Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר

Published: September 4, 2017 doi: 10.3791/56476
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2,3
1Lab of Cardiovascular Signaling, Centenary Institute, 2Faculty of Medicine, Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Australian Centre for Microscopy & Microanalysis, University of Sydney

Summary

פרוטוקול זה מדגים את תנאי הגיוס של מחלה מוחית מום חלול במודל של עכברים, שימושים חדות משופרת מיקרו טומוגרפיה כדי למדוד את הנגע הנטל. שיטה זו מגבירה את הערך של העכבר ויצר מודלים ללמוד את הבסיס המולקולרי של טיפולים פוטנציאליים חלול מום מוחי ומחלות אחרות כשאבדן.

Abstract

מוטציות CCM1 (aka KRIT1), CCM2, או CCM3 (aka PDCD10) ג'ין לגרום מום מוחי חלול (CCM) אצל בני אדם. העכבר מודלים של המחלה CCM הוקמו על-ידי מחיקת טמוקסיפן המושרה Ccm גנים בבעלי חיים לאחר הלידה. מודלים אלה העכבר מספקים כלים שלא יסולא בפז לחקור את המנגנון המולקולרי, גישות טיפוליות למחלות CCM. שיטה כמותית ומדויקים כדי להעריך את הנגע נטל והתקדמות חיונית כדי לרתום את הערך המלא של מודלים בעלי חיים אלה. . הנה, נדגים את תנאי הגיוס של מחלת CCM במודל של עכברים, השימוש של הניגוד משופרת רנטגן טומוגרפיה מיקרו (מיקרו-CT) שיטת מדידה CCM הנגע נטל במוח העכבר. ביום כמחנכת 1 (P1), השתמשנו 4-hydroxytamoxifen (4HT) כדי להפעיל Cre פעילות recombinase מ transgene Cdh5-CreErt2 כדי לדבוק אלל floxed של Ccm2. CCM נגעים במוח העכבר נותחו-P8. עבור מיקרו-CT, הפתרון של יוד מבוססי Lugol נעשה שימוש כדי לשפר את הניגודיות ברקמת המוח. יש אופטימיזציה הפרמטרים סריקה ואנו מנוצל מימד voxel של 9.5 מיקרומטר, אשר להוביל בגודל תכונה מינימלי של 25 מיקרומטר. החלטה זו מספיקה למדוד את נפח הנגע CCM ומספר ברחבי העולם ובאופן מדויק, ולספק מיפוי תלת-ממד באיכות גבוהה של CCM נגעים במוח העכבר. שיטה זו מגבירה את הערך של הדגמים העכבר הוקמה כדי ללמוד את הבסיס המולקולרי של טיפולים פוטנציאליים עבור CCM ומחלות אחרות כשאבדן.

Introduction

CCM הם קירות דקים, התרחבו מומים בכלי הדם במוח עם שכיחות של עד 0.5% האוכלוסייה האנושית1. יכול להיות תורשתית CCM כהפרעה דומיננטית בשל אובדן-של-פונקציה מוטציות בגן אחד הגנים 3: CCM1 (aka Krit1), CCM2ו- CCM3 (הנקראת גם PDCD10)2,3,4 5, ,6. גנים אלו נמצאים יחיד איתות מורכבים.

מודלים שונים פותחו למחלה CCM האדם מודל, כדי להבין את המסלולים במורד הזרם של גנים CCM אשר אחראים CCM7,8,9,10. המודל החזקה ביותר היא מותנית למחוק באחד הגנים Ccm עם טמוקסיפן-inducible Cdh5-CreERT2 -P1 הגורים היילוד8,10. הגורים צפויים להיות מודל אידיאלי עבור מחקרים קליניים בחיפוש של מנגנונים, סוכני טיפולית בטיפול במחלות CCM ולפתח CCM נגעים במוח מ- P6 ואילך.

