Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Индукция и микро-КТ мозгового кавернозные мальформации в мышиной модели

Published: September 4, 2017 doi: 10.3791/56476
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2,3
1Lab of Cardiovascular Signaling, Centenary Institute, 2Faculty of Medicine, Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Australian Centre for Microscopy & Microanalysis, University of Sydney

Summary

Этот протокол демонстрирует индукции мозгового кавернозных мальформация болезни в мышиной модели и контраст использует расширение Микро Компьютерная томография для измерения поражения бремя. Этот метод увеличивает значение установленных мыши модели для изучения молекулярные основы и потенциальных терапий для церебральной кавернозных мальформация и другие цереброваскулярные заболевания.

Abstract

Мутации в CCM1 (ака KRIT1), CCM2, или CCM3 (ака PDCD10) гена вызывает церебральный кавернозных мальформация (СКК) в организме человека. Модели мыши CCM болезни были созданы тамоксифен индуцированной удаления Ccm генов в послеродовой животных. Эти модели мыши обеспечивают неоценимое расследовать молекулярный механизм и терапевтические подходы для СКК болезни. Точная и количественный метод оценки поражения бремя и прогрессии необходимо использовать полную стоимость этих животных моделей. Здесь мы демонстрируем индукции CCM болезни в мышиной модели и расширить использование контраст рентгеновского Микро Компьютерная томография (микро CT) метод измерения CCM поражения бремени в мозг мыши. На послеродовом день 1 (P1) мы использовали 4-hydroxytamoxifen (4HT) для активации Cre рекомбиназа деятельности от Cdh5-CreErt2 трансген к расщеплять аллеля floxed Ccm2. CCM поражений в мозг мыши были проанализированы на P8. Для микро CT раствор Люголя на основе йода была использована для повышения контраста в ткани мозга. Мы имеем оптимизированы параметры сканирования и использовали voxel измерение 9,5 мкм, которая приведет к минимальным размером около 25 мкм. Эта резолюция является достаточно измерить объем поражения СКК и номер глобально и точно, и обеспечить высокое качество 3-D картирование CCM поражений мозга мыши. Этот метод увеличивает значение установленных мыши модели для изучения потенциальных терапий и молекулярные основы для СКК и другие цереброваскулярные заболевания.

Introduction

CCM тонкими стенками, расширены сосудистые мальформации в мозге с преобладанием до 0,5% в человеческой популяции1. СКК может наследоваться как доминирующей расстройство из-за потери функции мутации в одном из трех генов: CCM1 (ака Krit1), CCM2и CCM3 (также называемый PDCD10)2,3,4 ,5,6. Эти гены присутствуют в одном сигнализации комплекс.

Были разработаны различные модели модель болезней человека СКК и понять течению тропы CCM гены, которые отвечают за CCM7,8,9,10. Самые надежные модели является условно удалять любой из генов СКК с тамоксифен индуцибельной Cdh5-CreERT2 в точке P1 в новорожденных детенышей8,10. Эти щенки развиться поражения СКК в мозг от P6 вперед и, как ожидается, будет идеальная модель для доклинических исследований в поиске механизмов и терапевтических агентов в лечении заболеваний СКК.

CCM поражения бремя в мозг мыши измеряется прежде всего методы, основанные на гистологию, подход, который чрезвычайно много времени и при условии следователь смещения10,,1112. МРТ основе методы были использованы для оценки СКК поражения бремя взрослых мыши модель9,13. Однако высоко специализированных малых животных МРТ инструмента и долгое время проверки нескольких часов в ночь требуется для достижения удовлетворительного решения для выявления поражений СКК. Кроме того не было сообщено ли МРТ может использоваться для обнаружения CCM поражений у новорожденных мышей и резолюции может ограничить чувствительность.

Мы недавно разработали технику микро CT изображения и анализировать CCM поражения14,15. Это с высоким разрешением, время и экономически эффективным методом резко повысило значение модели болезни СКК в механистический и терапевтических исследований. Повышение контрастности, вся гора пятная методы были использованы для микро-КТ мягких тканей и мыши эмбрионов16,17. Ранее мы использовали на основе осмий окрашивания для повышения контраста для микро-КТ CCM поражения мозга14. В этой статье мы использовали менее токсичны, неразрушающего, и экономически эффективных реагентов, йода на основе раствор Люголя в, чтобы увеличить контраст для микро-КТ. Йод может распространять по всему мозгу и имеет высокое сродство для крови18.

Здесь представлены подробный протокол индукции CCM поражений в неонатальной мыши модели наряду с изображений и анализа CCM поражений с контраст основе микро CT. Этот метод на основе микро КТ обеспечивает количественных глобальное измерение объема поражения СКК, точно определяет количество и расположение 3-D CCM поражений головного мозга мыши и значительно снижает стоимость и время, необходимое для фенотип этих животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

всех животных этики и протоколы были одобрены Сидней местного здравоохранения животных благосостояния райисполкома и институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Тяньцзинь медицинского университета. Все эксперименты проводились в соответствии с положениями руководящих принципов, столетний юбилей института, Университет Сиднея и Tianjin медицинский университет

1. Индукции мозгового кавернозные мальформации в моделях мыши

  1. крест Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl мышей с Ccm2 fl/fl для создания помета с Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) детенышей и помёте контроля (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 и Ccm2 fl/fl животных были ранее описанных 19.
  2. Распустить 4HT в 100% этанола и хранить при температуре-80 ° C в аликвоты 30 мкл (концентрация 4HT: 10 мг/мл). В день использования, разбавить aliquoted 4HT в кукурузном масле (0.5 мг/мл).
  3. Intragastrically инъекционные 50 мкл 4HT (0.5 мг/мл) для новорожденных щенков на P1 чтобы побудить экспериментальных поражениях CCM, с помощью шприца инсулина.

2. Пробоподготовка для микро-КТ

  1. усыпить новорожденных щенков через удушение двуокиси углерода на P8.
  2. Выполнять внутри сердца перфузии, вставив 29 иглы с 3 мл 2% параформальдегида в PBS в шприц 10 мл в желудочке сердца мыши.
    Предупреждение: Параформальдегида токсичен; Носите соответствующую защиту.
  3. Отсоедините головы от тела с помощью ножниц. Удалите все кожу с головы, с помощью ножниц и шелушиться черепа с помощью щипцов для рассечения весь мозг.
  4. Принимать изображения мозга с стереомикроскопом на 7,82 x увеличение, 1 x прибыль, 0.6 гамма и время воздействия 20 мс.
  5. Исправить расчлененных мозги с параформальдегида 4% в растворе PBS на ночь.
    Предупреждение: Параформальдегида токсичен; Носите соответствующую защиту.
  6. На следующий день, отсоединить hindbrains, с помощью щипцов и промыть раствором PBS.
  7. Hindbrains в Люголя инкубировать ' s раствор йода для 48 ч.
  8. Кратко после инкубации, воздух сухой hindbrains для удаления избыточных Люголя ' раствор йода ф.
  9. Пакет Люголя ' s йода окрашенных hindbrains 0,65 мл microcentrifuge труб и уплотнения полностью с пластиковых парафин фильм, чтобы избежать усадки ткани ( рис A).
  10. Место microcentrifuge трубы в 5 мл пластиковых трубок с губки для предотвращения их перемещения во время сканирования ( рис. 2 B).

3. Микро-КТ сканирования СКК в мозг мыши

  1. вертикально Установите задний мозг, Упакованные в трубку на алюминиевый держатель в системе микро CT.
  2. Задать параметры проверки 540 прогнозы и 2 s Выдержка с исходных условий 50 кв и 10 Вт приобрести томографических наборов данных (изображения резолюции 9.5 мкм/пиксел).
  3. Рентгенограммах от сканирования восстанавливаются автоматически аппаратные проекции восстановления программного обеспечения, предоставляемые системой микро CT, производит изображения серии из 16-разрядных осевых срезах (" TXM " файл).

4. Анализ наборов данных микро-CT

  1. Открыть файл восстановленные изображения (" TXM " файла) в 3-D анализ программного обеспечения и визуализировать с помощью мозга " объемный рендеринг " функция.
  2. Преобразование задний мозг в желаемой ориентации с помощью " ограничивающего " и " плоскости отсечения " функций.
  3. Resample преобразованные изображения в расширенном режиме и сохранить размер вокселей.
  4. Создание " редактировать новое поле Метка " на преобразованном изображении (4.3) и выделить только задний мозг, используя оттенки серого интенсивности.
  5. Добавления выделенных областей и запустить " ярлык анализ " чтобы получить измерения весь задний мозг (т.е., общий объем и площадь). Экспорт измерений в Excel файле.
  6. Визуализировать с помощью задний мозг " изоповерхности рендеринга " функция.
  7. Создать другую " поле новый ярлык " на преобразованные изображения и выделить районы с поражениями, используя оттенки серого интенсивности.
  8. Добавления выделенных областей и запустить " лейбл " анализ для получения измерения поражения внутри задний мозг (т.е., общий объем и площадь). Экспорт измерений в Excel файле.
  9. Визуализировать поражения с помощью " создавать поверхности " и " поверхности вид " функций.
  10. Снимок изображения задний мозг на желаемой ориентации или создать фильм для 3-D визуализации поражений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Одной инъекции 4HT в P1 было достаточно, чтобы побудить CCM поражения мозжечка. Люголя в йода контрастировали микро CT достаточно обнаружено CCM поражения и может определить ее объем и число. Использование оптимизированного микро CT, мы imaged CCM поражений в hindbrains Ccm2iECKO мышей. Сканированные рентгеновских изображений были реконструированы для создания трехмерных изображений мозга мыши, что позволило визуализации всего поражений в паренхиме мозга на разных глубинах и ориентации и оценку структуры и 3-D расположение поражений головного мозга. Важно отметить, что этот образ dataset также может использоваться для эффективного и точного количественного определения размеров поражения и поражения чисел.

Рисунок 1 показывает успешный индукции CCM поражения мозжечка Ccm2iECKO (B), но не в помёте контроля (Ccm2fl/fl) (A) на P8.

На рисунке 2 показан образец Упакованные для микро-КТ (BA–), и представитель реконструкции изображения от микро-КТ управления (Ccm2fl/fl) (C) и Ccm2 iECKO (ED–). Рисунок 2 E' показывает отмечены поражений в Ccm2iECKO.

Рисунок 3 показывает трехмерного рендеринга Ccm2iECKO мозга с поражениями (BA–). Прилегающих таблице показан пример количественного производства помечены индивидуального поражения.

Figure 1
Рисунок 1 : Индукция CCM поражений у новорожденных мышей. Макроскопические образы Ccm2fl/fl (A) и (B) Ccm2iECKO мозги на 8 день послеродового. Масштаб баров (белый), 5 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Пробоподготовки и реконструирован 2D изображения. Образец упакован в пробки microcentrifuge (A) и 5 мл трубки (B). Зеленая стрелка показывает пример. Представитель образы Ccm2fl/fl (C) и мозги Ccm2iECKO (ED–). (E') Отмеченные поражений в Ccm2iECKO мозга. Масштаб баров (белый), 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Визуализации трехмерных изображений. Рендеринг изображения Ccm2iECKO мозга с поражения (A) и поражения только (B). Поражения отмечены красным цветом. В таблице справа показывает пример качественного вывода отдельно помеченные поражений. Масштаб баров (белый), 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

СКК является общей сосудистая мальформация, которое затрагивает до 0,5% лиц1. СКК может происходить в форме спорадические или семейная. Пациента прогноз часто неясно, как СКК поражений может неожиданно разрыву вызвать инсульт и другие неврологические последствия. В настоящее время единственным вариантом является хирургическое удаление поражений, которые сопровождаются высоким риском.

CCM условия недавно были воспроизведены в животных моделей,78,9,10. Эти модели обеспечивают неоценимое значение для изучения механизмов, участвующих в СКК болезни. Точный, эффективный и количественного анализа метод поможет освоить полную стоимость этих моделей.

Мы недавно разработали метод микро CT изображения CCM поражений в моделях мыши, с помощью tetraoxide осмий как контрастные агент14. В текущем исследовании мы впоследствии использовали в Люголя раствор йода для повышения контраста ткани мозга для выявления поражений. Йода раствор Люголя в менее токсичные, неразрушающего и дешевле по сравнению с tetraoxide осмий. Следовательно образцы могут быть использованы для других целей, например гистологии после смыл раствор Люголя в йода.

Наш метод микро CT может производить достаточно качество изображения для обнаружения CCM поражений головного мозга мыши. Подготовка образца прост и не требует узкоспециализированных методов. Этот метод может обеспечить высоким разрешением прогнозы с время сканирования примерно один час. Объединение наборов данных из микро-КТ и 3-D программное обеспечение является мощным средством для создания 3-D глобальное представление CCM поражений в мозге. Количественные и качественные представление поражения по отношению к анатомии мозга легко достигнута. По сравнению с гистология основе трехмерной реконструкции, наш метод весьма время - и экономичным и производит гораздо более точные объемного представления.

Однако есть также ограничения и критические шаги для рассмотрения. Во-первых этот метод требует микро CT системы, которая является весьма специализированным оборудованием и не могут быть легко доступны. Во-вторых рассекает мозга новорожденных мыши может быть довольно сложной задачей из-за мягкости и размер ткани мозга. Это очень важно, чтобы не повредить мозг во время вскрытия для того чтобы получить точные измерения и визуализации СКК поражений головного мозга. И наконец Пробоподготовка для микро-КТ имеет решающее значение. Раствор Люголя окрашенных мозги должны быть упакованы полностью, чтобы избежать усадки ткани за счет испарения. Кроме того образцы должны быть надежно помещены в микро-КТ. Любое движение во время сканирования изменит качество сканирования и поэтому количественная оценка и визуализации.

Мы применили метод только в фиксированных новорожденных мыши мозги. Однако этот метод имеет способность быть использованы для других исследований с участием различных образцов и может служить инструментом захватывающее и Роман для других сосудистая мальформация исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы признают, зал и научной и технической помощи Sydney микроскопия и микроанализ исследовательский фонд (AMMRF) и Австралийский центр по микроскопия и микроанализ АКММ в Университете Сиднея. Эти исследования были поддержаны австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) проект Грант 161558 и APP1124011 (XZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxy tamoxifen Sigma-Aldrich H6278 To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope Leica M205FA To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution Sigma-Aldrich L6146 To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film Parafilm PM992 To package samples
Micro-CT Xradia MicroXCT-400 Micro-CT
3D rendering software FEI Visualization Science group Avizo 3D image processing software To analyse micro-CT scans

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
  2. Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
  3. Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
  4. Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
  5. Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
  6. Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
  7. McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
  8. Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
  9. Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
  10. Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
  11. McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
  12. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  13. Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
  14. Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
  15. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
  18. Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
  19. Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).

Tags

Медицина выпуск 127 Микро Компьютерная томография церебральный кавернозных мальформация модель мыши сосудистая мальформация ген CCM1 Krit1gene
Индукция и микро-КТ мозгового кавернозные мальформации в мышиной модели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, J. P., Yang, X., Foley, M.,… More

Choi, J. P., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model. J. Vis. Exp. (127), e56476, doi:10.3791/56476 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter