugata Alexa647 può verificarsi solo in queste condizioni. Una volta ottenuta la conferma positiva di etichettatura selettiva del cilio primario di Alexa647, unico punto illuminazione del TZ con un laser di 633 nanometro e photobleaching permetterà singole molecole possano essere visualizzati. Prima analisi dei dati, sovrapponendo il video di singola molecola l'illuminazione del campo largo è un passo di convalida utile (Figura 3C). Ad esempio, se il laser non è allineato correttamente, non singole molecole sembrano co-localizza con la TZ. Un altro passo di convalida di analisi di pre-dati per assicurare un adeguato rapporto segnale-rumore è quello di controllare l'intensità alla TZ oltre la lunghezza della singola molecola dei video (Figura 3E). Tale analisi può essere eseguita rapidamente in ImageJ utilizzando la funzione 'plot profilo asse z'. I picchi nella Figura 3F corrispondono alla comparsa di una singola molecola presso la TZ con un segnale-rumore di ~ 5.0. Questo grafico è anche in grado di garantire che si è verificato abbastanza photobleaching come testimoniano la frequenza ben separata delle singole molecole. Figura 3 G viene illustrato un rapporto segnale-rumore basso di < 0,5. Una spiegazione potrebbe essere che il laser non è allineato direttamente su TZ. Un altro motivo potrebbe essere che la potenza di illuminazione del laser è troppo bassa. Entrambe le spiegazioni provocare eccitazione bassa e, pertanto, bassa emissione di fluorofori presso la TZ. Dopo aver effettuate queste verifiche, raccordo 2D gaussiana delle singole molecole produrrà loro traiettorie in TZ (Figura 3H). La sovrapposizione di molte traiettorie produrrà l'itinerario di trasporto della proteina con etichetta di interesse per la TZ (Figura 3io). Poiché il 2D raccordo gaussiano corrisponde per i valori dei pixel del rivelatore, la x, y dati di singola molecola possono essere fusa con l'immagine di campo largo della TZ e ciglia primarie per illustrare ulteriormente la proteina della localizzazione di interesse (Figura 3J ).
IFT20 è un componente di IFT complessi, che trasporta il carico lungo i microtubuli all'interno ciliari25. Arl13b-mCherry, una proteina marker ciliare ampiamente utilizzato è stato usato per etichettare ciliari19. Microscopia a largo campo epi-fluorescenza è stata utilizzata all'immagine il cilio primario che esprimono sia Arl13b-mCherry e IFT20-GFP e poi passare alla microscopia di velocità per tenere traccia di singole proteine IFT20-GFP in ciglia primarie dopo un pre-photobleaching di GFP fluorescenza fino a livello di singola molecola in zona illuminazione di microscopia di velocità (Figura 4A-4 C).
Alla fine, centinaia di singola molecola IFT20-GFP località con una precisione di localizzazione sistematica di < 16 nm possa essere ricavati il cilio primario di una cellula viva (Figura 4D). Secondo la nostra simulazione, 250 singole posizioni della molecola con un raggio di 95 nm è stato sufficiente a generare un percorso di trasporto affidabile 3D (Figura 5). Una determinazione finale del percorso di trasporto IFT20-GFP si basa su migliaia di singola molecola IFT20-GFP posizioni raccolti da dieci ciglia (Figura 4E). Poiché ciliari possiedono una struttura con simmetria rotazionale, il 2D all'algoritmo di trasformazione 3D è stato applicato i 2D dati proiettati. Interessante, le mappe di densità di probabilità spaziale 3D di IFT20 indicato che solo una singola regione ad alta densità con una larghezza di ~ 60-nm raggiunse la ~ 95 nm lungo il raggio delle ciglia primarie (Figura 4E). Questa regione ad alta densità probabile co-localizza con i microtubuli axonemal, in accordo con la posizione nota del percorso IFT (Figura 4F).
