Summary
Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.
Abstract
Birincil cilium bir Mikrotubul tabanlı çıkıntı yüzeyi birçok ökaryotik hücre ve proteinlerin benzersiz bir tamamlayıcı bu işlev eleştirel hücre hareketliliği ve sinyal içerir. Kirpikler kendi protein sentezleme aciz olduğundan, 200'e yakın benzersiz silier proteinler sitozol ve birincil kirpikler ticareti gerekir. Ancak, hala taşıma yolları bu proteinler arasında şu an mevcut olan sınırlamaları nedeniyle canlı birincil kirpikler için üç boyutlu (3D) yerlerini eşlemek için teknik bir sorun olduğunu teknikleri. Meydan fethetmek için son zamanlarda biz geliştirdik ve tek-noktaya kenar-uyarma alt kırınım (hız) mikroskopi, taşıma yolları için 3D uzaysal konumunu belirlemek için olarak adlandırdığı bir yüksek hızlı sanal 3D süper çözünürlük mikroskobu istihdam hem sitozolik ve birincil kirpikler canlı hücre membran proteinlerinin. Bu makalede, biz hız mikroskobu, silier protein Floresans protein etiketli, gerçek zamanlı tek molekül izleme canlı cilium bireysel proteinlerin ve başarı ifade hücreleri hazırlanması ayrıntılı kurulum gösterecektir 3D mekansal olasılık yoğunluk haritaları silier proteinler için ulaşım yollarının.
Introduction
Ernst Abbe tarafından 1873 yılında belirtilen beri konvansiyonel ışık mikroskobu çözünürlüğe objektif1,2ışık kırınım nedeniyle sınırlı yaklaşık 200 nm olduğuna inanılan. Şu anda, süper çözümleme ışık mikroskobu teknikleri bu sınırlama kırmak ve alt kırınım (< 200 nm) çözünürlük ile dinamik görüntü yakalama sağlar. Teknikleri, genellikle iki geniş kategoriye ayrılır: uyarılmış alt kırınım Aydınlatma Cilt fluorophores doğrusal olmayan optik tepki nedeniyle örnekleri3' te; oluşturmak emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi dayalı yaklaşımlar ve photoactivated ışık mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)-fluorophores cisimlerin yerelleştirilmesine ve bu cisimlerin yeniden oluşturmak için Matematiksel işlevler kullanmak süper çözümleme teknikleri dayalı süper çözünürlük görüntüleri4,5oluşturmak için. Şu anda, nispeten basit optik Kur nedeniyle PALM ve fırtına geniş yalnızca küçük bir alt kümesine fluorophores biyolojik hazırlanması uzun bir videonun her çerçevede etkinleştirerek istihdam edilmektedir. Bu daha doğru yerelleştirme için floresan spot, 2D Gauss montaj tarafından noktaya yayılmış işlevi (PSF) olarak adlandırdığı video her çerçevede fluorescently etiketli proteinlerin sağlar. Her fluorescently etiketli molekül 2D konumunu sonra biyolojik hazırlık1,2süper çözünürlük görüntü üretmek için tek bir görüntüleme uçağa bindirilen. Bu tek molekül yerelleştirme sırasında mikroskobu süper çözünürlük yaklaşımlar kesinlikle nasıl görüntüleme biyolojik örneklerin gerçekleştirilen devrim, hala aşılması gereken sorunlar vardır. Örneğin, fırtına ve PALM onların en iyi uzamsal çözünürlük sonra biyolojik örneklerin fiksasyonu elde etmek ve böylece fluorescently etiketli proteinler, statik bir temsili olan elektron mikroskobu benzer bir kısıtlamasıdır mevcut. Ayrıca, canlı hücrelerdeki her fluorescently etiketli protein için yüksek Uzaysal çözünürlük elde etmek için örnekleri protein dynamics yakalamak mümkün değildir çok uzun framerate yansıması gerekir. Bu nedenle, bu ana teknik engellerin üstesinden gelmek gereklidir.