CCM נטל הנגע במוח העכבר יש כבר נמדד בעיקר על ידי שיטות מבוססות-היסטולוגיה, גישה זו זמן רב מאוד, על החוקר הטיה10,11,12. MRI המבוסס על שיטות השתמשו כדי להעריך CCM הנגע נטל העכבר למבוגרים דגם9,13. עם זאת, מאוד מיוחדים מכשיר MRI קטן בעל חיים עם סריקה-זמן של מספר שעות ללון נדרש כדי להגיע לפתרון משביע רצון לזיהוי CCM נגעים. בנוסף, MRI יכול לשמש כדי לזהות נגעים CCM בעכברים neonatal לא דווחה, רזולוציה עשוי להגביל את הרגישות.

לאחרונה פיתחנו שיטה מיקרו-CT תמונה ולנתח CCM הנגע14,15. זה ברזולוציה גבוהה, שיטה חסכונית וזמן באופן דרמטי שיפרה את הערך של מודל המחלה CCM במחקרים מכניסטית וטיפוליים. שיטות לשיפור חדות, כל הר מכתימים שימשו עבור מיקרו-CT הדמיה של רקמות רכות, העכבר עוברי16,17. בעבר, השתמשנו מבוסס-אוסמיום מכתים כדי לשפר את הניגודיות עבור מיקרו-CT הדמיה של CCM נגעים במוח14. בנייר זה, השתמשנו רעיל פחות, גמישה, ומבוססות ריאגנט חסכוניים, יוד הפתרון של Lugol, כדי לשפר את הניגודיות עבור מיקרו-CT הדמיה. יוד יכול לפזר ברחבי המוח, יש זיקה גבוהה בדם18.

פרוטוקול מפורט מוצג כאן את תנאי הגיוס של נגעים CCM במודל של עכברים neonatal יחד עם ההדמיה וניתוח של נגעים CCM עם מבוסס ניגודיות מיקרו-טי בשיטה זו מבוסס מיקרו-CT מספק מדידה הכללית כמותית של נפח הנגע CCM מזהה במדויק את מספר ומיקום תלת-ממדי של CCM נגעים במוח העכבר, מקטינה באופן משמעותי את העלות, הזמן הנדרש כדי פנוטיפ בעלי חיים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל אתיקה בעלי חיים והפרוטוקולים אושרו על-ידי סידני המקומי בריאות בעלי חיים רווחה בוועדה המחוזית, טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת טיאנג'ין לרפואה. כל הניסויים נערכו תחת ההנחיות/התקנות של המכון מאה שנה, אוניברסיטת סידני, טיינג'ין הרפואי האוניברסיטאי

1. אינדוקציה של מומים חלול מוחית במודלים של העכבר

  1. קרוס Cdh5-CreErt2; Ccm2 חליל/חליל עכברים עם Ccm2 חליל/פל ליצירת המלטות עם Cdh5-CreErt2; Ccm2 חליל/חליל (Ccm2 iECKO) הגורים ופקדים littermate (Ccm2 חליל/חליל). Cdh5-CreErt2 ובעלי Ccm2 חליל/חליל היה שתואר לעיל 19.
  2. לפזר 4HT 100% אתנול ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס ב aliquots של 30 µL (ריכוז 4HT: 10 מ"ג/מ"ל). יום של שימוש לדלל 4HT aliquoted בשמן תירס (0.5 mg/mL).
  3. Intragastrically להזריק 50 µL של 4HT (0.5 mg/mL) כדי הגורים neonatal ב P1 לזירוז ניסיוני נגעים CCM באמצעות על מזרק אינסולין.