Figura 1 . Schema semplificato di velocità microscopia. Una verticale (percorso 1) o una funzione di diffusione del punto inclinato (percorso 2) è utilizzata per illuminare il fluoroforo singole molecole nel piano focale. "d" si riferisce alla distanza tra il raggio laser illuminazione verticale che passa attraverso il centro dell'obiettivo e illuminazione angolata che si ottiene mettendo a fuoco il laser illuminazione sul bordo dell'obiettivo. Due o più laser regolato da un chopper ottico avere una modalità di accensione-spegnimento eccitazione vengono utilizzati per monitorare le singole molecole che transitano attraverso il png o il cilio primario. Il tempo di spegnimento è almeno dieci volte più del tempo di photobleaching dell'etichetta fluoroforo sulle molecole mirate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Dimostrazione grafica 2D al processo di conversione 3D. Schemi dimostrano il 2D all'algoritmo di trasformazione 3D per molecole, ad esempio, se si diffondono all'interno il lume centrale (A-F) o di una regione periferica (G-L) di un tubo. (A) ideale posizioni spaziali 3D in modo casuale diffondere molecole all'interno di un tubo possono essere coordinate in un sistema di coordinamento cilindriche (R, X, θ). In velocità, solo la mappa di densità 3D in definitiva viene calcolata dalle posizioni spaziali 2D. Tuttavia, questo è un caso idealizzato per illustrare che la mappa di densità 3D è equivalente se sono note le posizioni spaziali 2D o 3D. (B) le posizioni molecolare 3D in un sono proiettati su un piano 2D in un sistema di coordinamento cartesiane (X, Y, Z) da formazione immagine di microscopia. (C) una fetta molto sottile (Δx) tagliato dal cilindro nel A lungo x dimensione. (D) le posizioni spaziali 3D nella sezione indicato in C possono essere proiettate all'interno di una stretta regione 2D. (E) vista sezione trasversale di tutte le località nella fetta sottile mostrato nella C. Queste posizioni possono essere raggruppate in sub-regioni tra anelli concentrici. Dato le molecole di alta-numero distribuite casualmente nel cilindro e la fetta tagliata molto sottile, la densità spaziale dei luoghi (pio) in ogni sub-regione (Si) tra due anelli vicini sarà rotazionalmente simmetrico e uniforme. Queste posizioni possono essere ulteriormente proiettate in 1D lungo la dimensione Y. Se le posizioni lungo la dimensione Y sono raggruppate in un istogramma con colonne j. Il numero totale di posizioni in ogni colonna (Aj) è uguale a 
, che può essere misurato sperimentalmente, come mostrato in (F). (G-L) Simile come sopra, il processo di trasformazione è presentato per molecole di diffusione all'interno di una regione periferica di un tubo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Posizione spaziale 3D dell'itinerario di trasporto per SSTR3 su live ciliari mappato da microscopia velocità. (A) rappresentazione di microscopia di velocità applicata al rilevamento della GFP-etichettato SSTR3 attraverso la TZ segnata da NPHP4-mCherry. (B) epifluorescenza immagine di NPHP4-mCherry (rosso), AP-SSTR3-GFP (green), Alexa647 usato per etichettare esternamente AP-SSTR3-GFP (bianco) e l'immagine risultante dalla fusione finale. Barra della scala: 2 µm. (C) rilevamento di un singolo con etichetta Alexa 647 AP-SSTR3-GFP (bianco) che passa attraverso il campo di illuminazione del punto per quattro fotogrammi (2 ms/telaio). Barra della scala: 2 µm. (D) singola molecola traiettoria (bianco) da (C) si sovrappone l'immagine di epifluorescenza di NPHP4-mCherry (rosso) e AP-SSTR3-GFP (green). Barra della scala: 2 µm. (T) bianco tratteggiata quadrati evidenzia l'area di illuminazione unico punto centrato sul TZ. Barra della scala: 2 µm. (F) del fotone conteggio vs telaio numero grafico per una