Summary
このプロトコルはマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形病の誘導を示し、使用造影病変の負担を測定するマイクロ コンピューター断層撮影。このメソッドは、分子基盤と脳海綿静脈奇形の潜在的な治療とその他の脳血管疾患を勉強する確立されたマウス モデルの価値を高めます。
Abstract
突然変異、 CCM1 (別名 KRIT1)、CCM2、またはCCM3 (別名 PDCD10)遺伝子は人間の脳海綿静脈奇形 (CCM) を引き起こします。CCM 病気のマウスモデルはCcm遺伝子は生後のタモキシフェンによる削除によって設けられています。これらのマウスのモデル分子機構と CCM の病気のための治療上のアプローチを調査するための非常に貴重なツールを提供します。これらの動物モデルの完全な値を活用する病変負担と進行を評価する正確な定量的な方法が欠かせません。ここでは、CCM 病マウスモデルでの誘導を示す、コントラストの使用強化 x 線マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) マウス脳におけるメジャー CCM 病変負担します。生後日 1 (P1)、 Ccm2の floxed の対立遺伝子を切断するのに Cdh5 CreErt2 遺伝子から Cre リコンビナーゼ アクティビティを有効にするのに 4-hydroxytamoxifen (第 4 はレディース) を使用しました。マウス脳における CCM の病変は、P8 で分析しました。マイクロ CT によるヨウ素・ ルゴール液脳組織のコントラストを高めるため使用しています。スキャン パラメーターを最適化し、約 25 μ m の最小機能サイズにつながる 9.5 μ m のボクセル ディメンションを利用しました。この解像度で世界的にかつ正確に、CCM 性病変の容積と数を測定し、高品質マウス脳の CCM 病変の 3次元マッピングを提供するのに十分です。このメソッドは、CCM と他の脳血管疾患の分子基盤と潜在的な療法を研究するため設立されたマウス モデルの価値を高めます。
Introduction
CCM は壁が薄く、人間の人口1で最大 0.5% の有病率と脳の血管の奇形を拡張します。CCM は、3 つの遺伝子の 1 つの機能喪失変異による支配的な障害として継承できる: CCM1 (別名Krit1)、 CCM2、およびCCM3 ( PDCD10とも呼ばれる)2,3,4 ,5,6。これらの遺伝子は、単一の複雑な信号に存在。
モデル CCM 疾患、CCM7,8,9,10は、CCM の遺伝子の下流の経路を理解し、様々 なモデルが開発されています。最も堅牢なモデルは、新生の子犬8,10P1 をタモキシフェン誘導Cdh5 CreERT2とCcmの遺伝子のいずれかを条件付きで削除することです。これらの子犬は、CCM 以降の P6 から脳の病変を開発し、検索メカニズムのための前臨床試験および CCM 病気の治療に治療薬のための理想的なモデルをする予定です。
マウス脳における CCM 病変負担を組織ベースのメソッドは、非常に時間がかかるアプローチによって主に測定し、捜査対象となるバイアス10、11,12。MRI 法は、成体マウス モデル9,13CCM 病変負担を評価するために使用されています。ただし、専門性の高い小さな動物 MRI 計測器と一夜にして数時間の長いスキャン時間は、CCM の病変を識別するための満足のいく解決を達成するために必要です。また、新生仔マウスの CCM の病変を検出するための MRI の使用かどうかは報告されていない、解像度は感度を制限可能性があります。
最近、画像、CCM 病変14,15を分析してマイクロ CT 技術を開発しました。この高解像度、時間とコスト効果の高い方法劇的に解明と治療研究で CCM 病モデルの値をブーストしました。コントラストを向上させる、全体のマウント染色法は、軟部組織、マウス胚16,17のマイクロ CT イメージングのために使用されています。以前は、染色、オスミウム ベース マイクロ CT イメージング脳14CCM 病変のコントラストを高めるために使用している我々。本稿で我々 は毒性の低い、非破壊、使用、コスト効率の高い試薬、ヨウ素によるマイクロ CT 画像のコントラストを高めるため、ルゴール液。ヨウ素脳内に拡散することができますで、血液18の親和性が高い。
詳しいプロトコルはイメージングと共に新生児マウス モデルにおける CCM 斑の誘導とコントラストに基づくマイクロ CT CCM 病変の解析の紹介します。このマイクロ CT 法 CCM 性病変の容積測定の定量的なグローバルの提供数とマウス脳における CCM 病変の 3次元位置を正確に識別、コストの大幅削減し、これらの動物の表現に必要な時間。
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Protocol
すべての動物の倫理およびプロトコルはシドニー ローカル健康地区動物福祉委員会と制度的動物ケア使用委員会 (IACUC) 天津医科大学によって承認されました。センテナリー大学、シドニー大学、天津医科大学のガイドライン/規制の下ですべての実験を行った
1。マウス モデルにおける脳海綿静脈奇形の誘導
- クロス Cdh5-CreErt2;Ccm2 フロリダ州/フロリダ Ccm2 フロリダ州/フロリダ のリットルを生成するマウス Cdh5-CreErt2;Ccm2 フロリダ州/フロリダ (Ccm2 iECKO) 子犬と濾胞 (Ccm2 フロリダ州/フロリダ州)。前述の 19 をされている Cdh5 CreErt2 Ccm2 フロリダ州/フロリダ 動物.
