Summary
Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.
Abstract
O cílio primário é uma protrusão do microtubule-baseado na superfície de muitas células eucarióticas e contém um único complemento de proteínas que funcionam criticamente em motilidade celular e sinalização. Desde que cílios são incapazes de sintetizar suas próprias proteínas, cerca de 200 proteínas ciliares originais precisam ser traficadas entre o citosol e cílios primários. No entanto, ainda é um desafio técnico para mapear tridimensional (3D) locais, das vias de transporte para estas proteínas em cílios primários ao vivo devido às limitações do atualmente existente técnicas. Para conquistar o desafio, recentemente desenvolvemos e empregou uma microscopia 3D de alta velocidade virtual Super-resolução, denominada microscopia difração sub (velocidade) de single-point da borda-excitação, para determinar a localização espacial 3D das vias de transporte para ambos citosólico e proteínas de membrana em cílios primários de células vivas. Neste artigo, vamos demonstrar a configuração detalhada da microscopia de velocidade, a preparação de celulas que expressam proteínas ciliares fluorescência-proteína-labeled, o acompanhamento em tempo real do único-molécula de proteínas individuais no cílio ao vivo e a realização de densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para proteínas ciliares.
Introduction
Como afirmado por Ernst Abbe em 1873, a resolução da microscopia de luz convencional foi crida para ser limitada a aproximadamente 200 nm devido à difração de luz do objectivo1,2. Atualmente, as técnicas de microscopia de luz de super-resolução quebrar essa limitação e permitam a captura de imagens dinâmicas, com resolução de difração sub (< 200 nm). As técnicas geralmente caem em duas categorias amplas: estimulada abordagens de microscopia com base de depleção (STED) emissão, que geram o volume de iluminação sub difração devido à resposta óptica não-linear de fluorophores em amostras3; e (palma), microscopia de luz fotoativo e microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade)-com base em técnicas de super-resolução, que utilizam funções matemáticas para localizar os centroides de fluorophores e então reconstituir essas centroides para formar imagens de super-resolução4,5. Atualmente, devido a configuração óptica relativamente uncomplicated, PALM e tempestade são extensivamente empregados ativando apenas um pequeno subconjunto de fluorophores em cada quadro de um vídeo longo de uma preparação biológica. Isto permite a localização mais exata por 2D montagem Gaussian da mancha fluorescente, denominado a função de ponto de espalhar (PSF), das proteínas fluorescente-etiquetadas em cada quadro do vídeo. A localização 2D de cada molécula fluorescente-etiquetadas então pode ser sobreposta a um único avião de imagens para produzir uma imagem de super-resolução da preparação biológica1,2. Enquanto estes localização único-molécula, abordagens de super-resolução para microscopia certamente revolucionaram como imagem latente de amostras biológicas foi executada, ainda existem desafios a serem vencidos. Por exemplo, tempestade e PALM podem alcançar seus melhores resoluções espaciais após a fixação de amostras biológicas e, portanto, apresentar uma representação estática das proteínas fluorescente-etiquetadas, que é uma limitação similar de microscopia eletrônica. Além disso, para atingir a alta resolução espacial para cada proteína fluorescente-etiquetadas em células vivas, amostras devem ser fotografadas no framerates há muito tempo que são incapazes de capturar a dinâmica da proteína. Portanto, é necessário superar estes obstáculos técnicos principais.