singola molecola dei video con un alto rapporto segnale-rumore determinato dividendo la fluorescenza massima della singola molecola divisa per la fluorescenza di fondo. (G) del fotone conteggio vs telaio numero grafico per una singola molecola dei video con un basso rapporto segnale-rumore. (H) traiettoria da (E) e (D) localizzata in ciascun frame di montaggio gaussiana 2D e sovrapposta su un'accurata rappresentazione grafica del TZ, anche localizzata da 2D raccordo gaussiana. Il processo di adattamento gaussiana 2D si inserisce una funzione gaussiana per le dimensioni X e Y del profilo intensità di un'area di interesse (AOI) che comprende la distribuzione spaziale di singola molecola PSF.(I) 2D Super-risoluzione di 220 individuali con etichetta Alexa Fluor 647 AP-SSTR3-GFP posizioni raccolti da un singolo cilio primario. (J) Super-risoluzione singola molecola posizioni da (I) si sovrappone l'immagine di epifluorescenza di NPHP4-mCherry (rosso) e AP-SSTR3-GFP (green). Barra della scala: 2 µm. (K) di un 2D all'algoritmo di trasformazione 3D, la distribuzione di densità di probabilità spaziale di Alexa Fluor 647-labeled AP-SSTR3-GFP su ciglia primarie lungo la dimensione di R è stata ottenuta. Basato su funzione gaussiana raccordo, Alexa Fluor 647-labeled AP-SSTR3-GFP principalmente localizzati sulla membrana ciliare ad un raggio di 131±3 nm con una larghezza a metà altezza (FWHM) di 24±1 nm. (L) vista su ciglia primarie sezione trasversale la distribuzione di densità di probabilità spaziale (nuvola verde) di Alexa Fluor 647-labeled AP-SSTR3-GFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Posizione spaziale 3D dell'itinerario di trasporto per IFT20 all'interno di live ciliari mappato da microscopia velocità. (A-C) Immagine rappresentativa di Arl13b-mCherry (A) e IFT20-GFP (B) co-espressi in delle cellule NIH3T3 e l'unita (C). Il cerchio (ciano) indica che la posizione del singolo punto illuminazione di microscopia di velocità su un cilio primario è cresciuto sul lato di una cella (linee bianche tratteggiate) i cui bordi sono determinati dalla fluorescenza IFT20-GFP nel corpo cellulare e illuminazione in campo chiaro (non mostrato). Barra della scala: 10 µm. (D) 2D ad alta super-risoluzione distribuzione spaziale delle 286 singole località IFT20-GFP raccolti da un singolo cilio primario. (E) di un 2D all'algoritmo di trasformazione 3D, la distribuzione di densità di probabilità spaziale di IFT20-GFP dentro ciliari lungo la dimensione di R è ottenuta. Basato su raccordo funzione gaussiana, IFT20-GFP individuare principalmente ad un raggio di 95±1 nm con una larghezza a metà altezza (FWHM) di 56±5 nm. (F) vista sezione trasversale della distribuzione spaziale densità di probabilità (verde nuvole) di IFT20-GFP in ciliari, overlaid con lo schema in scala H. bar: 100 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Simulazione è stata usata per stimare il numero minimo di percorsi di singola molecola 2D per generare una mappa di densità di probabilità spaziale 3D affidabile per 2D a algoritmi di trasformazione 3D. (A) 100 ubicazioni di singola molecola informaticamente generate del campione in modo casuale da una distribuzione normale densità radiale centrata a 95 nm (corrispondente al percorso di trasporto primario di IFT20 determinato nei nostri esperimenti). Precisione di localizzazione di 16 nm è simulato per ogni posizione di singola molecola di campionamento da una distribuzione normale con σ = 16 nm. Come illustrato nella Figura 2C, una fetta molto sottile (Δx) nella dimensione X è utilizzata per gli algoritmi di trasformazione e pertanto la dimensione X non viene visualizzata nelle posizioni generate informaticamente 2D singola molecola. (B) trasformazione tra progetto Y-dimensioni