Summary
Este protocolo demuestra la inducción de la enfermedad de malformación cavernosa cerebral en un modelo de ratón y utiliza contraste realzado micro tomografía para medir la carga de lesión. Este método aumenta el valor de modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para la malformación cavernosa cerebral y otras enfermedades cerebrovasculares.
Abstract
Las mutaciones en el CCM1 (aka KRIT1), CCM2, o CCM3 (aka PDCD10) gene causar malformación cavernosa cerebral (CCM) en seres humanos. Se han establecido modelos de ratón de la enfermedad CCM por tamoxifeno inducido supresión de genes de Ccm en animales postnatales. Estos modelos de ratón proporcionan herramientas muy valiosas para investigar el mecanismo molecular y aproximaciones terapéuticas para la enfermedad CCM. Un método preciso y cuantitativo para evaluar la progresión y la carga de lesión es fundamental para aprovechar todo el valor de estos modelos animales. Aquí, demostramos la inducción de la enfermedad en un modelo murino de CCM y el uso del contraste mejorado método de (micro-CT) micro tomografía de rayos x a medida CCM lesión carga en cerebros de ratón. En el día postnatal 1 (P1), utilizamos 4-hydroxytamoxifen (4HT) para activar la actividad recombinase de Cre de transgén Cdh5 CreErt2 hender el alelo floxed del Ccm2. Se analizaron las lesiones CCM en cerebros de ratón en P8. Para micro-CT, solución de Lugol yodo basado fue utilizado para mejorar el contraste en el tejido cerebral. Hemos optimizado los parámetros de exploración y utiliza una dimensión del voxel de 9,5 μm, que conducen a un tamaño mínimo de la función de aproximadamente 25 μm. Esta resolución es suficiente para medir el número y volumen de la lesión CCM a nivel global y precisa y proporcionar cartografía 3D de alta calidad de lesiones CCM en cerebros de ratón. Este método aumenta el valor de los modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para CCM y otras enfermedades cerebrovasculares.
Introduction
CCM son de paredes delgadas, dilatados malformaciones vasculares en el cerebro con prevalencia de hasta el 0,5% en la población humana1. CCM puede ser heredado como un desorden dominante debido a las mutaciones de pérdida de función en uno de tres genes: CCM1 (aka Krit1), CCM2y CCM3 (también llamado PDCD10)2,3,4 ,5,6. Estos genes están presentes en un solo complejo de señalización.
Varios modelos se han desarrollado la enfermedad humana de CCM modelo y comprender las vías descendentes de los genes CCM que son responsables de CCM7,8,9,10. El modelo más robusto es condicional eliminar alguno de los genes MCP con tamoxifeno-inducible CreERT2 Cdh5 en P1 en cachorros recién nacidos8,10. Estos cachorros desarrollan lesiones CCM en el cerebro de P6 hacia adelante y se espera que sean un modelo ideal para los estudios preclínicos en búsqueda de mecanismos y agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades CCM.
CCM lesión en cerebro de ratón se ha medido principalmente por métodos basados en la histología, un enfoque que es extremadamente lento y sujeto a investigador diagonal10,11,12. Métodos de MRI basado se han utilizado para evaluar la carga de lesión CCM en el ratón adulto modelo9,13. Sin embargo, un especializado instrumento de MRI animal pequeño y largo tiempo de la exploración de varias horas hasta toda la noche es necesaria para lograr una resolución satisfactoria para identificar lesiones CCM. Además, si la MRI puede usarse para detectar lesiones CCM en ratones neonatales no se ha divulgado y resolución puede limitar la sensibilidad.
Recientemente hemos desarrollado una técnica de micro-CT para la imagen y analizar CCM lesión14,15. Esta alta resolución, tiempo y rentable método dramáticamente habían aumentado el valor del modelo de enfermedad CCM en estudios mecanísticos y terapéuticos. Métodos de tinción mejoran el contraste, todo Monte se han utilizado para micro-CT en la proyección de imagen de tejidos blandos y de embriones de ratón16,17. Previamente, hemos utilizado una tinción basada en osmio para mejorar contraste para micro-CT en la proyección de imagen de las lesiones CCM en el cerebro14. En este trabajo, usamos menos tóxico, no-destructiva, y reactivo eficiente, un yodo basado en solución de Lugol, para mejorar el contraste para la proyección de imagen micro-CT. Yodo puede difundir a través del cerebro y tiene una alta afinidad de sangre18.
El protocolo detallado se presenta aquí de la inducción de lesiones CCM en un modelo de ratón neonatal junto con la proyección de imagen y análisis de las lesiones CCM con un contraste basado en micro-CT. Este método basado en micro-CT proporciona medición cuantitativa global del volumen de lesión CCM, identifica con precisión el número y la localización 3D de CCM lesiones en el cerebro de ratón y reduce el costo y tiempo requerido para el fenotipo de estos animales.
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Protocol
todos los animal ética y protocolos fueron aprobados por el Sydney Local salud distrito Animal Comité de bienestar institucional Animal atención y Comité uso (IACUC) de la Universidad de medicina de Tianjin. Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices/normas del Instituto Centenario, Universidad de Sydney y Universidad de medicina de Tianjin
1. Inducción de malformaciones cavernosas cerebrales en modelos de ratón
- Cruz Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl ratones con Ccm2 fl/fl generar camadas con Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) cachorros y littermate controles (Ccm2 fl/fl). CreErt2 Cdh5 y Ccm2 fl/fl animales han sido previamente descritos 19.
- Disolver 4HT en etanol al 100% y almacenar a-80 ° C en alícuotas de 30 μl (4HT concentración: 10 mg/mL). En el día de uso, diluir alícuotas 4HT en aceite de maíz (0.5 mg/mL).
- Intragástricamente inyectar 50 μl de 4HT (0.5 mg/mL) a cachorros neonatales en P1 para inducir lesiones CCM experimentales utilizando una jeringa de insulina.
2. Preparación de exploraciones del Micro-CT de la muestra
- eutanasia neonatales cachorros en P8 mediante asfixia dióxido de carbono.
- Realizar perfusión intra cardiaca mediante la inserción de una aguja de calibre 29 con 3 mL de paraformaldehído al 2% en PBS en una jeringa de 10 mL en el ventrículo del corazón de ratón.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada. - Separar la cabeza del cuerpo usando unas tijeras. Quitar toda la piel de la cabeza usando unas tijeras y retire el cráneo usando pinzas para diseccionar el cerebro entero.
- Tomar imágenes del cerebro con el estereomicroscopio en 7,82 x aumento, aumento de x 1, gamma 0,6 y tiempo de exposición de 20 ms.
- Fijar los cerebros disecados con paraformaldehído al 4% en solución de PBS durante la noche.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada. - Al día siguiente, separar usando un fórceps de hindbrains y lavarse con solución de PBS.
- Incubar hindbrains en Lugol ' solución de yodo de s para 48 h.
- Después de la incubación, brevemente aire seco hindbrains para quitar exceso Lugol ' solución de yodo s.
- Paquete el Lugol ' yodo s manchado hindbrains en tubos de microcentrífuga de 0,65 mL y sello totalmente con película de plástico de parafina para evitar la contracción del tejido ( figura 2 A).
- Colocar tubos de microcentrífuga en tubos de plástico de 5 mL con esponjas para evitar movimientos durante la exploración ( figura 2 B).
3. Micro-CT Scan de CCM en el cerebro de ratón
- montar verticalmente el cerebelo que se embalará en un tubo sobre un soporte de aluminio en el sistema de micro-CT.
- Configurar los parámetros de exploración 540 proyecciones y tiempo de exposición de s 2 condiciones fuente de 50 kV y 10 W para adquirir los conjuntos de datos tomográficos (imagen resolución 9,5 μm/píxeles).
- Las radiografías de la exploración se reconstruyen automáticamente por el software de reconstrucción de proyección basados en hardware suministrado por el sistema de micro-CT, produciendo una serie de imágenes de cortes axiales de 16-bit (" TXM " archivo).
4. Análisis de conjuntos de datos de Micro-CT
- abrir el archivo de imagen reconstruida (" TXM " archivo) en el software de análisis 3D y visualizar el cerebro usando la " volumétrica " función.
- Transformar el cerebelo a la orientación deseada usando el " rectángulo de " y " plano de recorte " funciones.
- Volver a muestrear la imagen transformada en modo extendido y preservar el tamaño de voxel.
- Crear " editar nueva etiqueta campo " en la imagen transformada (4.3) y resaltar solo el cerebelo con intensidad en escala de grises.
- Agregar las zonas resaltadas y ejecutar " Análisis de la etiqueta " para obtener mediciones del cerebelo todo (es decir, volumen total y área). Exportación medidas en un archivo de Excel.
- Visualizar el cerebelo usando la " representación de isosuperficies " función.
- Crear otro " editar nueva etiqueta campo " en las transformada imagen y resaltar las áreas con lesiones usando la intensidad en escala de grises.
- Agregar las zonas resaltadas y ejecutar " etiqueta " análisis para obtener mediciones de las lesiones en el cerebelo (es decir, volumen total y área). Exportación medidas en un archivo de Excel.
- Visualizar las lesiones utilizando el " generar superficie " y " de la superficie vista " funciones.
- Instantánea de las imágenes del cerebelo en orientaciones deseadas o generar una película para la visualización 3D de las lesiones.
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Representative Results
Una sola inyección de 4HT en P1 fue suficiente para inducir lesiones en el cerebelo de CCM. Micro-CT en contraste de yodo de Lugol suficientemente detectó lesiones CCM y podría cuantificar su número y volumen. Utilizando el micro-CT en optimizado, imágenes de lesiones CCM en el hindbrains de ratones Ccm2iECKO . Se reconstruyeron imágenes escaneadas de rayos x para producir imágenes 3D de cerebro de ratón, que permitió la visualización de todas lesiones en el parénquima cerebral en diferentes profundidades y orientaciones y evaluación de la estructura y la localización 3D de lesiones en el cerebro. Importante, este conjunto de datos de imagen también puede utilizarse para la cuantificación eficiente y precisa de lesión tamaños y números de la lesión.
La figura 1 muestra exitosa inducción de lesiones CCM en el cerebelo de Ccm2iECKO (B) pero no en controles littermate (Ccm2fl/fl) (A) en el P8.
Figura 2 muestra un ejemplo lleno de micro-CT scan (A–B), y representante de reconstruir imágenes de la micro tomografía de control (Ccm2fl/fl) (C) y Ccm2 iECKO D–E. Figura 2 E' muestra marcadas lesiones en Ccm2iECKO.
La figura 3 muestra una imagen 3D de un cerebro Ccm2iECKO con lesiones (A–B). Cuadro adyacente muestra un ejemplo de salida cuantitativa de las lesiones individuales etiquetadas.
Figura 1 : Inducción de lesiones CCM en ratón neonatal. Imágenes macroscópicas del Ccm2fl/fl (A) y cerebros Ccm2iECKO (B) en el día postnatal 8. Escala de barras (blanco), 5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Preparación de muestras y reconstruir imágenes 2D. Muestra había embalado en un tubo de microcentrífuga (A) y 5 mL tubos (B). Flecha verde muestra el ejemplo. Imágenes representativas del Ccm2fl/fl (C) y Ccm2iECKO (D–E) cerebro. (E') Lesiones marcadas en Ccm2iECKO cerebro. Escala de barras (blanco), 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Procesa imágenes 3-d. Prestados imagen del Ccm2iECKO cerebro con lesiones (A) y las lesiones sólo (B). Las lesiones están marcadas en rojo. Tabla de la derecha muestra un ejemplo de producción cualitativa de las lesiones individualmente marcadas. Escala de barras (blanco), 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
CCM es una malformación vascular común que afecta hasta el 0,5% de los individuos1. CCM puede ocurrir en forma esporádica o familiar. Pronóstico paciente desconoce a menudo como lesiones CCM pueden romperse inesperadamente para causar derrame cerebral y otras consecuencias neurológicas. Actualmente, la opción único tratamiento es extirpar quirúrgicamente las lesiones, que van acompañadas de alto riesgo.
Las condiciones humanas de CCM han sido reproducidas recientemente en modelos de animales7,8,9,10. Estos modelos proporcionan herramientas muy valiosas para investigar mecanismos implicados en la enfermedad de CCM. Un método de análisis cuantitativo, eficiente y precisa le ayudará a aprovechar todo el valor de estos modelos.
Recientemente hemos desarrollado un método de micro-CT a las lesiones CCM de imagen en modelos de ratón con tetraóxido de osmio como agente contraste14. En el presente estudio, hemos utilizado posteriormente de Lugol para realzar el contraste de tejido cerebral para detectar lesiones. Solución de yodo de Lugol es menos tóxico, no-destructivo y más barato en comparación con tetraóxido de osmio. Por lo tanto, las muestras pueden ser reutilizadas para otros fines, como la histología después de Lugol se lava lejos.
Nuestro método de micro-CT podría producir suficiente calidad de imagen para detectar lesiones CCM en el cerebro de ratón. La preparación de la muestra es sencilla y no requiere de técnicas altamente especializadas. Este método puede proporcionar proyecciones de alta resolución con un tiempo de exploración de aproximadamente una hora. Combinar conjuntos de datos de micro-TC y software de análisis 3-d es una manera poderosa para generar una visión global de 3-d de lesiones CCM en cerebro. Fácilmente se logra la representación cuantitativa y cualitativa de las lesiones en relación con la anatomía del cerebro. En comparación con reconstrucción 3-d basada en la histología, nuestro método es muy tiempo - y costo - efectiva y produce representaciones 3D mucho más precisas.
Sin embargo, existen también limitaciones y pasos críticos a tener en cuenta. En primer lugar, el método requiere un sistema de micro-CT, que es el equipo especializado y puede no estar fácilmente disponible. En segundo lugar, disección del cerebro de ratón neonatal puede ser absolutamente difícil debido a la suavidad y el tamaño del tejido cerebral. Es muy importante no dañar el cerebro durante la disección con el fin de obtener mediciones precisas y la visualización de las lesiones CCM en el cerebro. Por último, preparación de muestras para análisis de micro-CT es fundamental. Yodo de Lugol manchado cerebros debe ser llenado completamente para evitar la contracción del tejido debido a la evaporación. También, las muestras se colocarán firmemente durante la exploración micro-CT. Cualquier movimiento durante la exploración modificará la calidad de la exploración y por lo tanto, la cuantificación y visualización.
Hemos aplicado nuestro método sólo en cerebros de ratón neonatal fijo. Sin embargo, este método tiene la capacidad de ser utilizado para otros estudios con diferentes muestras y puede servir como una herramienta interesante y novedosa para otras investigaciones de malformación vascular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen las instalaciones y la asistencia científica y técnica de la microscopía de Sydney y centro de investigación de microanálisis (AMMRF) y el centro australiano de microscopía y microanálisis (ACMM) en la Universidad de Sydney. Estos estudios fueron apoyados por nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (NHMRC) proyecto beca 161558 y APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
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