- 100% エタノールで第 4 はレディースを溶解し、30 μ L の因数で-80 ° C で保存 (第 4 はレディース濃度: 10 mg/mL)。コーン油 (0.5 mg/mL) の検体第 4 はレディースを希釈使用の日 。
- 第 4 はレディースの 50 μ L を注入量 (0.5 mg/mL) インスリン注射器を使用して実験の CCM 病変を誘発する P1 で新生児の子犬にします 。
2。マイクロ CT スキャンのための試料調製
- 二酸化炭素窒息を通して P8 で新生児子犬を安楽死させる 。
- マウス心臓の心室に PBS で 10 mL の注射器で 3 ml の 2% のパラホルムアルデヒドの 29 g 針を挿入して心臓内の血流を実行します
。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します 。
- は、はさみを使って体から頭をデタッチします。頭、はさみを使用してすべての皮膚を削除し、剥離鉗子を使用して全体の脳を解剖する頭蓋骨 。
- X 倍率、1 x 利得、0.6 ガンマと露出時間を 20 ms 7.82 顕微鏡で脳の画像を撮影します 。
- は一晩 PBS 溶液中 4% パラホルムアルデヒドで切り裂かれた脳を修正します
。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します 。
- 次の日に、鉗子を使用して hindbrains を取り外し、PBS 溶液で洗浄します 。
- インキュベート ルゴールで hindbrains ' 48 h. の s ヨード溶液
- 次の孵化、簡単に空気乾燥過剰ルゴールを削除する hindbrains ' s ヨード 。
- 、ルゴールをパック ' s ヨード染色 0.65 mL 遠心チューブと組織収縮 ( 図 2 A) を避けるためにプラスチック パラフィン フィルムで完全にシールで hindbrains です 。
- ( 図 2 B) のスキャン中に移動からそれらを防ぐためにスポンジと 5 mL プラスチック チューブにマイクロ遠心チューブ用を配置します 。
3。マイクロ CT スキャンの CCM マウス脳内
- マイクロ CT システムのアルミ ホルダーをチューブでパック後脳を垂直にマウントします 。
- 540 予測と 50 のソースの条件と 2 s の露光時間にスキャン パラメーターを設定 (画像解像度 9.5 μ m/ピクセル) の断層のデータセットを取得する kV と 10 W 。
- スキャンからレントゲン写真が自動的に再構築マイクロ CT システムによって提供されるハードウェア ベースの投影再構成ソフトウェアによって 16 ビット軸スライスの画像シリーズを生産 (" TXM " ファイル).
4。マイクロ ct 画像の解析
- 再建されたイメージ ファイルを開く (" TXM " ファイル) 3次元解析ソフトウェアで脳を使って視覚化し、" ボリューム ・ レンダリング " 関数 。
- 変換による目的のオリエンテーションに菱脳、" 境界ボックス " と " クリップ平面 " 関数 。
- 拡張モードで変換後のイメージをリサンプルし、ボクセル サイズを維持します 。
- 作成 " 新しいラベル] フィールドを編集 " (4.3) の変換後のイメージにグレースケール強度を使用して脳だけを強調表示します 。
- が強調表示されている領域を追加し、実行 " ラベルの分析 " 全体菱脳 (すなわち、総体積と面積) の測定値を取得します。単位の Excel ファイルをエクスポートします 。
- 菱脳使って視覚化、" 等値面表示 " 機能 。
- を別に作成 " 新しいラベル] フィールドを編集 " グレースケール強度による病変でイメージとハイライト部分を変換します 。
- が強調表示されている領域を追加し、実行 " ラベル "、菱脳 (すなわち、総体積と面積) 内病変の測定分析。単位の Excel ファイルをエクスポートします 。
- を使用して病変を可視化、" 表面を生成する " と " 表面図 " 関数 。
- 目的のオリエンテーションでは、菱脳の画像をスナップショットまたは病変の 3次元可視化のための映画を生成します 。
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Representative Results
第 4 はレディース P1 での単回投与は、CCM 小脳病変を誘発するのに十分だった。複方ヨードとは対照的マイクロ CT は十分に CCM 病変を検出し、そのボリュームと数を定量化することができます。最適化されたマイクロ CT を活用し、CCM 病変Ccm2iECKOマウスの hindbrains をイメージしています。異なる深さと方向で脳実質内病変全体の可視化を許可されて、マウスの脳の 3次元画像と構造の評価、脳の病変の 3次元位置を生成するスキャン x 線画像を再構成した.重要なは、この画像のデータセットを効率的かつ正確な定量化病変サイズと最大病変数の使用もできます。
濾胞 (Ccm2フロリダ州/フロリダ) (A) P8 ではなくCcm2iECKO (B) の小脳での CCM 斑の成功誘導を図 1に示します。
図 2のマイクロ ct (A-B)、パックされたサンプルを示しています、再建の代表画像コントロールのマイクロ CT スキャンから (Ccm2フロリダ州/フロリダ州) (C) とCcm2iECKO (D-E)。図 2E' Ccm2iECKO病変をマークを示しています。
Ccm2iECKO脳病変 (A-B) のレンダリング 3 D イメージを図 3に示します。隣接するテーブルは、ラベル付けされた個々 の病変の定量的な出力の例を示します。
図 1: 新生児マウスで CCM 斑の誘導します。Ccm2フロリダ州/フロリダ(A) とは生後 8 日目Ccm2iECKO (B) 脳のマクロ画像。スケール バー (白), 5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 試料調製し、2 D イメージを再構築します。サンプル パック (A) 微量遠心チューブ、5 mL チューブ (B)。緑の矢印は、サンプルを示します。Ccm2フロリダ州/フロリダ(C) とCcm2iECKO (D-E) 脳の代表的なイメージ。(E')Ccm2iECKO脳内病変をマーク。スケール バー (ホワイト) 1 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: 3次元画像をレンダリングします。レンダリング (A) と病変病変でCcm2iECKO脳の画像のみ (B)。病変は赤でマークされます。右側のテーブルは、個別にマークされている病変の質的な出力の例を示します。スケール バー (ホワイト) 1 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
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Discussion
CCM は、個人1の 0.5% まで影響を与える一般的な血管の奇形です。CCM は、散発的なまたは家族性の形で発生します。患者の予後の CCM 病変がストロークやその他の神経学的な結果を引き起こすことが突然破裂、しばしば明らかではありません。現在、唯一の治療法の選択肢は外科的伴われる高リスク病変を取り除くことです。
人間の CCM 条件で再現された最近の動物モデル7,8,9,10。これらのモデルは、CCM 病に関与するメカニズムを調査するための非常に貴重なツールを提供します。正確、効率的、かつ定量的解析法は、これらのモデルの完全な値を活用するのに役立ちます。
マイクロ CT 法対照的なエージェント14として四酸化オスミウムを用いたマウス モデル画像 CCM 病変を最近開発しました。現在の研究では、我々 はその後病変を検出するのに脳組織のコントラストを高めるため複方ヨードを使用しています。複方ヨードは、毒性が低く、非破壊、オスミウム四酸化に比べて安いです。したがって、サンプルは複方ヨード液が洗い流された後は組織学など、他の目的で再利用できます。
当社のマイクロ CT 法は、マウス脳における CCM の病変を検出する十分な画質を作り出すことができます。サンプル準備は簡単で、高度な専門技術を必要としません。このメソッドは、スキャン時間を約 1 時間で高解像度プロジェクションを提供できます。マイクロ CT スキャンや 3次元解析ソフトウェアからデータセットを組み合わせることは、脳の CCM 病変の 3次元グローバル ビューを生成する強力な方法です。脳の解剖学を基準にして病変の定量的および定性的な表現が簡単に実現します。組織ベースの 3次元復元と比較して、提案手法は高度の時間- とよりよい成果より正確な 3次元表現を生成します。
ただし、制限や考慮すべき重要なステップはまたです。まず、メソッドには、専門性の高い機器であり容易に利用できないかもしれないマイクロ CT システムが必要です。第二に、新生仔マウスの脳を解剖と、柔らかさと脳組織のサイズのためにかなり挑戦することができます。脳内 CCM 病変の可視化と正確な測定を得るために解剖時に脳に損傷を与えることは非常に重要です。最後に、マイクロ CT スキャンのサンプル準備は重要です。脳を染色複方ヨード ・ グリセリンは、蒸発による組織の収縮を避けるために完全に収納してください。また、サンプルは、マイクロ CT スキャン中に安全に置かれなければなりません。任意動きのスキャン中に、スキャンの品質を変更と、それゆえの定量化と可視化。
私たちメソッドは固定の新生児マウス脳でのみに用いています。ただし、このメソッドの異なるサンプルを含む他の研究に使用する能力を持っているし、他の血管奇形研究の刺激的で新しいツールとして役立つかもしれない。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、施設、顕微鏡 & シドニー大学で微量分析 (ACMM) のシドニー顕微鏡 & 微量分析研究施設 (AMMRF) およびオーストラリアの中心の科学的な技術的な支援を認めます。これらの研究に支えられたオーストラリアの国民の健康と医療研究評議会 (NHMRC) プロジェクトを与える 161558 と APP1124011 (XZ)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
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