e densità R-dimensionale 3D generare istogrammi delle densità R-dimensionale 3D per cinque set di dati simulati diversi (ciascuno con 100 punti). Il numero è la posizione di picco ± errore di montaggio. (C-D) Risultati di simulazione basati su 250 sedi di singola molecola. (E-F) Risultati di simulazione basati su 500 sedi di singola molecola. (G-I) Media rispettivamente gli istogrammi 3D densità da 100, 250 e 500-punti simulazioni. Barre di errore rappresentano la variabilità nelle altezze bin istogramma mentre il numero sopra il picco è la posizione di punta media ± deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive l'applicazione di microscopia di velocità per il cilio primario, un organello di segnalazione cellulare che è altamente affidamento sul trasporto efficiente della proteina. Microscopia di velocità in grado di fornire alta risoluzione posizioni (< 10 nm) per molecole fluorescente etichettati come passano attraverso l'illuminazione di singolo punto centrato su TZ. In precedenza è stato applicato per studiare la proteina traffico attraverso il NPC6,7,8. Tuttavia, esso può essere prorogato per studiare il traffico attraverso qualsiasi cavità di Sub-diffrazione cellulari. Questa tecnica ha un vantaggio rispetto ad altre tecniche di imaging ad alta risoluzione in quanto è in grado di catturare le dinamiche di trasporto singola proteina nei sistemi cellulari dal vivo a una risoluzione spaziale e temporale di < 10 nm e < 2 ms, rispettivamente. Un altro vantaggio è che uno deve solo fluorescente-etichetta una proteina di interesse ed esprimono il costrutto tramite transfezione, un approccio comune di biologia molecolare per studiare la localizzazione della proteina, per iniziare ad esibirsi microscopia di velocità. Si deve tenere a mente che l'unico punto di illuminazione con un laser ad alta potenza è la funzionalità che fornisce i percorsi di singola molecola ben separati, ad alta risoluzione. Tuttavia, questo inoltre limita l'area di illuminazione e rende la tecnica non adatta per la localizzazione di ampio campo. Fortunatamente, ci sono molte tecniche di risoluzione super ampio campo per gli investigatori da scegliere se si desidera. Un altro punto da considerare è che la microscopia velocità acquisisce solo posizioni di singole molecole in movimento. Pertanto, la combinazione con FRAP, che può determinare la frazione di molecole totale che sono mobili, può essere un'aggiunta utile all'analisi.
Il processo di conversione tra il cartesiano e il sistema di coordinamento cilindrica è di generare una mappa di densità di probabilità 3D virtuale piuttosto che una vista 3D basata su tracking 3D di singola molecola. In dettaglio, dati di microscopia elettronica hanno rivelato che le ciglia primarie hanno una struttura simmetria rotazionale che potrebbe generare una distribuzione uniforme della molecola lungo certo raggio. Questa distribuzione uniforme porta che la distribuzione spaziale lungo dimensione θ nel sistema cilindrico è costante. Quindi le coordinate 3D (X, R, θ) possono essere semplificate per essere le coordinate 2D (R, X, costante). In realtà, il nostro processo di trasformazione tra il cartesiano e i sistemi cilindrici è da 2D (X, Y) a 2D (R, X, costante). Il θ costante, si riferisce alla densità spaziale p, viene calcolata utilizzando l'equazione A
(Figura 2). Utilizzare una calcolatrice di matrice per calcolare il vettore 
, che corrisponde con le zone relative fra confinanti anelli concentrici in sezione trasversale vista6,7Aj s i siti di interazione totale presso il j di posizione misurata direttamente dagli esperimenti; Così, pho, la densità di probabilità spaziale dei siti di interazione presso rio, posso essere calcolata risolvendo l'equazione di matrice di A.
