Summary
Denne protokollen demonstrerer induksjon av cerebral kavernøse misdannelse sykdom i en musemodell og bruker kontrast forbedret mikro beregnet tomografi for å måle lesjon byrden. Denne metoden øker verdien av etablerte musen modeller å studere molekylære grunnlag og mulige behandlingsformer for cerebral kavernøse misdannelse og andre cerebrovascular sykdommer.
Abstract
Mutasjoner i de CCM1 (aka KRIT1), CCM2, eller CCM3 (aka PDCD10) gene forårsaker cerebral kavernøse misdannelse (CCM) hos mennesker. Musen modeller av CCM sykdom er etablert av tamoxifen indusert sletting av Ccm gener i postnatal dyr. Disse musen modeller gir uvurderlig verktøy for å undersøke molekylær mekanisme og terapeutiske metoder for CCM sykdom. En nøyaktig og kvantitativ metode for å vurdere lesjon byrden og progresjon er viktig å utnytte den fulle verdien av disse dyremodeller. Her viser vi induksjon av CCM sykdom i en musemodell og bruk av kontrasten forbedret X-ray mikro beregnet tomografi (mikro-CT) metode for å måle CCM lesjon byrden i musen hjernen. På postnatal dag 1 (P1) brukte vi 4-hydroxytamoxifen (4HT) for å aktivere grobunn recombinase aktivitet fra Cdh5-CreErt2-transgene deler floxed allelet av Ccm2. CCM lesjoner i musen hjernen ble analysert på P8. For mikro-CT, ble jod basert Lugol løsning brukt til å forbedre kontrasten i hjernevev. Vi har optimalisert parametere for søk i og utnyttet en voxel dimensjon på 9,5 µm, som fører til en minste mønsterstørrelsen for ca 25 µm. Denne løsningen er tilstrekkelig å måle CCM lesjon volum og antall globalt og nøyaktig, og gir høy kvalitet 3D tilordning av CCM lesjoner i musen hjernen. Denne metoden øker verdien av de etablerte mus modellene å studere molekylære grunnlag og mulige behandlingsformer for CCM og andre cerebrovascular sykdommer.
Introduction
CCM er tynne vegger, utvidet vaskulær Misdannelser i hjernen utbredelse av opp til 0,5% i befolkningen1. CCM kan arves som en dominerende lidelse på grunn av tap av funksjon mutasjoner i en av tre gener: CCM1 (aka Krit1), CCM2og CCM3 (også kalt PDCD10)2,3,4 ,5,6. Disse genene er tilstede i en enkelt signalering komplekse.
Ulike modeller er utviklet modellen menneskelig CCM sykdom og forstå nedstrøms veier av CCM gener som er ansvarlig for CCM7,8,9,10. Mest robuste modellen er betinget slette ett av Ccm genene med tamoxifen-induserbart Cdh5-CreERT2 på P1 i newborn pups8,10. Disse hvalpene utvikle CCM lesjoner i hjernen fra P6 videre og er forventet å være en ideell modell for pre kliniske studier i Søk etter mekanismer og terapeutiske agenter i behandling av CCM sykdommer.
CCM lesjon byrden i musen hjernen har blitt målt av histology-baserte metoder, en tilnærming som er svært tidkrevende og underlagt etterforsker skjevhet10,11,12. Mr basert metoder brukes til å vurdere CCM lesjon byrden i voksen mus modell9,13. Et høyt spesialiserte små dyr MRI instrument og skanning-lenge på flere timer natten er imidlertid nødvendig å oppnå en tilfredsstillende løsning å identifisere CCM lesjoner. Også om Mr kan brukes til å oppdage CCM lesjoner i neonatal mus er ikke rapportert og oppløsning kan begrense følsomhet.
Vi har nylig utviklet en mikro-CT teknikk for å image og analysere CCM lesjon14,15. Dette høy oppløsning, tid og kostnadseffektiv metode økt dramatisk verdien av CCM sykdom modellen i mekanistisk og terapeutiske studier. Kontrast-forsterke, hele mount flekker metoder brukes for mikro-CT avbildning av bløtvev og mus embryo16,17. Vi har tidligere brukt en osmium-basert flekker for å forbedre kontrasten for mikro-CT avbildning av CCM lesjoner i hjernen14. I dette papiret, vi brukte en mindre giftig, ikke-destruktiv, og kostnadseffektiv reagens, en jod basert Lugol løsning, for å forbedre kontrasten for mikro-CT bildebehandling. Jod kan diffus gjennom hjernen og har høy affinitet for blod18.
Detaljert protokollen er presentert her for induksjon av CCM lesjoner i en neonatal musemodell med avbilding og analyse av CCM lesjoner med en kontrast-baserte mikro-CT. Denne mikro-CT basert metoden gir kvantitative globale måling av CCM lesjon volum, nøyaktig identifiserer antall og 3D plassering av CCM lesjoner i musen hjernen og reduserer kostnadene og tiden som kreves fenotypen disse dyrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle dyreetikk og protokoller var godkjent av Sydney lokale helse distriktet dyr velferd komiteen og institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Tianjin medisinske universitet. Alle eksperimentene ble utført under retningslinjer/regler hundreårsjubileum Institutt, Universitetet i Sydney og Tianjin medisinske universitet
1. Induksjon av Cerebral kavernøse misdannelser i musen modeller
- krysser Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl mus med Ccm2 fl/fl generere kull med Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) pups og littermate kontroller (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 og Ccm2 fl/fl dyr har vært beskrevet tidligere 19.