Para obter uma alta resolução spatiotemporal que é adequada para a detecção de proteínas ou RNAs de movimento rápido em células vivas, nós desenvolvemos microscopia de super-resolução velocidade em nosso laboratório (Figura 1)6,7, 8. vários grandes avanços técnicos na microscopia de velocidade anteriormente permitiram-nos controlar com sucesso nucleocytoplasmic transporte de pequenas moléculas, proteínas, mRNA e vírus através de nativo nuclear pore complexos (NPCs)6, 7 , 8. resumidamente, os seguintes recursos da microscopia de velocidade serão usados para rastrear velozes macromoléculas através das estruturas simétrica e rotacionalmente sub-micrônicas em células vivas, tais como NPCs e cílios primários: (1) um inclinado ou uma iluminação vertical PSF permite a excitação de moléculas simples dentro de um volume pequeno de difração-limite no plano focal (Figura 1); (2), o PSF inclinado pode evitar muito fora de foco da fluorescência e, assim, melhorar a relação sinal-ruído. (3), a densidade óptica de 100-500 kW / cm2 no PSF iluminação permite que milhares de fótons para ser coletado de único fluorophores com velocidades de deteção rápida (> 500 Hz). Velocidade de deteção (4), o jejum também reduz o erro de localização espacial único-molécula (< 10 nm) ao determinar as trajetórias espaciais de mover moléculas fluorescentes em células vivas, porque a difusão molecular é um dos principais fatores fazendo com que as imperfeições da único-molécula de localização para a movimentação de moléculas. Algoritmos de transformação (5) bem estabelecidas 2D para 3D permitem-nos fornecer a densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para moléculas no NPC ou o cílio primário. Vale ressaltar que nosso processo de conversão entre o cartesiano e o sistema de coordenação cilíndrico é usado para gerar uma densidade de probabilidade espacial 3D mapa ao invés de 3D único-molécula rastreamento (Figura 2). Anteriormente, os dados de microscopia eletrônica revelaram que o NPC9,10 e o cílio primário11 ambos têm uma estrutura simétrica e rotacionalmente. Em princípio, aleatoriamente, difundir moléculas movendo-se através do NPC ou cílio primário também deve ter distribuições simétricas e rotacionalmente. Como mostrado na Figura 2, um número elevado de difusão aleatoriamente as moléculas no interior do cilindro geraria distribuições simétricas e rotacionalmente com a vista de seção transversal como que em NPC, ainda mais, resultando em um aproximadamente uniforme espacial distribuição dentro de cada sub-região muito pequena entre dois anéis vizinhos(Figura 2). Esta distribuição uniforme leva a que a distribuição espacial ao longo da dimensão θ no sistema cilíndrico é constante. Então as coordenadas 3D (X, R, θ) podem ser simplificadas para ser as coordenadas 2D (R, X, constante). Na verdade, nosso processo de conversão entre os cartesianos e os sistemas cilíndricos é de 2D (X, Y) a 2D (R, X, constante). A constante θ, refere-se a densidade espacial p na Figura 2,E, é calculada utilizando a equação A
.
Em última análise, rastreamento único-molécula tem ampla aplicação em pesquisa biológica, portanto, é natural que uma infinidade de técnicas será desenvolvida para preencher nichos biológicos específicos12,13,14. Tal é o caso com microscopia de velocidade. Anteriormente, quando combinada com um algoritmo de transformação 3D, esta técnica foi desenvolvida para resolver as rotas de transporte 3D de trânsito moléculas através os NPCs, uma estrutura biológica rotacionalmente simétrica e diffraction subtamanho6. Neste trabalho, cílios primários são mostrados para ser organelas excelente modelo também. Cílios primários são organelas cilíndricas, como antena (raio de ~ 125 nm) que o projeto da superfície dos mamíferos mais células15,16,17. Eles são responsáveis por receber os sinais externos e transmitir uma resposta intracelular, geralmente associada com crescimento e metabolismo de15,16. Portanto, fluxo de proteínas estruturais, reciclagem de receptores transmembranares e transmissão dos mensageiros intracelulares são responsabilidades vitais dos cílios primários. Na junção entre os cílios primários e o corpo da célula é uma barreira de seletividade crítica, chamada de zona de transição ou TZ, através do qual todo o transporte desta proteína deve ocorrer11,18,19, 20. Além da função associada do TZ, pelo menos, dois processos de transporte, do transporte e difusão passiva, são pensados para ser responsável pelo movimento da proteína através desta região16,21, 22. do ponto de vista da saúde humana, a perda de cílios primários e desregulamentação subsequente de sinalização a jusante são característica de muitos cancros. Além disso, muitas doenças genéticas, como síndrome de Bardet-Biedl e doença renal policística, estão associadas a proteína defeituosa transporte23. Tanto o tamanho do limite de difração sub e o complexo processo de transporte seletivo de proteína através do TZ fazem os cílios primários um alvo principal para esta técnica. Neste trabalho de métodos, demonstraremos o rastreamento de uma proteína transmembrana ciliar, receptor de somatostatina 3 (SSTR3)24, rotulado externamente com Alexa Fluor 647 e um componente do IFT, IFT2025, rotulado com uma molécula GFP fundida.
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Protocol
1. preparação da pilha NIH-3T3 para microscopia de velocidade do estoque
- 1,5 semanas antes do experimento, recuperar uma cultura fresca de células NIH-3T3 de um estoque congelado descongelar a 37 ° C e transferindo as células para um balão de cultura de células de2 25 cm com 3 mL de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 110 mg/mL piruvato de sódio, glutamina 2 mM, 10% de soro fetal bovino e 1% penicilina/estreptomicina.
- Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 células.