Çok hızlı hareket eden protein veya RNA'ların canlı hücrelerde algılamak için uygundur yüksek bir kronolojik zamanmekansal çözünürlük elde etmek için biz süper çözünürlük hızı mikroskobu bizim laboratuvar (şekil 1)6,7', gelişen 8. hız mikroskobu birkaç önemli teknik gelişmeler bizi küçük moleküllerin nucleocytoplasmic taşıma başarılı bir şekilde izlemek daha önce etkinleştirdiyseniz, proteinler, mRNA ve virüs-den geçerek yerli nükleer gözenek kompleksleri (NPCs)6, 7 , 8. kısaca, hız mikroskobu, aşağıdaki özellikleri hızlı hareket eden oluştururlar alt mikrometre rotasyonel simetrik yapıları NPCs ve birincil kirpikler gibi canlı hücrelerdeki üzerinden izlemek için kullanılan: (1) bir eğimli veya bir Dikey aydınlatma PSF odak düzlemi (şekil 1); küçük kırınım-limit hacmindeki içinde tek moleküllerin uyarma sağlar (2) eğimli PSF büyük ölçüde odak floresan önlemek ve böylece sinyal-gürültü oranı geliştirmek. (3) 100-500 kW optik yoğunluk / cm2 aydınlatma PSF'hızlı algılama hızı (> 500 Hz) ile tek fluorophores üzerinden tahsil edilecek fotonlar binlerce sağlar. (4) hızlı algılama hızı da büyük ölçüde azaltır tek molekül kayma yerelleştirme hata (< 10 nm) moleküler Difüzyon önemli faktörlerden biri olduğu için canlı hücrelerde, floresan molekülleri hareket kayma yörüngeleri belirlemede molekülleri hareket etmek için tek molekül yerelleştirme kusurları neden. (5) well-established 2D 3D dönüştürme algoritmaları molekülleri NPC veya birincil cilium 3D mekansal olasılık yoğunluk haritalar ulaşım yollarının sağlamamıza olanak sağlar. Bu bizim dönüştürme işlemi Kartezyen ve silindirik koordinasyon sistemi arasında bir 3D mekansal olasılık yoğunluk 3D yerine harita tek molekül izleme (Şekil 2) oluşturmak için kullanılan dikkat çekicidir. Daha önce elektron mikroskobu veri-si olmak kâşif NPC9,10 ve11 birincil cilium hem de rotasyonel simetrik bir yapıya sahip. Prensip olarak, rasgele NPC veya birincil cilium aracılığıyla hareketli moleküllerin Difüzyon rotasyonel simetrik dağıtımları da olmalıdır. Şekil 2' de gösterildiği gibi rastgele silindir içinde moleküllerin Difüzyon yüksek bir dizi bu kesit görünümü, rotasyonel simetrik dağıtımları daha fazla bir yaklaşık Tekdüzen kaynaklanan NPC oluşturmak kayma Dağıtım iki komşu yüzük (Şekil 2E) arasında çok küçük her alt bölge içerisinde. Bu tekdüze dağılım silindirik sistemdeki θ boyuttaki kayma dağıtım sabittir yol açar. Sonra 3D koordinatları (R, X, θ)-ebilmek var olmak kolaylaştırmak-2B koordinatları (R, X, Sabit) olmak. Aslında, bizim dönüştürme işlemi Kartezyen ve silindirik sistemleri arasındaki 2D (R, X, Sabit) 2D (X, Y) etmektir. Sürekli θ, Şekil 2Emekansal yoğunluk p başvurduğu, ADenklem kullanılarak hesaplanır
.
Sonuçta, tek molekül izleme geniş uygulama Biyolojik araştırma vardır, böylece, bu teknikleri bir bolluk belirli biyolojik nişler12,13,14doldurmak için geliştirilecek doğaldır. Böyle hız mikroskobu ile durumdur. Daha önce bir 3B dönüştürme algoritması ile birleştiğinde, moleküller NPCs, alt diffraction ölçekli ve rotasyonel simetrik biyolojik yapısı6üzerinden transit, 3D ulaşım yolları çözmek için bu teknik geliştirilmiştir. Bu yazıda, birincil kirpikler mükemmel model organelleri de olduğu gösterilmiştir. Birincil kirpikler en memeli hücreleri15,16,17yüzeyinden Project'in silindirik, anten gibi organellerin (~ 125 nm RADIUS) vardır. Onlar dış sinyalleri alma ve genellikle büyüme ve metabolizma15,16ile ilgili hücre içi bir yanıt gönderme için sorumludur. Bu nedenle, yapısal proteinlerin akı, geri dönüşüm transmembran reseptörler ve hücre içi haberci iletimini birincil kirpikler önemli sorumlulukları vardır. Dönemde birincil kirpikler ve hücre beden arasındaki geçiş bölgesi veya TZ, hangi aracılığıyla bu protein taşıma11,18,19ortaya çıkması gereken bir kritik seçicilik engel vardır, 20. TZ gating işleve ek olarak, en az iki taşıma işlemi, intraflagellar taşıma ve pasif difüzyon, protein bu bölge16,21, üzerinden hareket sorumlu olduğu düşünülür 22. bir insan sağlığı açısından birincil kirpikler kaybı ve aşağı akım sinyal sonraki deregülasyon birçok kanser özelliğidir. Buna ek olarak, Bardet-Biedl sendromu ve Polikistik böbrek hastalığı, gibi birçok genetik hastalıkların arızalı protein taşıma23ile ilişkilidir. Alt kırınım boyutu sınırı ve seçici protein taşıma TZ aracılığıyla karmaşık süreci birincil kirpikler için bu tekniği ilk hedef olun. Bu yöntemleri yazıda, biz silier transmembran protein, somatostatin reseptörü 3 (SSTR3) izleme gösterecektir24dışarıdan Alexa Fluor 647 ve bir bileşeni olan bir yuvarlak GFP molekül ile etiketli LFT, IFT2025, taşır,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NIH 3T3 hücre hazırlık için hız mikroskobu stoktan
- deneme hakkında 1,5 hafta 37 ° C'de çözdürme ve hücreleri bir 25 cm2 hücre kültür şişesi 3 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (110 mg/mL ile desteklenmiş DMEM) ile aktarma tarafından dondurulmuş stoktan NIH 3T3 hücre taze bir kültür kurtarmak Sodyum pyruvate, 2 mM glutamin, % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin/streptomisin.
- %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- Hücreleri hakkında iki günde % 80 confluency, hücre döngüsü polimerlerin sağlamak için deneysel bir gün önce en az üç kez bölün. % 0.25 tripsin 37 ° C'de 2 min için hücrelerle trypsinize, tripsin Aspire edin ve orta 2 mL ile değiştirin. Pipet art arda hücre kümeleri kadar kırmak, hücreler için istediğiniz sayıyı kaldırmak ve medya hacmi getirmek için orta geri ilâ 3 mL.
Not: NIH 3T3 daha önce genetik olarak NPHP-4, mCherry için C terminus, erimiş TZ26, yerelleştirir bir protein ifade etmek için. mCherry 561 nm aydınlatma ile kantitatif TZ seçicilik bariyer yerelleştirilmesine ve birincil kirpikler yönlendirmek için heyecanlı bir fluorophore var. - İki gün önce deney, plaka 35 mm cam alt hücrelere aynı orta adım 1.1 olarak 1,5 mL ile % 60-70 confluency, bulaşık ve hücreleri için kuluçka dönün.
- Bir gün önce deneme, kimyasal olarak istenen plazmid hücrelerle transfect. 500-1000 istenen plazmid ng (bkz: Not aşağıdaki) 1:2.5 oranında transfection reaktif 0.25 ml 30 dk. 35 medyadan aspiratı için antibiyotik olmadan düşük serum medya ile mm cam alt çanak mix ve eski yerine koymak o ile 0.25 mL plazmid / transfection reaktif mix plus ilave 1,25 kalp krizi düşük serum medya olmadan antibiyotik. İndirimli serum medya başarılı bir transfection kolaylaştırılması, birincil kirpikler büyüme inducing, hem de hücreleri deney gerçekleştirmek için yeterince uzun süre hayatta tutan amaca hizmet eder. Hücreleri ertesi gün deneme için kuluçka dönün.
Not: IFT20 tek molekül izlenmesini gerçekleştirirken, GFP için onun C terminus, genetiği değiştirilmiş IFT20 erimiş içeren bir plazmid kullanılan25' tir. Tek molekül gerçekleştirirken kendi N terminus bir alıcısı peptid (AP) etki alanı için genetiği değiştirilmiş SSTR3 içeren bir plazmid erimiş SSTR3 izleme ve C terminus GFP için kullanılan22yaşında. SSTR3 yapı yanı sıra ortak biotin ligaz BirA içeren bir plazmid dile getirdi ve transfection medya 10 µM biotin ile desteklenmiştir. BirA sonra biotin ER düzeyinde yeni sentezlenmiş AP-SSTR3-GFP moleküllerin AP etki alanı ekler. Streptavidin, dört biotin bağlama sitelerinde üçü için Birleşik Alexa647 ortalama, sonra fluorescently etiket için AP-SSTR3-GFP moleküller hücre22,27 dış yüzeyinde Imaging önce basına takıma . GFP ve AlexaFluor647 Bu yöntemde kullanılır; Ancak, diğer floresan problar onlar benzer şekilde yüksek fotoğraf-istikrar ve verim kuantum varsa kullanılabilir. - SSTR3 yapı dışarıdan etiketli, cam alt medyadan deneme önce 1 h bulaşık, hücresinden fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 mL 5 kere yıkayın ve düşük serum medya 1 mL 1 µM ile desteklenmiş Ekle Kaldır kullanarak Alexa647 Birleşik streptavidin.
- En fazla 15 dk önce deneme, cam alt çanak medyayı çıkarın ve 1 mL PBS ile 5 kere transfected ve etiketli hücreleri yıkayın.
- Görüntüleme arabelleği (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) 1 mL cam alt çanak yerleştirin.
Not: görüntüleme arabellekte artık için 3 h uygun hücrelerdir. Bu nedenle, sadece 2 h deneyler her yemeğin üzerinde yapılmaktadır.
2. hız mikroskobu
Not: Hız mikroskobu Kur bir 1.4-NA 100 × petrol-daldırma apochromatic amaç, 35 mW 633 nm He-Ne lazer, 50 mW katı hal 488-nm ve 561-nm lazerler, bir çip üzerinde çarpma kazanç ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu içerir. şarj birleştiğinde cihaz kamera ve bir mikroskop bilgisayar yazılımı paket için veri toplama ve işleme (şekil 1). Tek kanal görüntüleme için GFP, mCherry ve Alexa647 tarafından 488 heyecanlı mısın nm, 561 nm veya 633 nm lazerler, anılan sıraya göre. Tek molekül izleme için tek nokta aydınlatma bireysel moleküllerin fluorescently etiketli izlemek için kullanılır. Epifluorescence görüntüleme için ışın tek tip bir aydınlatma alana genişletmek için lazer aydınlatma yolundaki bir içbükey mercek yerleştirilir. Floresans emisyon aynı amaç tarafından toplanan, dikroik filtresi (405/488/561/635) ve bir emisyon filtresi (405/488/561/635) tarafından filtre ve tek molekül takibi için 500 Hz veya 2 Hz için çalışan yukarıdaki CCD kamera ile görüntülü epifluorescence görüntüleme.