- Løses 4HT i 100% etanol og lagre på-80 ° C i dele 30 µL (4HT konsentrasjon: 10 mg/mL). Ved bruk, fortynne aliquoted 4HT i maisolje (0,5 mg/mL).
- Intragastrically injisere 50 µL av 4HT (0,5 mg/mL) til neonatal pups på P1 å indusere eksperimentelle CCM lesjoner med en insulinsprøyte.
2. Prøve forberedelse til mikro-CT skanner
- Euthanize neonatal pups på P8 via karbondioksid kvelning.
- Utføre intra cardiac perfusjon ved å sette en 29-gauge nål med 3 mL 2% paraformaldehyde i PBS i en 10 mL sprøyte i ventrikkel hjertets musen.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig; Bruk passende sjerm. - Koble hodet fra kroppen med en saks. Fjerne alle hud av hodet med en saks og løsner skallen ved hjelp av pinsett for å analysere hele hjernen.
- Tar bilder av hjernen med stereomicroscope på 7.82 x forstørrelse, 1 x gevinst, 0,6 gamma og 20 ms eksponeringstid.
- Fikse dissekert hjernen med 4% paraformaldehyde i PBS løsning natten.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig; Bruk passende sjerm. - På dagen koble hindbrains med en tang og vask med PBS løsning.
- Ruge hindbrains i Lugol ' s joden løsning for 48 h.
- Etter inkubasjon kort luften tørr hindbrains å fjerne overflødig Lugol ' s joden løsning.
- Pakke av Lugol ' s jod farget hindbrains i 0,65 mL microcentrifuge rør og sel helt med plast parafin film å unngå vev krymping ( figur 2 A).
- Plasserer microcentrifuge rør i 5 mL plast rør med svamper å hindre dem i å flytte under søk ( figur 2 B).
3. Mikro-CT Scan av CCM i musen hjernen
- vertikalt montere hindbrain pakket i et rør på en aluminium holder i mikro-CT systemet.
- Angi parametere for skanning til 540 anslag og 2 s eksponeringstid kilde forholdene på 50 kV og 10 W å erverve tomographic datasett (bilde oppløsning 9.5 μm/bildepunkt).
- Røntgenbilder fra søket er rekonstruert automatisk av maskinvarebasert projeksjon rekonstruksjon programvaren leveres av mikro-CT systemet, produsere en bildet serien av 16-biters aksial skiver (" TXM " fil).
4. Analyse av mikro-CT datasett
- åpne filen rekonstruert bilde (" TXM " fil) i 3D analyseprogramvare og visualisere hjernen ved hjelp av " volumgjengivelse " funksjonen.
- Transformere hindbrain på ønsket papirretning ved hjelp den " markeringsrammen " og " beskjæringsplanet " funksjoner.
- Oppdaterer transformert bildet i utvidet modus og bevare voxel størrelsen.
- Opprett " redigere nye etikettfeltet " på transformert bildet (4.3) og markere bare hindbrain bruke gråtoner intensitet.
- Legge til de merkede områdene og kjøre " etiketten analyse " til å foreta målinger av hele hindbrain (dvs., totalt volum og området). Eksportere målinger i en Excel-fil.
- Visualisere hindbrain ved hjelp av " isosurface gjengivelse " funksjonen.
- Opprette en annen " redigere nye etikettfeltet " på transformert bildet og høydepunkt områder med lesjoner med gråtoner intensitet.
- Legge til de merkede områdene og kjøre " etiketten " analyse til å foreta målinger av lesjoner i hindbrain (dvs., totalt volum og området). Eksportere målinger i en Excel-fil.
- Visualisere lesjoner med den " generere overflate " og " overflaten visning " funksjoner.
- Bilde bilder av hindbrain på ønsket orientering eller generere en film for 3-D visualisering av lesjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkelt injeksjon av 4HT på P1 var tilstrekkelig til å indusere CCM lesjoner i lillehjernen. Lugol jod kontrast mikro-CT tilstrekkelig oppdaget CCM lesjoner og kunne kvantifisere volum og tall. Utnytte optimalisert mikro-CT, fotografert vi CCM lesjoner i hindbrains Ccm2iECKO mus. X-ray skannede ble ombygget for å produsere 3D-bilder av musen hjernen, som tillatt visualisering av hele lesjoner i hjernen parenchyma på ulike dybder og orientering og vurdering av strukturen og 3D plassering av lesjoner i hjernen. Viktigere, kan dataset bildet også brukes for effektiv og nøyaktig kvantifisering av lesjon størrelser og lesjon tall.
Figur 1 viser vellykket induksjon av CCM lesjoner i lillehjernen av Ccm2iECKO (B) men ikke i littermate kontroller (Ccm2fl/fl) (A) at P8.
Figur 2 viser et pakket eksempel mikro-CT skanning (A-B) og representant rekonstruert bilder fra mikro-CT-skanning av kontroll (Ccm2fl/fl) (C) og Ccm2 iECKO (D--E). Figur 2 E' viser merket lesjoner i Ccm2iECKO.
Figur 3 viser en gjengitte 3D bilde av en Ccm2iECKO hjernen med lesjoner (A-B). Tilstøtende tabellen viser et eksempel på kvantitative produksjon av merket personlige lesjoner.
Figur 1 : Induksjon av CCM lesjoner i neonatal mus. Makroskopisk bilder av Ccm2fl/fl (A) og Ccm2iECKO (B) hjerner ved postnatal dag 8. Skalere barer (hvit), 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Prøve forberedelse og 2D-bilder på nytt. Eksempel pakket i en microcentrifuge rør (A) og 5 mL rør (B). Grønn pil viser utvalget. Representant bilder av Ccm2fl/fl (C) og Ccm2iECKO (D-E) hjerner. (E') Merket lesjoner i Ccm2iECKO hjernen. Skalere barer (hvit), 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Gjengitt 3D bilder. Gjengitt bilde av Ccm2iECKO hjernen med lesjoner (A) og lesjoner bare (B). Lesjoner er merket i rødt. Tabellen til høyre viser et eksempel på kvalitative produksjon av individuelt merket lesjoner. Skalere barer (hvit), 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CCM er en vanlig vaskulær misdannelse som påvirker opptil 0,5% av personer1. CCM kan skje sporadisk eller familiær. Pasienten prognose er ofte uklare som CCM lesjoner kan brudd uventet for å forårsake slag og andre nevrologiske konsekvenser. Foreløpig er den eneste behandlingsalternativet å kirurgisk fjerne lesjoner, som er ledsaget av høy risiko.
Menneskelige CCM forhold har nylig blitt gjengitt i dyr modeller7,8,9,10. Disse modellene gir uvurderlig verktøy for å undersøke mekanismer involvert i CCM sykdom. En nøyaktig, effektiv og kvantitativ analyse metoden hjelper deg for å utnytte den fulle verdien av disse modellene.
Vi har nylig utviklet en mikro-CT metode å bilde CCM lesjoner i musen modeller bruker osmium tetraoxide som et kontrasterende agent14. I denne studien, har vi brukt Lugol joden løsning for å forbedre kontrasten av hjernevev for å oppdage lesjoner. Lugol joden løsning er mindre giftig, ikke-destruktiv og billigere sammenlignet med osmium tetraoxide. Derfor kan prøver gjenbrukes for andre formål, for eksempel histology etter Lugol joden løsning er vasket bort.
Vår mikro-CT metoden kunne produsere nok bildekvalitet for å oppdage CCM lesjoner i musen hjernen. Eksempel utarbeidelsen er enkelt og krever ikke høyt spesialiserte teknikker. Denne metoden kan gi høy oppløsning anslag med skanningen tid på omtrent én time. Kombinerer datasett fra mikro-CT skanner og 3D analyseprogramvare er en effektiv måte å generere en 3D visningen av CCM lesjoner i hjernen. Kvantitative og kvalitative representasjon av lesjoner i forhold til hjernen anatomi er lett oppnådd. Sammenlignet med histology-basert 3D rekonstruksjon, vår metode er svært tid - og kostnadseffektive og produserer mye mer nøyaktig 3D representasjoner.
Men er det også begrensninger og avgjørende skritt å bli vurdert. For det første krever metoden en mikro-CT system, som er svært spesialiserte utstyr og kan ikke være lett tilgjengelig. Dernest kan dissekere neonatal musen hjernen være ganske utfordrende mykhet og størrelsen på hjernevev. Det er veldig viktig ikke å skade hjernen under disseksjon for å få nøyaktige målinger og visualisering av CCM lesjoner i hjernen. Endelig er utvalg forberedelse til mikro-CT scan kritiske. Lugol jod farget hjerner må pakkes helt for å unngå vev krymping på grunn av fordamping. Også må prøver plasseres trygt under mikro-CT skanningen. Enhver bevegelse under skanningen vil endre kvaliteten på skanningen og dermed kvantifisering og visualisering.
Vi har brukt vår metode bare i fast neonatal musen hjernen. Men denne metoden har kapasitet til å brukes for andre studier som involverer forskjellige prøver og kan tjene som et spennende og romanen verktøy for andre vaskulær misdannelse forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter fasiliteter og vitenskapelig og teknisk assistanse av Sydney mikroskopi & Microanalysis forskning anlegget (AMMRF) og australske sentrum mikroskopi & Microanalysis (ACMM) på Universitetet i Sydney. Disse studiene ble støttet av Australian National Health og Medical Research Council (NHMRC) prosjektstøtte 161558 og APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