- Dividi células na confluência de 80%, de dois em dois dias, pelo menos três vezes antes do dia experimental para garantir a homogeneidade do ciclo celular. Trypsinize células com tripsina 0,25% por 2 min a 37 ° C, Aspire tripsina e substituí-lo com 2 mL do meio. Pipeta repetidamente a médio e romper a conjuntos de células, remova o número desejado de células e trazer o volume total dos meios de comunicação de volta até 3 mL.
Nota: NIH-3T3 foram anteriormente alterado geneticamente para expressar NPHP-4, uma proteína que localiza o TZ26, fundidos no terminal C para mCherry. mCherry é um fluoróforo que pode ser animado com 561 iluminação nm para localizar quantitativamente a barreira de seletividade TZ e orientar os cílios primários. - Dois dias antes do experimento, placa as células em um fundo de vidro 35mm prato na confluência de 60-70% com 1,5 mL do mesmo meio de como passo 1.1 e retornam as células para a incubadora.
- Um dia antes do experimento, transfect quimicamente as células com o plasmídeo desejado. Misturar 500-1000 ng do plasmídeo desejado (veja a Nota abaixo) na proporção de 1: 2.5 com reagente de transfeccao em 0,25 mL de mídia reduzida soro sem antibióticos durante 30 min. aspirado de mídia de 35 milímetros de vidro prato fundo e substituí-lo com o plasmídeo de 0,25 mL / mistura de reagente de transfeccao mais um extra 1,25 mL de mídia reduzida soro sem antibióticos. Mídia reduzida soro serve ao propósito de facilitar um bem sucedida do transfection, induzindo o crescimento de cílios primário, bem como manter as células viva tempo suficiente para realizar o experimento. Retorno as células para a incubadora para o experimento no dia seguinte.
Nota: Ao executar rastreamento único-molécula de IFT20, um plasmídeo que contém que um IFT20 geneticamente modificados fundidas no seu terminal C a GFP é usado25. Ao executar o único-molécula de rastreamento de SSTR3, um plasmídeo que contém um SSTR3 geneticamente modificados fundidas no seu término de N para um domínio de peptídeo (AP) aceitador e C terminal a GFP é usado22. Além de construção de SSTR3, um plasmídeo contendo o ligase biotina BirA deve ser expressa co e os meios de comunicação de transfeccao devem ser suplementados com 10 biotina µM. BirA, em seguida, anexa biotina ao domínio AP de moléculas de AP-SSTR3-GFP recém sintetizados ao nível do PS. Alexa647 conjugada com três dos quatro sites de ligação de biotina na estreptavidina, em média, então podem ser completadas para a mídia antes da imagem latente para etiqueta fluorescente as moléculas de AP-SSTR3-GFP na superfície exterior do celular22,27 . GFP e AlexaFluor647 são utilizados neste método; no entanto, outras sondas fluorescentes podem ser usadas se eles têm da mesma forma, foto-estabilidade elevada e quântica rendimento. - Se usando a construção de SSTR3 marcado externamente, remover a mídia da parte inferior de vidro prato 1 h antes do experimento, lave a célula 5 vezes com 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) e adiciona 1 mL de mídia reduzida soro suplementado com 1 µM Alexa647 conjugados streptavidin.
- Não mais que 15 min antes do experimento, remova a mídia do prato fundo vidro e lavar as células transfectadas e etiquetadas 5 vezes com 1 mL de PBS.
- Coloque 1 mL de tampão de imagem (20 mM HEPES, 110mm KOAc, 5mm NaOAc, 2mm MgOAc, 1mm EGTA, pH 7,3) no prato fundo vidro.
Nota: No buffer de imagem, as células são viáveis para não mais do que 3 h. Portanto, apenas a 2 h de experimentos são executadas em cada prato.
2. microscopia de velocidade
Nota: A configuração de microscopia de velocidade inclui um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objectivo apocromático de 1,4-at 100 × óleo-imersão, 35 mW 633 nm He-Ne laser, 50 mW estado sólido 488 nm e 561-nm lasers, um ganho de multiplicação em-microplaqueta câmera acoplado-dispositivo de carga e um pacote de software do microscópio para aquisição de dados e processamento (Figura 1). Para a imagem latente de canal individual, GFP, mCherry e Alexa647 estão animado por 488 nm, 561 nm ou lasers de 633 nm, respectivamente. Para rastreamento de molécula, único ponto de iluminação é usada para controlar as moléculas individuais fluorescente-etiquetadas. Para a imagem latente de epifluorescência, uma lente côncava é colocado no caminho da iluminação de laser para expandir o feixe em um campo uniforme da iluminação. A emissão de fluorescência é coletado pelo mesmo objectivo, filtrado por um filtro dicroico (405/488/561/635) e um filtro de emissão (405/488/561/635) e fotografado com a câmera do CCD acima operando a 500 Hz para rastreamento de molécula ou 2 Hz para imagem de epifluorescência.