- Cam alt plaka mikroskop sahneye yapıştırmayın ve istenen yapıları düzgün ifade bir hücreyi bulun. Uygun bir hücreyi bulunca NPHP4 mCherry noktanın konumunu görüntüleme uçakta lazer'ın tek nokta aydınlatma için karşılık gelen birincil kirpikler temelini hizalayın.
- NPHP4-mCherry ve IFT20-GFP veya AP-SSTR3-GFP digital mikroskobu yazılım paketi kullanıyorsanız "Odak denetimler" pencere "Kamera" sekmesinde "Ek" işlevini kullanarak bir epifluorescence görüntü yakalama ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: Bu görüntüleri izleyen tek molekül konumları için bir başvuru olarak hareket edecek. - Referans görüntüleri elde edilen bir kez yerel olarak etiketli tek moleküllerin konsantrasyonunu azaltmak. Fotoğraf-TZ 1 mW lazer aydınlatma 20 ile çamaşır suyu s ya da floresan yoğunluğu bu arka plan Floresans yakın olana kadar.
Not: Otelde tam konsantrasyon kontrol edilebilir, 0.1-1 tek molekülleri etiketli nM kullanılır. - Tek molekül izleme için hazırlamak için lazer aydınlatma gücü ~0.15 mW tek molekülleri ile GFP etiketli veya ~0.5 mW Alexa647 ile etiketli molekülleri düşür.
- En kısa zamanda lazer güç ve parametrelerini görüntüleme ayarla, maksimum kazanç ve yoğunlaştırılması ve 2 ms kare hızı, tek molekül görüntüleme için uygun aydınlatma lazer meşgul ve sigara-photobleached, onlar taşınmaktadır gibi tek molekülleri etiketli kaydetme "Odak denetimler" penceresindeki "Kamera" sekmesi "Stream" düğmesini tıklatarak TZ photobleached bölgeden.
Not: En fazla 2 dk Video ihmal edilebilir bir düzeye silier drift etkilerini en aza indirmek için yakalanması. - Tek molekül video yakalanıyor sonra belirti yanında tam olarak her molekülünü'nın uyarma PSF kapsayan bir alanda ilgi (AOI) centroid yerelleştirir Gelles laboratuvar gibi bir 2D Gauss uygun algoritması kullanarak video işlemek.
- Tüm tek molekül konumları hassasiyetle seçin < 10 nm ve dağıtım bir 2D Gauss fonksiyonu ile donatılmış tek molekül yerlerin dayalı kirpikler ortasına doğru.
Not: 2D 3D dönüştürme algoritması kullanarak, IFT20-GFP ve AP-SSTR3 parkurları 3D ulaşım yolları açıkça silier axonemal veya silier membran üzerinde sırasıyla gösterilir.
3. 2D 3D dönüştürme için
- Bir kez içinde cilium molekülleri (sinyal gürültü oranı > 11) transit için birkaç bin yerelleştirmeler toplanır, cilium uzun ekseni X-boyut olarak seçin. 10 nm aralıklarla depo gözü toplamlar elde etmek ve konumları Y boyut histogramını olun.
Not: 2D 3D dönüştürme için el veya herhangi bir yazılım veya programlama dili tarafından değerlendirilecek. Yazarlar başarıyla Matlab ve Python 2.7 dönüşümün hayata geçirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HIZ mikroskobu, Alexa647 için bir ~ 15 nm dış bağlayıcı tarafından bağlı SSTR3 taşıma güzergahı çalışmaya TZ birincil kirpikler, performans elde edilen veriler bu bölümde gösterilmiştir (şekil 3A). Bu, 3B dönüştürme algoritması doğrulama çift amaçlı hizmet vermektedir. Etiket birincil cilium ve bu nedenle, 3D aktarım yol dış yüzeyinin bu konumda bir yüksek yoğunluklu aktarım yol ortaya çıkarmak sadece Alexa647 gerekir. NIH 3T3 stabil NPHP3-mCherry, TZ ifade AP-SSTR3-GFP ile transfected ve streptavidin Birleşik Alexa647 ile yukarıdaki protokolüne göre inkübe gerekir. Geniş alan görüntüleme mCherry etiket GFP hücrede istenilen SSTR3 yapı dile getirdi emin olmak için kullanılırken TZ yerelleştirmek için kullanılır. Ayrıca, geniş alan görüntüleme 633 nm aydınlatma