Summary
Este protocolo demonstra a indução da doença malformação cavernosa cerebral em um modelo do rato e usa contraste aprimorado micro computadorizada para medir carga de lesão. Esse método aumenta o valor dos modelos de rato estabelecida para estudar a base molecular e terapias potenciais para malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.
Abstract
Mutações no CCM1 (aka KRIT1), CCM2, ou CCM3 (aka PDCD10) gene causar malformação cavernosa cerebral (CCM) em seres humanos. Modelos do rato da doença CCM foram estabelecidos pela exclusão de tamoxifeno induzido de Ccm genes em animais pós-natal. Esses modelos de rato fornecem ferramentas de valor inestimáveis para investigar o mecanismo molecular e abordagens terapêuticas para a doença CCM. Um método exato e quantitativo para avaliar a progressão e o fardo da lesão é essencial para aproveitar o valor total desses modelos animais. Aqui, demonstramos a indução da doença do CCM em um modelo do rato e o uso do contraste melhorado método de (micro-CT) radiografia computadorizada micro medida CCM encargo de lesão no cérebro de rato. No dia pós-natal 1 (P1), usamos 4-hydroxytamoxifen (4HT) para ativar a atividade de recombinase Cre do transgene de Cdh5-CreErt2 para decompor o alelo floxed de Ccm2. Lesões do CCM em cérebro de rato foram analisadas em P8. Para o micro-CT, solução de Lugol à base de iodo foi usada para aumentar o contraste no tecido cerebral. Nós temos otimizado os parâmetros de verificação e utilizou uma dimensão de voxel de 9,5 µm, que levam a um tamanho mínimo de recurso de aproximadamente 25 µm. Esta resolução é suficiente para medir o número e volume de lesão CCM globalmente e com precisão e fornecer alta qualidade 3D mapeamento de lesões do CCM em cérebro de rato. Esse método aumenta o valor dos modelos rato estabelecida para estudar as bases moleculares e terapias potenciais para CCM e outras doenças cerebrovasculares.
Introduction
CCM são de paredes finas, dilatado malformações vasculares no cérebro, com prevalência de até 0,5% na população humana1. CCM pode ser herdada como uma desordem dominante devido a mutações de perda de função em um dos três genes: CCM1 (aka Krit1), CCM2e CCM3 (também chamado PDCD10)2,3,4 ,5,6. Estes genes estão presentes em um único complexo de sinalização.
Foram desenvolvidos vários modelos para doenças humanas de CCM modelo e entender os caminhos a jusante de genes CCM que são responsáveis por CCM7,8,9,10. O modelo mais robusto é condicionalmente excluir qualquer um dos genes Ccm com tamoxifeno-inducible Cdh5-CreERT2 em P1 em filhotes recém-nascidos8,10. Esses filhotes desenvolvem lesões CCM no cérebro de P6 para a frente e são esperados para ser um modelo ideal para estudos pré-clínicos em busca de mecanismos e agentes terapêuticos no tratamento de doenças do CCM.
Fardo de lesão CCM em cérebro de rato foi medido principalmente pelos métodos baseados em histologia, uma abordagem que é extremamente demorado e sujeito a investigador viés de11,10,12. MRI com base em métodos foram usados para avaliar a carga de lesão CCM no rato adulto modelo9,13. No entanto, um instrumento de MRI animal pequeno altamente especializado e varredura-tempo de várias horas durante a noite é necessária para alcançar uma resolução satisfatória para identificar lesões CCM. Também, não foi relatada se ressonância magnética pode ser usada para detectar lesões do CCM em camundongos Neonatais e resolução pode limitar a sensibilidade.
Recentemente desenvolvemos uma técnica de micro-CT para imagem e analisar CCM lesão14,15. De alta resolução, tempo e método cost-effective dramaticamente impulsionaram o valor do modelo de doença CCM em estudos terapêuticos e mecanicistas. Melhorar o contraste, toda montagem coloração métodos têm sido utilizados para a imagem latente de micro-CT dos tecidos moles e rato embriões16,17. Anteriormente, usamos uma baseada no ósmio de coloração para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT de lesões do CCM no cérebro14. Neste trabalho, usamos um menos tóxico, não-destrutivo, e reagente custo-eficiente, um iodo solução baseada em solução de Lugol, para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT. Iodo pode difundir em todo o cérebro e tem uma elevada afinidade para sangue18.
O protocolo detalhado é apresentado aqui para a indução de lesões do CCM em um modelo de rato neonatal, junto com a imagem e análise de lesões CCM com uma contraste baseados micro-CT. Este método baseado em micro-CT fornece medição global quantitativa do volume de lesão do CCM, identifica com precisão o número e a localização em 3D das lesões do CCM no cérebro do rato e reduz o custo e tempo necessário para o fenótipo desses animais.
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Protocol
todos os protocolos e ética animal foram aprovados pelo The Sydney Local Saúde Animal Welfare Comissão distrital e institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de medicina de Tianjin. Todos os experimentos foram conduzidos em Diretrizes/Regulamento do centenário Instituto, Universidade de Sydney e a Universidade de medicina de Tianjin
1. Indução de malformações cavernosas cerebrais em modelos de Mouse
- Cruz Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl ratos com Ccm2 fl/fl para gerar ninhadas com Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl filhotes (Ccm2 iECKO) e controles littermate (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 e Ccm2 fl/fl animais têm sido descritas anteriormente 19.
- Dissolver 4HT em 100% de etanol e armazenar a-80 ° C, em alíquotas de 30 µ l (4HT concentração: 10 mg/mL). No dia do uso, diluir aliquotadas 4HT em óleo de milho (0,5 mg/mL).
- Intragastrically injetar 50 µ l de 4HT (0,5 mg/mL) para filhotes neonatais em P1 para induzir lesões CCM experimentais utilizando uma seringa de insulina.
2. Preparação para Micro-CT Scans da amostra
- eutanásia neonatais filhotes no P8 através de dióxido de carbono asfixia.
- Realizar a perfusão intra cardíaca através da inserção de uma agulha de calibre 29 com 3 mL de 2% paraformaldeído em PBS em uma seringa de 10 mL para o ventrículo do coração do mouse.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar proteção adequada. - Separar a cabeça do corpo usando uma tesoura. Remova toda a pele se a cabeça usando uma tesoura e descolar o crânio usando fórceps para dissecar o cérebro todo.
- Tirar fotos do cérebro com duas oculares em 7,82 x ampliação, 1 x ganho, 0,6 gama e tempo de exposição de 20 ms.
- Consertar o cérebro dissecado com paraformaldeído 4% em solução de PBS durante a noite.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar proteção adequada. - No dia seguinte, desanexar hindbrains usando uma pinça e lavar com solução de PBS.
- Incubar os hindbrains no Lugol ' s solução de iodo por 48 h.
- Após a incubação, brevemente ar seco os hindbrains para remover o excesso Lugol ' solução de iodo de s.
- Pack o Lugol ' iodo s manchado hindbrains em 0,65 mL microcentrifuge tubos e selo completamente com filme plástico parafina para evitar o encolhimento do tecido ( Figura 2).
- Coloque microcentrifuga tubos em tubos de plástico de 5 mL com esponjas para impedir a movimentação durante a verificação ( Figura 2 B).
3. Micro-CT Scan do CCM no cérebro do rato
- verticalmente, montar o rombencéfalo embalado em um tubo em um suporte de alumínio no sistema de micro-CT.
- Definir os parâmetros de digitalização para 540 projeções e tempo de exposição 2 s com condições de fonte de 50 kV e 10 W para adquirir os conjuntos de dados tomográficos (imagem resolução 9,5 μm/pixel).
- Radiografias do exame são reconstruídas automaticamente pelo software de reconstrução de projeção baseada em hardware fornecido pelo sistema micro-CT, produzindo uma série de imagem de 16 bits fatias axiais (" TXM " arquivo).
4. Análise de conjuntos de dados Micro-CT
- abrir o arquivo de imagem reconstruída (" TXM " arquivo) do software de análise em 3D e visualizar o cérebro usando o " renderização de volume " função.
- Transformar o rombencéfalo à orientação desejada usando o " caixa delimitadora " e " plano de recorte " funções.
- Resample na imagem transformada em modo estendido e preservar o tamanho de voxel.
- Criar " editar novo rótulo de campo " na imagem transformada (4.3) e destacar apenas o rombencéfalo usando intensidade greyscale.
- Adicionar as áreas destacadas e executar " etiqueta análise " para obter medições do rombencéfalo inteira (ou seja, total volume e área). Exportar as medições em um arquivo Excel.
- Visualizar o rombencéfalo usando o " isosuperfície renderização " função.
- Criar outro " editar novo rótulo de campo " sobre as áreas de imagem e destaque transformadas com lesões usando a escala de cinzentos intensidade.
- Adicionar as áreas destacadas e executar " rótulo " análise para obter medições das lesões dentro do rombencéfalo (i.e., volume total e área). Exportar as medições em um arquivo Excel.
- Visualizar as lesões utilizando o " gerar superfície " e " vista de superfície " funções.
- As imagens do rombencéfalo em orientações desejados de instantâneo ou gerar um filme para visualização em 3D das lesões.
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Representative Results
Uma única injeção de 4HT no P1 foi suficiente para induzir lesões CCM no cerebelo. Solução de Lugol iodo contrastado micro-CT suficientemente detectado lesões CCM e podia quantificar o volume e o número. Estamos utilizando o micro-CT otimizado, fotografada lesões CCM nos hindbrains de Ccm2iECKO ratos. Imagens digitalizadas de raios-x foram reconstruídas para produzir imagens em 3D do cérebro do rato, que permitiu a visualização de lesões inteiras no parênquima cerebral em diferentes profundidades e orientações e avaliação da estrutura e localização em 3-d de lesões no cérebro. Importante, este conjunto de dados de imagem também pode ser usado para quantificação eficiente e precisa da lesão tamanhos e números de lesão.
A Figura 1 mostra o sucesso da indução de lesões CCM no cerebelo de Ccm2iECKO (B), mas não em controles littermate (Ccm2fl/fl) (A) à P8.
A Figura 2 mostra uma amostra embalada para microtomografia computadorizada (A–B), e representante reconstruída de imagens da microtomografia computadorizada de controle (Ccm2fl/fl) (C) e Ccm2 iECKO (D–E). Figura 2 E' mostra marcada lesões em Ccm2iECKO.
A Figura 3 mostra uma imagem renderizada em 3D de um cérebro Ccm2iECKO com lesões (A–B). Tabela ao lado mostra um exemplo de saída quantitativa das lesões individuais rotuladas.
Figura 1 : Indução de lesões do CCM no rato neonatal. Imagens macroscópicas de Ccm2fl/fl (A) e cérebros Ccm2iECKO (B) no 8º dia pós-natal. Escala de barras (branco), 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Preparação da amostra e reconstruída 2D imagens. Amostra embalado em um tubo de microcentrifugadora (A) e 5 mL de tubos (B). Seta verde mostra a amostra. Imagens representativas de Ccm2fl/fl (C) e cérebros Ccm2iECKO (D–E). (E') Marcado lesões no cérebro Ccm2iECKO . Escala de barras (branco), 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : 3D imagens renderizadas. Imagem do cérebro Ccm2iECKO com lesões (A) e lesões processado única (B). As lesões são marcadas em vermelho. Tabela à direita mostra um exemplo de saída qualitativa das lesões individualmente marcadas. Escala de barras (branco), 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
CCM é uma malformação vascular comum que afeta até 0,5% de indivíduos1. CCM pode ocorrer de forma esporádica ou familiar. Prognóstico do paciente é muitas vezes pouco claro como lesões CCM podem romper inesperadamente para causar acidente vascular cerebral e outras consequências neurológicas. Atualmente, a único tratamento opção é remover cirurgicamente lesões, que são acompanhadas de alto risco.
Recentemente foram reproduzidas em condições humanas de CCM animal modelos7,8,9,10. Esses modelos fornecem ferramentas de valor inestimáveis para investigar os mecanismos envolvidos na doença de CCM. Um método de análise quantitativa, eficientes e precisos vai ajudar a aproveitar o valor total desses modelos.
Recentemente desenvolvemos um método de micro-CT para lesões CCM imagem em modelos de rato usando o tetróxido de ósmio como um contrastante agente14. No estudo atual, posteriormente usamos solução do iodo de Lugol para realçar o contraste do tecido cerebral para detectar as lesões. Solução de iodo de Lugol é menos tóxico, não-destrutivos e mais barato em comparação com tetróxido de ósmio. Portanto, as amostras podem ser reutilizadas para outros fins, tais como histologia depois de solução de iodo de Lugol lavada.
Nosso método de micro-CT poderia produzir qualidade de imagem suficiente para detectar lesões do CCM no cérebro do rato. A preparação da amostra é simples e não requer técnicas altamente especializadas. Esse método pode fornecer projeções de alta resolução com um tempo de varredura de aproximadamente uma hora. Combinando conjuntos de dados de microtomografia computadorizada e análise 3D software é uma maneira poderosa para gerar uma visão global 3-d de lesões CCM no cérebro. A representação quantitativa e qualitativa das lesões em relação à anatomia do cérebro é facilmente alcançada. Comparado a reconstrução 3D baseados em histologia, nosso método é altamente tempo - e cost - effective e produz muito mais exatas representações 3D.
No entanto, também existem limitações e passos críticos para ser considerada. Em primeiro lugar, o método requer um sistema de micro-CT, que é equipamento altamente especializado e pode não estar prontamente disponíveis. Em segundo lugar, dissecar o cérebro de rato neonatal pode ser bastante desafiador devido a suavidade e o tamanho do tecido cerebral. É muito importante para não danificar o cérebro durante a dissecção, a fim de adquirir as medidas exatas e visualização das lesões CCM no cérebro. Por último, a preparação da amostra para microtomografia computadorizada é fundamental. De Lugol manchado cérebros deve ser embalado completamente para evitar o encolhimento do tecido devido a evaporação. Também, as amostras devem ser colocadas firmemente durante a microtomografia computadorizada. Qualquer movimento durante a verificação irá alterar a qualidade da digitalização e, consequentemente, a quantificação e a visualização.
Nós aplicamos nosso método somente no cérebro do rato neonatal fixo. No entanto, este método tem a capacidade de ser usado para outros estudos envolvendo diferentes amostras e pode servir como uma excitante e inovadora ferramenta para outra investigação de malformação vascular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem as instalações e a assistência científica e técnica de a Sydney microscopia & microanálise Research Facility (AMMRF) e o centro australiano para microscopia & microanálise (ACMM) na Universidade de Sydney. Estes estudos foram apoiados pela Australian National Health e projeto de Conselho de pesquisa médica (NHMRC) conceder 161558 e APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
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