- Fixe a placa de fundo de vidro para o palco do microscópio e localize uma célula que corretamente expressa as construções desejadas. Uma vez que foi encontrado um celular adequada, alinhe o ponto de NPHP4-mCherry na base dos cílios primários com a localização no plano de imagem que corresponde à iluminação de único ponto do laser.
- Capturar uma imagem de epifluorescência de NPHP4-mCherry e IFT20-GFP ou AP-SSTR3-GFP usando a função de "Snap" na aba "Câmera" da janela "Controles de foco", se usando o pacote de software de microscopia digital (ver Tabela de materiais).
Nota: Estas imagens atuará como uma referência para os locais da molécula subsequentes. - Uma vez que as imagens de referência são obtidas, localmente reduza a concentração de moléculas simples rotuladas. Foto-descora o TZ com 1 iluminação de laser mW por 20 s ou até que a intensidade da fluorescência é próximo de fluorescência de fundo.
Nota: Quando a concentração exacta pode ser controlada, 0,1-1 nM rotulado moléculas simples são usados. - Para preparar para rastreamento de molécula, reduza a potência de iluminação do laser de ~0.15 mW para moléculas simples rotulado com GFP ou ~0.5 mW para moléculas rotulado com Alexa647.
- Assim que a potência do laser e parâmetros de imagem são conjunto, ganho máximo e intensificação e taxa de quadros de 2 ms, para a imagem latente de molécula, envolver-se o laser de iluminação adequada e registrar não-foto, rotulado de moléculas simples como eles são transportados através da região de foto do TZ clicando no botão de "Stream" na aba "Câmera" da janela "Controles de foco".
Nota: Não mais de 2 min de vídeo deve ser capturada para minimizar os efeitos da deriva ciliar para um nível insignificante. - Depois de capturar o vídeo única molécula, processe os vídeos usando um algoritmo de ajuste Gaussian 2D, tais como vislumbre pelo laboratório Gelles, que localiza precisamente do centroide de excitação do cada molécula PSF em uma abrangente área de interesse (AOI).
- Selecione todos os locais da molécula com precisão < 10 nm e corrigir o centro de cílios com base na distribuição da molécula locais equipados com uma função gaussiana 2D.
Nota: Usando 2D para o algoritmo de transformação 3D, as rotas de transporte 3D de rotas IFT20-GFP e AP-SSTR3 são claramente mostradas na membrana ciliar ou axonemal ciliar, respectivamente.
3. 2D para 3D transformação
- Uma vez que várias mil localizações para o trânsito de moléculas (sinal-ruído ratio > 11) no cílio são coletadas, selecione eixo longo do cílio como a X-dimensão. Faça um histograma de dimensão Y dos locais e obter as somas bin em incrementos de 10 nm.
Nota: A 2D para 3D transformação pode ser avaliada pela mão ou qualquer software ou linguagem de programação. Os autores têm implementado com sucesso a transformação em Matlab e Python 2.7.