Un passo fondamentale nel protocollo è di minimizzare qualsiasi perturbazione dell'installazione microscopia tra l'acquisizione di immagini di riferimento e la singola molecola dei video. In caso di qualsiasi movimento, non è possibile eseguire il mapping con fiducia le posizioni di singola molecola l'ultrastruttura delle ciglia primarie che è stata ottenuta tramite immagini epifluorescenza. Un altro passo fondamentale è quello di photobleach l'area di illuminazione abbastanza per ridurre localmente la concentrazione di una singola molecola fluorescente identificati ma non così tanto che la popolazione è completamente photobleached. Nel caso di SSTR3, il coefficente di diffusione è lento rispetto alle molecole solubili e il movimento di una popolazione di molecole SSTR3 ONU-photobleached nuovamente dentro l'area di photobleached sarà più di due minuti, il tempo oltre il quale la deriva ciliare è un fattore non trascurabile. Se il livello corretto di photobleaching è difficile da raggiungere e un elevato livello di fluorescenza di fondo è ancora presente, un laser illuminazione angolata può essere utilizzato per ridurre la quantità di una singola molecola fluorescente contrassegnati che sono eccitati sopra e sotto la aereo di imaging. Questo ridurrà lo sfondo e migliorare il rapporto segnale-rumore per ogni singola molecola catturato.
In sintesi, la microscopia di velocità è in grado di essere facilmente implementato su configurazioni di microscopia convenzionale con l'aggiunta di una sorgente di illuminazione laser, specchi associati e telecamera CCD ad alta velocità. Il principale progresso rispetto alle altre tecniche simili sono il laser inclinato che riduce notevolmente la fluorescenza di fondo e l'algoritmo di trasformazione 2D-3D che ricostruisce la mappa di densità di probabilità spaziale 3D dalla singola molecola 2D posizioni. Dal punto di vista biologico, nessuna etichettatura supplementare oltre una fluoroforo-coniugato proteina di interesse è necessario. Queste caratteristiche permettono la microscopia tenere traccia di singole molecole con alta velocità spatiotemporal (5-10 nm, 0,4-2 ms) risoluzione come traffico attraverso una sub-micrometriche bio-cavità o bio-canale con strutture rotationally simmetriche. Accoppiato con un algoritmo di trasformazione 3D densità di probabilità, le vie di trasporto 3D delle proteine con tag possono essere determinate attraverso la cavità o canale. L'applicazione di questa tecnica è stato precedentemente utilizzato per distinguere le vie di trasporto 3D di proteine ed RNA attraverso il NPC e, qui, ci mostrano che il trasporto 3D di una proteina transmembrana, SSTR3 e una proteina citosolica, IFT20, può essere raggiunta in TZ di ciliari. Altre tecniche di risoluzione super, come 3D-tempesta, hanno ottenuto x, y, z posizioni per singole molecole inserendo una lente cilindrica nel cammino ottico che crea una distorsione asimmetrica di singola molecola FPF a seconda della sua posizione sopra o sotto il piano focale28. Un altro progresso potrebbe tentare di implementare la tecnologia virtuale pinhole per ridurre la larghezza dell'emissione PSF e quindi aumentare ulteriormente la risoluzione. Tecniche di cui sopra potrebbero essere attuate su microscopia velocità abbastanza facilmente. Nel complesso, microscopia di velocità fornisce un approccio unico nel determinare contemporaneamente cinetica di trasporto a singola molecola livello e 3D mappa delle vie di trasporto con super-alta risoluzione spazio-temporale per traffico molecolare di inter - o intra-organello in determinate circostanze in sistemi di cellule vive.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il dottor Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) e Dr. Gregory Pazour (Università del Massachusetts Medical School) per la fornitura di alcuni plasmidi. Il progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 e GM122552 a WY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
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