kullanarak Alexa647 etiket hücre düzgün BirA plazmid dile getirdi ve medyadan yeterli biotin absorbe onaylamak gereklidir. Teşekkürler görünür cilium arka plan floresan (şekil 3B) farklı karakterizedir. Streptavidin Birleşik Alexa647 sahip AP-SSTR3-GFP yapı verimli etiketlerine göre sadece bu koşullar altında ortaya çıkabilir. Alexa647 tarafından birincil cilium seçici etiketlerine göre olumlu onay alındıktan sonra photobleaching ve TZ 633 nm lazer ile tek noktadan aydınlatma görüntülenmeyecektir tek molekülleri sağlayacaktır. Önce veri analizi, geniş alan aydınlatma tek molekül videoda superimposing yararlı doğrulama adım (şekil 3C) olduğunu. Örneğin, lazer düzgün değil hizalanmışsa, TZ ile birlikte yerelleştirmek için tek hiçbir molekülleri görünür. Bir öncesi veri analiz doğrulama adım yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için TZ yoğunlukta tek molekül video (şekil 3E) uzunluğu üzerinde kontrol etmektir. Bu tip çözümlemeler ImageJ 'z ekseni profil Çiz' işlevini kullanarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Şekil 3F Peaks'e TZ adlı tek bir molekül görünümü bir sinyal-gürültü ~ 5.0 ile karşılık gelir. Bu grafik de yeterli photobleaching tek molekülleri iyi ayrılmış sıklığını tarafından kanıtlanan oluştu sağlanması yeteneğine sahiptir. Şekil 3 G < 0,5 düşük sinyal-gürültü oranı gösterir. Bir açıklama lazer TZ doğrudan uyumlu değildir olacaktır. Başka bir nedenle lazer aydınlatma gücü çok düşük olabilir. Her iki açıklamalar içinde düşük uyarma neden ve bu nedenle, düşük emisyon TZ adlı fluorophores. Bu kontroller yapıldıktan sonra 2D Gauss uygun tek moleküllerin TZ (şekil 3H) içinde onların yörüngeleri üretecek. Birçok yörüngeleri superimposing TZ (şekil 3ben) ilgi etiketli protein aktarım yol üretecek. 2D Gauss uygun dedektörü, x, piksel değerlerine karşılık gelen bu yana y tek molekül veri TZ ve birincil kirpikler daha fazla ilgi'nın yerelleştirme (şekil 3J protein göstermek için geniş alan görüntü ile birleştirilebilir ).
IFT20 LFT karmaşık, mikrotübüller birincil kirpikler25içinde boyunca kargo taşıyan bir bileşenidir. Arl13b-mCherry, yaygın olarak kullanılan silier marker protein birincil kirpikler19etiketlemek için kullanıldı. Geniş alanlı epi-floresan mikroskopi Arl13b-mCherry ve IFT20-GFP ifade birincil cilium görüntü için kullanılan ve bireysel IFT20-GFP proteinler arasında birincil kirpikler sonra GFP, bir ön-photobleaching izlemek için hız mikroskopi için açık Floresans hız mikroskobu (şekil 4A-4 C) aydınlatma alanında tek molekül düzeyine kadar.
Sonunda, tek molekül IFT20-GFP yerleri yüzlerce < 16 nm uyguladıkları yerelleştirme duyarlığını ile canlı hücre (şekil 4D) birincil cilium elde edilebilir. Simülasyonumuza göre 250 tek bir RADIUS ile molekül yerlerini 95 nm güvenilir 3D aktarım yol (şekil 5) oluşturmak için yeterli oldu. IFT20-GFP aktarım yol son bir tespit tek molekül IFT20-GFP Mekanlar on kirpikler (şekil 4E) toplanan binlerce temel alır. Birincil kirpikler dönme simetri ile bir yapıya sahip beri 2D 3D dönüştürme algoritması için 2D öngörülen verilerine uygulanan. İlginçtir, yalnızca tek bir yüksek yoğunluklu bölgeye ~ 60-nm genişliğe sahip ~ 95 doruğa IFT20 3D mekansal olasılık yoğunluk haritaların belirtilen birincil kirpikler (şekil 4E) RADIUS boyunca nm. Bu yüksek yoğunluklu bölgenin büyük olasılıkla axonemal mikrotübüller LFT rota (şekil 4F) görüldüğü yer ile anlaşma ile birlikte yerelleştirir.
Resim 1 . HIZ mikroskobu Basitleştirilmiş şematik. Dikey (1 yolu) veya bir eğimli (2 yolu) noktası yayıldı işlevi odak düzlemi tek fluorophore molekülleri aydınlatmak için kullanılır. "d" amaç merkezinden geçen dikey aydınlatma lazer ışını ve amacı kenarında aydınlatma lazer odaklanarak elde açılı aydınlatma arasındaki uzaklığı gösterir. İki veya daha fazla lazerler bir açma-kapama uyarma moduna sahip optik bir helikopter tarafından düzenlenir NPC veya birincil cilium üzerinden transit tek molekülleri izlemek için kullanılır. En az on daha uzun bir photobleaching süre hedeflenen molekülleri fluorophore etiketinde kapatma zamanı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . 3D dönüştürme işlemi için 2B grafik gösteri. Şemaları 2D 3D dönüştürme algoritması molekülleri, örneğin, göstermek durumunda, ve merkezi Lümen (A-F) veya bir tüp periferik bölgesinde (G-M) yaygın. (A) rastgele bir tüp içinde moleküllerin difüzyon, ideal 3D kayma yerler bir silindirik koordinasyon sistemi (R, X, θ) koordine. HIZI, sadece 3D yoğunluğu harita 2D kayma konumlardan sonuçta hesaplanır. Ancak, bu ister 2D veya 3D uzamsal konumu bilinen 3D yoğunluğu harita eşdeğer olduğunu göstermek için idealize edilmiş bir durumdur. (B) bir 3D moleküler yerlerde 2B düzleme bir Kartezyen koordinasyon sistemi (X, Y, Z) mikroskopi görüntüleme tarafından öngörülen. (C) bir çok ince dilim (Δx) a silindir boyut x kesim. (D) C gösterilen dilim 3D kayma yerlerde dar bir 2D bölgesinde tahmin. (E) C. içinde gösterilen ince dilim bütün yerlerde kesit görünümü Bu konumların alt bölgeler arasında eş merkezli halkalardan gruplandırılabilir. Yüksek-numarası rastgele dağıtılmış molekülleri silindir ve kesim çok ince dilim, mekansal yoğunluk yerlerde verilen (pben) her bölgedeki alt (SI) arasında iki komşu yüzük rotasyonel simetrik ve düzgün olacak. Bu konumları daha fazla Y Boyut 1 D tahmin. Mekanlar Y boyuttaki bir histogram ile j sütunları kümelenmiş. Her sütunda (Aj) toplam sayısı eşittir 
, hangi deneysel olarak ölçülebilir (F) gösterildiği gibi. (G-M) Yukarıdaki gibi benzer, dönüştürme işleminin bir tüp periferik bir bölge içinde Difüzyon moleküller için sunulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . 3D kayma aktarım yol SSTR3 için üzerindeki konumunu hız mikroskobu tarafından eşlenen canlı birincil kirpikler. (A) GFP öğesini SSTR3 NPHP4-mCherry tarafından işaretlenmiş TZ üzerinden izleme için uygulanan hız mikroskobu grafik gösterimi. (B) NPHP4-mCherry (kırmızı), AP-SSTR3-GFP (yeşil), dışarıdan AP-SSTR3-GFP (beyaz) etiketlemek için kullanılan Alexa647 Epifluorescence görüntü ve son Birleştirilen görüntüyü. Ölçek çubuğu: 2 µm. (C) bir tek Alexa 647 etiketli AP-SSTR3-dört kare (2 ms/çerçeve) noktası aydınlatma alanı üzerinden geçen GFP (beyaz) izleme. Ölçek çubuğu: NPHP4-mCherry (kırmızı) ve AP-SSTR3-GFP (yeşil) epifluorescence görüntü üzerinde üst üste 2 µm. (D) tek molekül yörünge (beyaz) (c). Ölçek çubuğu: 2 µm. (E) beyaz çizgili kare olayları tek nokta aydınlatma alanı merkezli TZ. Ölçek çubuğu: 2 µm. (F) foton sayısı vs çerçeve grafik tek bir molekül ile bir yüksek sinyal gürültü oranı arka plan Floresans tarafından bölünmüş tek molekül maksimum Floresans bölerek video için numara. (G) foton sayısı vs tek bir molekül düşük sinyal gürültü oranı ile video için sayı grafiği çerçeve. (H) yörünge (e) ve (D) her çerçevede 2D Gauss montaj tarafından lokalize ve 2D Gauss montaj tarafından da lokalize TZ, doğru bir grafik gösterimi üzerinde üst üste. 2D Gauss montaj işlemi bir Gauss işlev ilgi (AOI) tek molekül'ın PSF.(I) 2D süper çözünürlük kayma dağılımını 220 bireysel kapsayan bir alan yoğunluğu profilinin X ve Y boyutlara uygun Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-GFP Mekanlar tek bir birincil cilium toplanan. (J) NPHP4-mCherry (kırmızı) ve AP-SSTR3-GFP (yeşil) epifluorescence görüntü üzerinde üst üste süper çözünürlük tek molekül konumlardan (I). Ölçek çubuğu: elde 2 µm. (K) bir 2D 3D dönüştürme algoritması tarafından Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-GFP R boyuttaki birincil kirpikler üzerinde kayma olasılık yoğunluk dağılımı. Gauss işlev uydurma, Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-öncelikle, 131±3 nm yarıçaplı silier membran ile tam bir yarım en (FWHM) 24±1 nm fazla genişlikte yer alan GFP temel. (L) kesit görünümü birincil kirpikler Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-GFP mekansal olasılık yoğunluk dağılımı (yeşil bulut). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . 3D uzaysal konumunu aktarım yol IFT20 için canlı birincil kirpikler hız mikroskobu tarafından eşlenen içinde. (A-C) Arl13b-mCherry (A) ve IFT20-GFP (B) bir NIH3T3 hücre ve birleştirilmiş (C) ortak ifade temsilcisi görüntüsü. Daire (mavi) olan kenarları IFT20-GFP Floresans hücre beden ve parlak alan aydınlatma tarafından belirlenir (değil bir hücre tarafında (beyaz kesik çizgiler) tek-noktaya aydınlatma hız mikroskobu birincil cilium üzerinde konumunu büyüdü gösterir gösterilen). Ölçek çubuğu: 10 µm. (D) 2D süper çözünürlük kayma dağıtım 286 bireysel IFT20-GFP yerlerden toplanan tek bir birincil cilium. (E) 3B dönüştürme algoritması için bir 2D tarafından IFT20-GFP mekansal olasılık yoğunluk dağılımı R boyuttaki birincil kirpikler içinde elde edilir. Gauss işlev uygun üzerinde bağlı olarak, IFT20-GFP öncelikle bulun 95±1 nm yarıçaplı 56±5 nm yarım maksimumda (FWHM) tam genişliğe sahip. (F) kesit görünümü mekansal olasılık yoğunluk dağılımı (yeşil bulutlar) IFT20-GFP birincil kirpikler, H. ölçek çubuğu şematik ile overlaid içinde: 100 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Simülasyon 2D tek molekül yerleri 2D 3D dönüştürme algoritmaları için güvenilir 3D mekansal olasılık yoğunluk Haritası oluşturma için en az sayıda tahmin etmek için kullanıldı. (A) tek molekül Mekanlar oluşturmayı hesaplama açısından oluşturulan rasgele örnek 95 merkezli Radyal yoğunluğu normal dağılımından 100 nm (bizim deneylerde tespit IFT20 birincil aktarım yol karşılık gelen). Yerelleştirme hassas 16 nm örnek yanında her tek molekül konum için simüle bir normal dağılım σ ile gelen 16 = nm. Gösterildiği gibi Şekil 2C, çok ince dilim (Δx) X boyutu için dönüştürme algoritmaları kullanılır ve bu nedenle X boyutu hesaplama açısından oluşturulan 2D tek molekül yerlerde gösterilmemiştir. (B) dönüştürme Y-boyutlu proje verilerini ve 3D R-boyutlu yoğunluk arasında beş farklı simüle veri kümesi için (her 100 puan) 3D R-boyutlu yoğunlukları, çubuk grafikler oluşturur. Yukarıdaki sayı hata uygun en yüksek pozisyon ± var. (C-D) 250 tek molekül konumlara bağlı simülasyon sonuçları. (E-F) 500 tek molekül konumlara bağlı simülasyon sonuçları. (G-I) 3D yoğunluğu histogramlar 100, 250 ve 500 puan simülasyonlar üzerinden sırasıyla ortalama. Ortalama en yüksek pozisyon ± standart sapma sayıdır zirve yukarıda ederken hata çubukları çubuk grafik depo gözü zirvelere değişkenlik temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı hız mikroskobu uygulamaya birincil cilium, son derece verimli protein araçta güvenen bir hücresel sinyal organel açıklar. Onlar TZ üzerinde ortalanmış tek nokta aydınlatma yoluyla geçerken hız mikroskobu (< 10 nm) konumları fluorescently etiketli moleküller için yüksek çözünürlüklü sağlayabilir. Daha önce NPC6,7,8ile ticareti protein çalışmaya uygulanmıştır. Ancak, herhangi bir alt kırınım hücresel boşluğu kaçakçılığı çalışmaya uzatılabilir. Kayma ve temporal çözünürlüğe sahip canlı hücre sistemleri tek protein taşıma dinamiği yakalamak yapabiliyor bu tekniği yüksek çözünürlüklü diğer görüntüleme teknikleri üzerinde bir avantaja sahiptir < 10 nm ve < 2 ms, anılan sıraya göre. Bir tek fluorescently etiketli bir protein ilgi gerekir ve yapı transfection, protein yerelleştirme hız mikroskobu gerçekleştirme başlamak için eğitimi için ortak bir moleküler biyoloji yaklaşım yoluyla ifade başka bir avantajdır. Bir yüksek güçlü lazer ile tek noktadan aydınlatma iyi ayrılmış, yüksek çözünürlüklü tek molekül konumları sağlar özelliktir akılda tutmak gerekir. Ancak, bu da aydınlatma alanı sınırlar ve teknik geniş alan yerelleştirme için uygun değildir yapar. Neyse ki, istenirse seçim araştırmacılar için çok geniş alan süper çözümleme teknikleri vardır. Göz önünde bulundurulacak başka bir hız mikroskobu sadece tek molekülleri hareketli yerleri yakalar noktasıdır. Bu nedenle, mobil toplam molekülleri kısmını belirlemek için sıkı BAĞLAMAK ile birlikte analiz için yararlı bir ek olabilir.
Kartezyen ve silindirik koordinasyon sistemi arasında dönüştürme işlemi yerine bir 3D Görünüm 3D tek molekül takip dayalı bir sanal 3D olasılık yoğunluk Haritası oluşturmaktır. Ayrıntılı olarak, birincil kirpikler hangi bir üniforma molekül dağılımı belirli RADIUS boyunca yaratacaktır rotasyonel simetrik bir yapıya sahip elektron mikroskobu veri indirdik. Bu tekdüze dağılım silindirik sistemdeki θ boyuttaki kayma dağıtım sabittir yol açar. Sonra 3D koordinatları (R, X, θ)-ebilmek var olmak kolaylaştırmak-2B koordinatları (R, X, Sabit) olmak. Aslında, Kartezyen ve silindirik sistemleri arasında dönüşüm işlemimiz 2D (R, X, Sabit) 2D (X, Y) etmektir. Sürekli θ, ADenklem kullanılarak hesaplanır için mekansal yoğunluk panlamına gelir
(Şekil 2). Vektör hesaplamak için bir matris hesap makinesi kullanın 
, hangi karşılık gelen komşu eş merkezli halkalardan kesit görünümü6,7Aj s arasında göreli alanları ile toplam etkileşim siteleri pozisyon j doğrudan deneylerden ölçülür; Böylece, pben rben, etkileşim sitelerinde kayma olasılık yoğunluğu hesaplanabilir amatris denklemi çözerek.
Kritik bir iletişim kuralındaki herhangi bir pertürbasyon referans resim alma arasındaki tek molekül video mikroskobu kurulumunun en aza indirmek için adımdır. Herhangi bir hareket olursa, güvenle epifluorescence görüntüleme yoluyla elde edildi ultrastructure birincil kirpikler, tek molekül Mekanlar eşleştirmek mümkün değildir. Başka bir önemli adım photobleach için yerel olarak fluorescently etiketli tek moleküllerin konsantrasyonunu azaltmak için aydınlatma alanıdır ama o kadar çok bu nüfus tamamen photobleached. SSTR3 söz konusu olduğunda, difüzyon katsayısı için çözünen molekülleri ile karşılaştırıldığında yavaş ve BM-photobleached SSTR3 molekülleri nüfusu photobleached alanına geri hareket silier drift olduğu zaman iki dakikadan uzun olacak bir Sigara önemsiz faktör. Photobleaching uygun düzeyde ulaşmak zordur ve arka plan Floresans yüksek düzeyde hala varsa, bir açılı aydınlatma lazer üstündeki ve altındaki heyecanlı fluorescently etiketli tek molekülleri azaltmak için kullanılabilir uçak görüntüleme. Bu arka plan azaltmak ve yakalanan her molekülünü sinyal-gürültü oranı geliştirmek.
Özetle, hız mikroskobu kolayca geleneksel mikroskobu kurulumları üzerinde Ayrıca bir lazer aydınlatma kaynağı, ilişkili aynalar ve yüksek hızlı CCD kamera tarafından uygulanması yapabiliyor. Diğer benzer teknikler üzerinde ana gelişme arka plan Floresans büyük ölçüde azaltan eğimli lazer ve 2D tek molekül 3D mekansal olasılık yoğunluk harita yeniden yapılandırır 2D 3D dönüştürme algoritması vardır Mekanlar. Bir biyolojik açıdan hiçbir ilave faiz dışında bir fluorophore Birleşik protein etiketleme gereklidir. Bu özellikleri hız mikroskobu yüksek tek molekülleri izlemek izin kronolojik zamanmekansal (5-10 nm, 0,4-2 ms) çözünürlük rotasyonel simetrik yapıları ile bir alt mikrometre biyo-kavite veya biyo-kanal üzerinden trafik gibi. 3D olasılık yoğunluğu dönüştürme algoritması ile birleştiğinde, tagged proteinlerin 3D ulaşım yolları boşluğu veya kanal yoluyla belirlenebilir. Bu tekniğin uygulanması daha önce 3D ulaşım yolları protein ve RNA'ların NPC ile ayırt etmek için kullanılmış ve işte, bir transmembran protein, SSTR3 ve sitozolik protein, IFT20, 3D taşıma TZ elde göstermektedir birincil kirpikler. 3D-fırtına gibi diğer süper çözümleme teknikleri almış x, y, z pozisyonlar için optik yolundaki tek molekül PSF konumunu üstünde veya altında bağlı olarak asimetrik bir bozulma oluşturan silindirik bir lens yerleştirerek tek molekülleri odak düzlemi28. Başka bir önceden emisyon PSF genişliğini azaltmak ve böylece çözünürlük daha da artırmak için sanal iğne deliği teknolojiyi uygulamak olasıdır. Yukarıdaki teknikleri hız mikroskobu üzerinde oldukça kolayca uygulanabilir. Genel olarak, aynı anda taşıma Kinetik tek molekül düzeyde ve 3D harita Inter - veya intra-organel moleküler kaçakçılığı için süper yüksek çözünürlüklü kronolojik zamanmekansal taşıma yollar belirlemede benzersiz bir yaklaşım hızı mikroskobu sağlar canlı hücre sistemleri belirli koşullar altında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Biz Dr Kristen Verhey (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor) ve Dr. Gregory Pazour (Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi) bazı plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Projenin Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH GM097037, GM116204 ve GM122552 W.Y. için) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