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Representative Results
Esta seção demonstra os dados obtidos da realização de microscopia de velocidade para o TZ de cílios primários para estudar a rota de transporte de SSTR3 ligado por um vinculador externo de nm ~ 15 de Alexa647(Figura 3). Serve o duplo objectivo de verificar o algoritmo de transformação 3D. Alexa647 deve apenas rótulo a superfície externa do cílio primário e, portanto, a rota de transporte 3D deve revelar uma rota de transporte de alta densidade no local. NIH-3T3 estàvel expressando NPHP3-mCherry no TZ deve ser transfected com AP-SSTR3-GFP e incubados de acordo com o protocolo acima com estreptavidina conjugada Alexa647. Imagem de campo largo do rótulo mCherry é usada para localizar o TZ, enquanto a GFP é usado para garantir que uma célula tem expressa a construção de SSTR3 desejada. Além disso, imagem de campo largo do rótulo Alexa647 usando 633 iluminação nm é necessária para confirmar que a célula corretamente manifestou o plasmídeo BirA e absorveu a biotina suficiente dos meios de comunicação. Uma confirmação positiva é caracterizada por um cílio visível distinto a fluorescência de fundo (Figura 3B). Eficiente rotulação da construção de AP-SSTR3-GFP com estreptavidina conjugada Alexa647 só pode ocorrer sob essas condições. Uma vez que se obteve uma confirmação positiva de rotulagem seletiva do cílio primário por Alexa647, fotobranqueamento e iluminação de ponto único do TZ com laser 633 nm permitirá moléculas simples ser visualizado. Antes da análise de dados, sobrepondo o vídeo única molécula a iluminação de campo largo é um passo útil validação (Figura 3C). Por exemplo, se o laser não está alinhado corretamente, não há moléculas simples aparecerá co localizar com o TZ. Outra etapa de validação de análise de pre-dados para garantir uma adequada relação sinal-ruído é verificar a intensidade para o TZ ao longo do comprimento da molécula único vídeo (Figura 3E). Tal análise pode ser realizada rapidamente em ImageJ usando a função 'traçar perfil de eixo z'. Os picos na Figura 3F correspondem a aparência de uma única molécula no TZ com um sinal-ruído de ~ 5.0. Este gráfico é também capaz de garantir que suficiente fotobranqueamento ocorreu como evidenciado pela frequência de moléculas simples bem separada. Figura 3 G demonstra uma baixa relação sinal-ruído de < 0.5. Uma explicação seria que o laser não é alinhado diretamente sobre o TZ. Outra razão pode ser que o poder de iluminação do laser é muito baixo. Ambas as explicações resultam em baixa excitação e, portanto, de baixa emissão dos fluorophores no TZ. Após terem sido feitas estas verificações, 2D Gaussian encaixe das moléculas simples irá produzir suas trajetórias no TZ (Figura 3-H). Sobreposição de muitas trajetórias produzirá a rota de transporte da proteína de interesse no TZ (Figura 3eu) rotulada. Desde que o encaixe Gaussian 2D corresponde aos valores de pixel no detector, o x, y dados de molécula podem ser mesclados com a imagem de campo largo da TZ e cílios primários para ilustrar ainda mais a proteína de localização do interesse (Figura 3J ).
IFT20 é um componente do IFT complexo, que transporta a carga ao longo de microtúbulos dentro cílios primária25. Arl13b-mCherry, uma proteína amplamente utilizado marcador ciliar era usado para rotular os cílios primária19. Microscopia de campo amplo epi-fluorescência foi usada para o cílio primário expressando tanto Arl13b-mCherry e IFT20-GFP de imagem e depois mudou para microscopia de velocidade para faixa individuais proteínas IFT20-GFP em cílios primárias após um pre-fotobranqueamento de GFP fluorescência para baixo nível único-molécula na área de iluminação de microscopia de velocidade (Figura 4A 4 C).
Eventualmente, centenas de locais de IFT20-GFP único-molécula com uma precisão de localização sistemática de < 16 nm podem ser obtidas o cílio primário de uma célula viva (Figura 4-D). De acordo com nossa simulação, 250 único locais da molécula com um raio de 95 nm foi suficiente para gerar uma rota de transporte confiável de 3D (Figura 5). Uma determinação final da rota de transporte IFT20-GFP é baseada em milhares de locais de IFT20-GFP único-molécula coletadas de dez cílios (Figura 4E). Desde cílios primários possuam uma estrutura com simetria rotacional, o 2D para o algoritmo de transformação 3D foi aplicado aos dados projetados 2D. Curiosamente, os mapas de densidade de probabilidade espacial 3D de IFT20 indicaram que apenas uma única região de alta densidade, com uma largura de 60 ~-nm atingiu um pico de ~ 95 nm ao longo do raio de cílios primários (Figura 4E). Esta região de alta densidade provável co localiza com os microtúbulos axonemal, de acordo com o local por onde a rota do IFT (Figura 4-F).