2. לטעום הכנה מיקרו-CT סורק

  1. המתת חסד הגורים neonatal-P8 באמצעות פחמן דו-חמצני חנק.
  2. לבצע זלוף אינטרה-לב על-ידי הוספת מחט 29-מד עם 3 מ"ל של 2% paraformaldehyde ב- PBS מזרק 10 מ"ל לתוך החדר שבלב העכבר.
    התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.
  3. לנתק את הראש מן הגוף באמצעות מספריים. הסר להוריד הראש באמצעות מספריים את כל העור, קילוף הגולגולת באמצעות מלקחיים לנתח את כל המוח.
  4. לקחת תמונות של המוח עם stereomicroscope-7.82 x הגדלה, 1 x רווח, גמא 0.6, זמן החשיפה 20 ms-
  5. את המוח ביתור עם 4% paraformaldehyde בתמיסה PBS בן לילה.
    התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.
  6. למחרת, ניתוק hindbrains באמצעות מלקחיים ולשטוף עם פתרון PBS.
  7. דגירה של hindbrains ב Lugol ' s יוד לפתרון ה 48
  8. בעקבות הדגירה, בקצרה אוויר יבש את hindbrains להסיר את עודף Lugol ' s יודיפלור תמיסה.
  9. לארוז את Lugol ' s יוד צבעונית hindbrains ב 0.65 mL microcentrifuge צינורות, חותם לחלוטין עם פרפין פלסטיק הסרט כדי למנוע התכווצות רקמות ( איור 2 א).
  10. למקם את צינורות microcentrifuge מ ל צינורות פלסטיק עם ספוגים כדי למנוע מהם לזוז במהלך הסריקה ( איור 2 B).

3. מיקרו-CT לסרוק של CCM במוח העכבר

  1. אנכית לטעון את hindbrain ארוזה בשפופרת בקופסת אלומיניום מערכת מיקרו-CT.
  2. להגדיר את הפרמטרים סריקה תחזיות 540, זמן החשיפה s 2 מקור תנאי 50 kV ו-10 W כדי לרכוש datasets טומוגרפי (תמונה ברזולוציה 9.5 μm לפיקסל).
  3. צילומי מהסריקה משוחזרים באופן אוטומטי על ידי הקרנה מבוססת חומרה שחזור התוכנה שסופקה על-ידי מערכת מיקרו-CT, בהפקת סדרות תמונה של 16 סיביות פרוסות צירית (" TXM " קובץ).

4. ניתוח של מיקרו-CT Datasets

  1. לפתוח את קובץ התמונה המשוחזרת (" TXM " קובץ) בתוכנת ניתוח תלת-ממדי, ולהמחיש את המוח באמצעות " אחסון עיבוד " הפונקציה.
  2. להפוך את hindbrain הכיוון הרצוי באמצעות " התיבה התוחמת " ו- " המטוס מסיכה " פונקציות.
  3. לדגום מחדש את התמונה טרנספורמציה במצב מורחב ולשמר את voxel בגודל.
  4. צור " לערוך שדה תווית חדש " על התמונה טרנספורמציה (4.3) להדגיש רק את hindbrain באמצעות סולם גוני אפור בעוצמה.
  5. להוסיף את האזורים המסומנים ולהפעיל " תווית ניתוח " כדי לקבל מדידות של hindbrain שלם (כלומר, הנפח הכולל ואזור). ייצוא מדידות בקובץ Excel.
  6. להמחיש את hindbrain באמצעות " isosurface עיבוד " הפונקציה.
  7. ליצור עוד " לערוך שדה תווית חדש " על האזורים בתמונה והאר טרנספורמציה עם נגעים באמצעות סולם גוני אפור בעוצמה.
  8. להוסיף את האזורים המסומנים ולהפעיל " תווית " ניתוח כדי לקבל מדידות של נגעים בתוך hindbrain (קרי, הנפח הכולל ואזור). ייצוא מדידות בקובץ Excel.
  9. להמחיש נגעים באמצעות " ליצור משטח " ו " משטח התצוגה " פונקציות.
  10. תמונה התמונות של hindbrain על כיווני הנסיעה או ליצור סרט על ויזואליזציה תלת-ממדי של נגעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זריקה אחת של 4HT-P1 היה מספיק כדי לגרום CCM נגעים המוח הקטן. Lugol של יוד בניגוד המיקרו-CT מספיק זוהה CCM נגעים, יכול לכמת שלה אמצעי האחסון ואת המספר. ניצול של אופטימיזציה של המיקרו-CT, אנחנו עם תמונה CCM נגעים ב hindbrains של Ccm2iECKO עכברים. צילומים סרוקים שוחזרו לייצר תמונות תלת-ממדיות של המוח העכבר, אשר אפשרה ויזואליזציה של נגעים כולו ב- parenchyma המוח-בעומקים שונים וכיוונים, ואת ההערכה של מבנה ומיקום תלת-ממדי של נגעים במוח. חשוב, זו תמונת נתונים (dataset) יכול לשמש גם עבור כימות יעיל ומדויק של הנגע בגדלים ומספרים הנגע.