Figura 1 . Esquema simplificada da velocidade microscopia. Um vertical (caminho 1) ou uma função de propagação do ponto inclinado (caminho 2) é usada para iluminar as moléculas de fluoróforo único no plano focal. "d" refere-se a distância entre o feixe de laser de iluminação vertical que passa pelo centro do objectivo e iluminação angular que é alcançada, centrando-se o laser de iluminação na borda do objectivo. Lasers de dois ou mais regulamentadas por um helicóptero óptico para ter um modo de ligar-desligar da excitação são usados para rastrear as moléculas simples em trânsito através do NPC ou o cílio primário. O tempo de folga é pelo menos dez vezes mais tempo que o fotobranqueamento do rótulo fluoróforo nas moléculas alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Demonstração gráfica do 2D para o processo de conversão 3D. Esquemas demonstram o 2D para o algoritmo de transformação 3D para moléculas, por exemplo, se eles difundem dentro do lúmen central (A-F) ou de uma região periférica (G-L) de um tubo. (A) ideais 3D localizações espaciais da difusão aleatoriamente moléculas dentro de um tubo podem ser coordenadas em um sistema de coordenação cilíndricas (R, X, θ). Em velocidade, somente o mapa 3D de densidade, finalmente, é calculado a partir as localizações espaciais 2D. No entanto, este é um caso idealizado para ilustrar que o mapa 3D de densidade é equivalente se as localizações espaciais 2D ou 3D são conhecidas. (B) os locais moleculares 3D em um é projetada em um plano 2D em um sistema de coordenação cartesianas (X, Y, Z) por imagens de microscopia. (C) uma fatia muito fina (Δx) corte do cilindro na ao longo de x dimensão. (D) os locais espaciais 3D na fatia mostrado no C podem ser projetados dentro de uma estreita região 2D. (E) vista de seção transversal de todos os locais na fatia fina mostrado no C. Estes locais podem ser agrupadas em sub-regiões entre anéis concêntricos. Dadas as moléculas de alta-número distribuídas aleatoriamente no cilindro e a corte fatia muito fina, a densidade espacial dos locais (peu) em cada sub-região (Si) entre dois anéis vizinhos será rotacionalmente simétrica e uniforme. Nesses locais podem ser ainda mais projetados em 1D junto a dimensão Y. Se os locais ao longo da dimensão de Y são agrupados em um histograma com colunas j. O número total de posições em cada coluna (Aj) é igual a 
, que pode ser experimentalmente medido como mostrado em (F). (G-L) Similares como o acima, o processo de transformação é apresentado para moléculas dentro de uma região periférica de um tubo de difusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Localização espacial 3D da rota de transporte para SSTR3 na vivo cílios primárias mapeada pela microscopia velocidade. (A) representação gráfica de microscopia de velocidade, sendo aplicada para rastreamento de GFP-etiquetado SSTR3 através do TZ marcado por NPHP4-mCherry. (B) imagem de epifluorescência de NPHP4-mCherry (vermelho), AP-SSTR3-GFP (verde), Alexa647 usado para rotular externamente AP-SSTR3-GFP (branco) e a última imagem mesclada. Barra de escala: 2 µm. (C) o acompanhamento de um único Alexa 647-rotulado AP-SSTR3-GFP (branco) que atravessa o campo de ponto de iluminação por quatro quadros (ms/quadro 2). Barra de escala: 2 µm. (D) molécula trajetória (branco) de (C) sobreposto na imagem de epifluorescência de NPHP4-mCherry (vermelho) e AP-SSTR3-GFP (verde). Barra de escala: 2 µm. (E) branca tracejada destaques quadrados, a área de iluminação único ponto centralizada sobre o TZ. Barra de escala: 2 µm. (F) Photon contagem vs Frame número gráfico para uma única molécula de vídeo com um sinal elevado à relação de ruído determinado dividindo-se a fluorescência máxima da única molécula dividida por fluorescência a fundo. (G) photon contagem vs Frame número gráfico para uma única molécula de vídeo com um baixo sinal à relação de ruído. (H) a trajetória de (E) e (D) localizadas em cada quadro por meio de montagem Gaussian 2D e sobreposta a uma representação gráfica precisa do TZ, também localizado por meio de montagem Gaussian 2D. O processo de montagem Gaussian 2D cabe uma função gaussiana para as dimensões X e Y do perfil de uma área de interesse (AOI), englobando a distribuição espacial da molécula PSF.(I) 2D Super-resolução de 220 individuais intensidade Alexa Fluor 647-etiquetado AP-SSTR3-GFP locais coletados a partir de um único cílio primário. (J) Super-resolução única molécula locais de (I) sobrepostos na imagem de epifluorescência de NPHP4-mCherry (vermelho) e AP-SSTR3-GFP (verde). Barra de escala: 2 µm. (K) por um 2D para o algoritmo de transformação 3D, a distribuição espacial de densidade de probabilidade de Alexa Fluor 647-rotulado AP-SSTR3-GFP em cílios primários ao longo da dimensão de R foi obtida. Com base na função gaussiana, montagem, Alexa Fluor 647-rotulado AP-SSTR3-GFP principalmente localizado na membrana ciliar em um raio de 131±3 nm com uma largura total no máximo meia (FWHM) de 24±1 nm. (L) vista de seção transversal da distribuição espacial de densidade de probabilidade (nuvem verde) de Alexa Fluor 647-rotulado AP-SSTR3-GFP na primárias cílios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Localização espacial 3D da rota de transporte para IFT20 dentro ao vivo cílios primárias mapeada pela microscopia velocidade. (A-C) Imagem representativa da Arl13b-mCherry (A) e IFT20-GFP (B) co expressado em uma célula de NIH3T3 e o mesclado (C). O círculo (ciano) indica que a localização de ponto único iluminação da microscopia de velocidade em um cílio primário cresceu ao lado de uma célula (linhas tracejadas brancas), cujas bordas são determinadas por fluorescência IFT20-GFP no corpo celular e iluminação de campo claro (não mostrado). Barra de escala: 10 µm. (D) 2D Super-resolução distribuição espacial de 286 locais de IFT20-GFP individuais coletadas de um único cílio primário. (E) por um 2D para o algoritmo de transformação 3D, a distribuição espacial de densidade de probabilidade de IFT20-GFP dentro cílios primários ao longo da dimensão de R é obtida. Com base no ajuste da função gaussiana, IFT20-GFP localizar principalmente em um raio de 95±1 nm com uma largura total no máximo meia (FWHM) de 56±5 nm. (F) vista de seção transversal da distribuição espacial de densidade de probabilidade (nuvens verdes) de IFT20-GFP em cílios primários, sobreposto com o esquema em barra H. escala: 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Simulação foi utilizada para estimar o número mínimo de locais de único-molécula 2D para gerar um mapa de densidade de probabilidade espacial 3D confiável para o 2D para algoritmos de transformação 3D. (A) 100 locais de único-molécula computacionalmente gerado aleatoriamente da amostra de uma distribuição normal de densidade radial centralizada em 95 nm (correspondente à rota de transporte primário de IFT20 determinado em nossos experimentos). Precisão de localização de 16 nm é simulada para cada local de único-molécula por amostragem a partir de uma distribuição normal com σ = 16 nm. Como mostrado na Figura 2,C, uma fatia muito fina (Δx) na dimensão X é usado para algoritmos de transformação e, portanto, a dimensão de X não é mostrada nos locais único-molécula 2D gerados computacionalmente. (B) a transformação entre os dados do projeto Y-dimensional e densidade R-dimensional 3D gerar histogramas de densidades R-dimensional 3D para cinco conjuntos de dados simulados diferentes (cada um com 100 pontos). O número acima é a posição de pico ± erro de montagem. (C-D) Resultados de simulação com base em 250 locais de único-molécula. (E-F) Resultados de simulação baseados em 500 locais de único-molécula. (G-EU) Média de histogramas de densidade 3D de simulações de 100, 250 e 500 pontos respectivamente. Barras de erro representam a variabilidade nas alturas bin histograma enquanto o número acima do pico é o posição de pico média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve a aplicação da microscopia de velocidade para o cílio primário, uma organela celular de sinalização que é altamente dependente do transporte eficiente de proteínas. Microscopia de velocidade pode fornecer alta resolução locais (< 10 nm) para moléculas fluorescente-etiquetadas como passam através da iluminação de ponto único centralizada sobre o TZ. Anteriormente tiver sido aplicado para estudar a proteína tráfico através do NPC6,7,8. No entanto, que seja estendido para estudar o tráfico através de qualquer cavidade celular sub difração. Esta técnica tem uma vantagem sobre outras técnicas de imagem de alta resolução que é capaz de captar a dinâmica de transporte de proteína único em sistemas de células vivas em uma resolução espacial e temporal de < 10 nm e < 2 ms, respectivamente. Outra vantagem é que se deve única fluorescente-rótulo uma proteína de interesse e expressar a construção através de transfeccao, uma abordagem comum de biologia molecular para estudar a localização da proteína, para começar realizando microscopia de velocidade. Se deve ter em mente que o único ponto de iluminação com um laser de alta potência é o recurso que fornece os locais de molécula bem separados, de alta resolução. No entanto, isto também limita a área de iluminação e faz com que a técnica não é adequado para a localização de campo largo. Felizmente, existem muitas técnicas de resolução super amplo campo para investigadores escolher se desejado. Outro ponto a considerar é que a microscopia de velocidade capta apenas locais de mover moléculas simples. Portanto, a combinação com FRAP, que pode determinar a fração do totais moléculas que são móveis, pode ser uma adição útil para análise.