איור 1 מראה אינדוקציה מוצלחת של נגעים CCM המוח הקטן של Ccm2iECKO (B) אך לא littermate פקדים (Ccm2חליל/חליל) (A)-P8.

איור 2 מציג מדגם ארוזה עבור מיקרו-בדיקת ct (A–B), נציג שיחזר תמונות. מהסריקה מיקרו-CT של שליטה (Ccm2חליל/חליל) (C) ו- Ccm2 iECKO (ד–E). איור 2 E' מראה מסומן נגעים ב- Ccm2iECKO.

איור 3 מראה של תמונה תלת-ממדית של מוח Ccm2iECKO עם נגעים (A–B). שולחן צמוד מראה דוגמה של פלט כמותית של נגעים בודדים עם תוויות.

Figure 1
איור 1 : אינדוקציה של נגעים CCM עכבר neonatal. תמונות מאקרוסקופית של Ccm2חליל/חליל (A) ואת המוח Ccm2iECKO (B) ביום כמחנכת 8. גודל ברים (לבן), 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : לטעום הכנה, שיחזר תמונות דו-ממד- לדוגמה ארוז microcentrifuge tube (א), 5 מ ל צינורות (B). החץ הירוק מראה את הדגימה. תמונות נציג של Ccm2חליל/חליל (C) ואת המוח Ccm2iECKO (D–E). (E') מסומן נגעים במוח Ccm2iECKO . גודל ברים (לבן), 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : עיבוד תמונות תלת-ממדי. עיבוד תמונה של המוח Ccm2iECKO עם נגעים (א) ונגעים היחידה (ב). נגעים מסומנים באדום. טבלה מימין מראה דוגמה של פלט איכותי של נגעים מסומנים בנפרד. גודל ברים (לבן), 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CCM הוא שבץ נפוצה המשפיעה עד 0.5% של יחידים1. CCM יכול להתרחש הטופס ספורדי או משפחתית. פרוגנוזה החולה לעתים קרובות לא ברור כמו נגעים CCM יכול הקרע באופן בלתי צפוי לגרום שבץ מוחי ו השלכות נוירולוגיות אחרות. כיום, הוא אפשרות הטיפול היחידה להסרת נגעים, אשר מלווים בסיכון גבוה.

תנאים אנושיים CCM שפירטתי לאחרונה ב חיה מודלים7,8,9,10. מודלים אלה מספקים כלים שלא יסולא בפז לחקור מנגנונים המעורבים במחלה CCM. שיטת ניתוח מדויק, יעיל, ו כמותיים יעזור לרתום את הערך המלא של מודלים אלה.

לאחרונה פיתחנו שיטה מיקרו-CT כדי התמונה נגעים CCM במודלים של העכבר באמצעות אוסמיום tetraoxide כמו סוכן מנוגדים14. במחקר הנוכחי, לאחר מכן השתמשנו יודיפלור תמיסה של Lugol כדי לשפר את החדות של רקמת המוח לזהות נגעים. פתרון יוד של Lugol הוא פחות רעילים, גמישה, זול יותר בהשוואה לאוסמיום tetraoxide. לפיכך, הדגימות ניתן להשתמש בהם למטרות אחרות, כגון היסטולוגיה לאחר יודיפלור תמיסה של Lugol נשטף הרחק.