O processo de conversão entre o cartesiano e o sistema de coordenação cilíndrico é gerar um mapa de densidade de probabilidade 3D virtual em vez de uma vista 3D com base em 3D único-molécula rastreamento. No detalhe, microscopia eletrônica de dados revelaram que os cílios primários tem uma estrutura simétrica e rotacionalmente que poderia gerar uma distribuição uniforme da molécula ao longo de determinado raio. Esta distribuição uniforme leva a que a distribuição espacial ao longo da dimensão θ no sistema cilíndrico é constante. Então as coordenadas 3D (X, R, θ) podem ser simplificadas para ser as coordenadas 2D (R, X, constante). Na verdade, nosso processo de transformação entre os cartesianos e os sistemas cilíndricos é de 2D (X, Y) a 2D (R, X, constante). A constante θ, refere-se a densidade espacial de p, é calculada utilizando a equação A
(Figura 2). Usar uma calculadora de matriz para calcular o vetor 
, que corresponde às zonas relativa entre vizinhos anéis concêntricos no corte transversal vista6,7sAj os sites de total interação com a posição de j medido diretamente a partir de experiências; Assim, peu, a densidade de probabilidade espacial dos sites de interação no reu, pode ser calculada através da resolução da equação de matriz de A.
Um passo crítico no protocolo é para minimizar qualquer perturbação da instalação entre a aquisição de imagens de referência e a molécula de vídeo microscopia. Se ocorrer qualquer movimento, não é possível mapear com confiança os locais da molécula para a ultra-estrutura dos cílios primários que foi obtida através de imagem de epifluorescência. Outro passo essencial é photobleach a área de iluminação suficiente para reduzir localmente a concentração de moléculas simples fluorescente etiquetadas, mas não tanto que a população é completamente foto. No caso de SSTR3, o coeficiente de difusão é lento em comparação às moléculas solúveis e o movimento de uma população de moléculas de SSTR3 un-foto de volta para a área da foto será mais de dois minutos, o tempo, além do qual deriva a ciliar é um fator não negligenciável. Se o nível adequado de fotobranqueamento é difícil de alcançar e um elevado nível de fluorescência de fundo ainda está presente, um laser de iluminação angular pode ser usado para reduzir a quantidade de moléculas simples fluorescente etiquetadas que estão ansiosas, acima e abaixo da avião de imagem. Isto reduzirá o fundo e melhorar a relação sinal-ruído para cada molécula capturada.
Em resumo, microscopia de velocidade é capaz de ser facilmente implementada em configurações de microscopia convencional pela adição de uma fonte de iluminação laser, espelhos associados e câmera CCD de alta velocidade. O principal avanço sobre outras técnicas similares são o laser inclinado, que reduz extremamente a fluorescência de fundo e o algoritmo de transformação de 2D para 3D, que reconstrói o mapa de densidade de probabilidade espacial 3D da único-molécula 2D locais. Do ponto de vista biológica, sem rotulagem extra além de uma fluoróforo conjugado da proteína de interesse é necessário. Estas características permitem que a microscopia da velocidade controlar moléculas simples com alta spatiotemporal (5-10 nm, 0,4-2 ms) resolução como eles o tráfego por um sub-micrônicas bio-cavidade ou bio-canal com estruturas rotacionalmente simétricas. Juntamente com um algoritmo de transformação 3D de densidade de probabilidade, as rotas de transporte 3D das proteínas marcadas podem ser determinadas através da cavidade ou canal. A aplicação desta técnica tem sido usada anteriormente para distinguir as rotas de transporte 3D de proteínas e RNAs através do NPC e, aqui, nós mostramos que o transporte 3D de uma proteína transmembrana, SSTR3 e uma proteína citosólica, IFT20, poderão ser alcançado no TZ de cílios primários. Obtiveram-se outras técnicas de super resolução, tais como 3D-tempestade, x, y, posições de z para moléculas simples, colocando uma lente cilíndrica no caminho óptico que cria uma distorção assimétrica do único-molécula PSF dependendo de sua posição acima ou abaixo o plano focal28. Outro avanço pode tentar implementar a tecnologia virtual pinhole para reduzir a largura das emissões PSF e assim aumentar a resolução ainda mais. As técnicas acima podem ser implementadas na microscopia de velocidade muito facilmente. Em geral, microscopia de velocidade fornece uma abordagem única na simultaneamente determinação cinética de transporte no único-molécula mapa 3D e nível das vias de transporte com altíssima resolução spatiotemporal para interou intraorganela molecular tráfico em determinadas circunstâncias em sistemas de células vivas.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Kristen Verhey (Universidade de Michigan, Ann Arbor) e Dr. Gregory Pazour (Universidade de Massachusetts Medical School) para fornecer alguns plasmídeos. O projeto foi apoiado por concessões do National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 e GM122552 para W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
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