שיטת המיקרו-CT שלנו יכול לייצר מספיק איכות התמונה כדי לזהות CCM נגעים במוח העכבר. הכנת הדוגמא היא פשוטה, לא דורשת טכניקות מאוד מיוחדים. שיטה זו יכולה לספק תחזיות ברזולוציה גבוהה עם זמן סריקה כשעה. שילוב datasets סריקות מיקרו-CT ותוכנות אנליזה תלת-ממדי הוא דרך רבת עוצמה כדי ליצור תצוגה תלת-ממדית הכללית של CCM נגעים במוח. הייצוג כמותיים ואיכותיים של נגעים ביחס המוח אנטומיה מושגת בקלות. בהשוואה למבוסס-היסטולוגיה שחזור תלת-ממדי, השיטה שלנו היא מאוד זמן - ו cost - effective ומייצרת הרבה יותר מדויק ייצוגים תלת-ממדי.

עם זאת, יש גם מגבלות שלבים קריטיים כדי להיחשב. ראשית, השיטה דורשת מערכת מיקרו-CT, אשר ציוד מיוחד מאוד, אולי לא יהיו זמינים. שנית, לנתח את מוח העכבר neonatal יכול להיות מאתגר למדי בשל רכות והגודל של רקמת המוח. חשוב מאוד שלא לפגוע במוח במהלך ניתוח על מנת לרכוש מדידות מדויקות והדמיה של נגעים CCM במוח. לבסוף, הכנת הדוגמא עבור מיקרו-בדיקת ct חיוני. חייבים להיות ארוזים לוגול צבעונית המוח לגמרי כדי למנוע התכווצות רקמות בשל התאיידות. כמו כן, דוגמאות יש להציב באופן מאובטח במהלך הסריקה מיקרו-CT. כל תנועה במהלך הסריקה תשנה את איכות הסריקה, ומכאן כימות והדמיה.

לנו יש להחיל את השיטה שלנו רק במוח העכבר neonatal קבוע. אולם, שיטה זו יש את היכולת לשמש עבור אחרים מחקרים שכללו דגימות השונות, עשוי לשמש כלי מרגש הרומן למחקר מום כלי דם אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים להכיר את המתקנים ואת מדעיים וטכניים בסיוע מיקרוסקופ את סידני & במתקן מחקר Microanalysis (AMMRF) ומרכז אוסטרלי עבור Microanalysis (ACMM) ב אוניברסיטת סידני מיקרוסקופיה. מחקרים אלה נתמכו על ידי הבריאות הלאומית האוסטרלית ולהעניק פרוייקט המועצה למחקר רפואי (NHMRC) 161558 ו- APP1124011 (XZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxy tamoxifen Sigma-Aldrich H6278 To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope Leica M205FA To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution Sigma-Aldrich L6146 To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film Parafilm PM992 To package samples
Micro-CT Xradia MicroXCT-400 Micro-CT
3D rendering software FEI Visualization Science group Avizo 3D image processing software To analyse micro-CT scans

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
  2. Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
  3. Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
  4. Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
  5. Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
  6. Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
  7. McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
  8. Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
  9. Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
  10. Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
  11. McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
  12. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  13. Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
  14. Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
  15. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
  18. Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
  19. Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).

Tags

רפואה גיליון 127 מיקרו שחושב טומוגרפיה מום מוחי חלול דגם העכבר מום וסקולרית ג'ין CCM1 Krit1gene
אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, J. P., Yang, X., Foley, M.,… More

Choi, J. P., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model. J. Vis. Exp. (127), e56476, doi:10.3791/56476 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter