Summary
Detta protokoll visar induktion av cerebral cavernous missbildningar sjukdom i en musmodell och använder kontrastmedelsförstärkt micro datortomografi för att mäta lesion börda. Metoden förbättrar värdet av etablerade musmodeller att studera den molekylära basen och potentiella behandlingar för cerebral cavernous missbildningar och andra cerebrovaskulära sjukdomar.
Abstract
Mutationer i den CCM1 (aka KRIT1), CCM2, eller CCM3 (aka PDCD10) gen orsaka cerebral ihålig missbildning (CCM) hos människor. Mus-modeller av CCM sjukdom har fastställts av tamoxifen inducerad radering av Ccm gener i postnatal djur. Dessa musmodeller ger ovärderliga verktyg för att undersöka molekylära mekanismer och terapeutiska metoder för CCM sjukdom. En korrekt och kvantitativ metod för att bedöma lesion börda och progression är viktigt att utnyttja det fulla värdet av dessa djurmodeller. Här, vi demonstrera induktion av CCM sjukdom i en musmodell och användningen av kontrasten förbättrad röntgen micro datortomografi (mikro-CT) metod för att mäta CCM lesion börda i mus hjärnor. Vid postnatal dag 1 (P1) använde vi 4-hydroxytamoxifen (4HT) för att aktivera Cre recombinase aktivitet från den Cdh5-CreErt2 transgenens klyva den floxed allelen av Ccm2. CCM lesioner i mus hjärnor analyserades på P8. För mikro-CT användes jod baserade Lugols lösning för att förbättra kontrast i hjärnvävnad. Vi har optimerat parametrarna av och utnyttjade en voxel dimension av 9,5 µm, som leder till en minsta storleken cirka 25 µm. Denna resolution är tillräcklig för att mäta CCM lesion volym och antal globalt och exakt och ger hög kvalitet 3D-kartläggning av CCM lesioner i mus hjärnor. Metoden förbättrar värdet av de etablerade musmodeller att studera den molekylära basen och potentiella behandlingar för CCM och andra cerebrovaskulära sjukdomar.
Introduction
CCM är tunna väggar, vidgade vaskulära missbildningar i hjärnan med förekomst av upp till 0,5% i den mänskliga befolkning1. CCM kan ärvas som en dominerande störning på grund av förlust-av-funktion mutationer i någon av tre gener: CCM1 (aka Krit1), CCM2och CCM3 (även kallad PDCD10)2,3,4 ,5,6. Dessa gener är närvarande i en enda signalering komplexa.
Olika modeller har utvecklats att modellen mänskliga CCM sjukdom och att förstå de nedströms vägarna i CCM gener som ansvarar för CCM7,8,9,10. Den mest robusta modellen är villkorligt bort någon av generna som Ccm med tamoxifen-inducerbara Cdh5-CreERT2 på P1 i nyfödda valpar8,10. Dessa ungar utveckla CCM lesioner i hjärnan från P6 framåt och förväntas vara en idealmodell för prekliniska studier i sökandet efter mekanismer och terapeutiska medel vid behandling av CCM sjukdomar.
CCM lesion börda i mus hjärna har mätts främst av histologi-baserade metoder, en strategi som är extremt tidskrävande och omfattas av prövaren bias10,11,12. MRI baserade metoder har använts för att bedöma CCM lesion bördan i vuxen mus modell9,13. Dock krävs ett högspecialiserade små djur MRI instrument och scan-länge flera timmar till över natten att uppnå en tillfredsställande lösning att identifiera CCM lesioner. Även om MRI kan användas för att upptäcka CCM lesioner hos neonatala möss har inte rapporterats och upplösning kan begränsa känslighet.
Vi har nyligen utvecklat en mikro-CT teknik för att bild och analysera CCM lesion14,15. Denna högupplösta, tids- och kostnadseffektiv metod du dramatiskt ökat värdet av CCM sjukdom modell i mekanistiska och terapeutiska studier. Kontrast-öka, hela mount färgning metoder har använts för mikro-CT-avbildning av mjuka vävnader och mus embryon16,17. Vi har tidigare använt en osmium-baserade färgning för att förbättra kontrast för mikro-CT-avbildning av CCM lesioner i hjärnan14. I detta papper, vi använde en mindre giftig, icke-förstörande, och kostnadseffektiva reagens, en jod baserade Lugols lösning, för att förbättra kontrast för mikro-CT bilddiagnostik. Jod kan sprida i hela hjärnan och har en hög affinitet för blod18.
Det detaljerade protokollet presenteras här för induktion av CCM lesioner i en neonatal musmodell tillsammans med bildtagning och analys av CCM lesioner med en kontrast-baserade micro-CT. Denna mikro-CT metod ger kvantitativ global mätning av CCM lesion volym, korrekt identifierar antalet och 3D-läge av CCM lesioner i hjärnan mus och kraftigt reducerar kostnaden och tid som krävs att fenotyp dessa djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla djuretik och protokoll godkändes av The Sydney lokala hälsa djur välfärd distriktskommittén och institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) Tianjin Medical University. Alla experiment utfördes enligt de riktlinjer och förordningarna av hundraårsminnet Institute, University of Sydney och Tianjin Medical University
1. Induktion av Cerebral Cavernous missbildningar i musmodeller
- passera Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl möss med Ccm2 fl/fl att generera kullar med Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) valpar och littermate kontroller (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 och Ccm2 fl/fl djur varit tidigare beskrivna 19.
- Lös 4HT i 100% etanol och förvaras vid-80 ° C i alikvoter av 30 µL (4HT koncentration: 10 mg/mL). På dagen för användning, späd aliquoted 4HT i majsolja (0,5 mg/mL).
- Intragastrically injicera 50 µL 4HT (0,5 mg/mL) till neonatala valpar på P1 att framkalla experimentella CCM lesioner med en insulinspruta.
2. Provberedning för Micro-CT File
- Euthanize neonatala valpar på P8 via koldioxid kvävning.
- Utför inom hjärt perfusion genom att infoga en 29-gauge nål med 3 mL 2% PARAFORMALDEHYD i PBS i en 10 mL spruta i ventrikeln mus hjärtats.
Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga; bär lämpligt skydd. - Loss huvudet från kroppen med hjälp av en sax. Ta bort alla huden av huvudet med en sax och skala bort skallen med pincett för att dissekera hela hjärnan.
- Ta bilder av hjärnan med stereomikroskop med 7,82 x förstoring, 1 x vinst, 0.6 gamma och 20 ms exponeringstid.
- Fixa dissekerade hjärnor med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS lösning över natten.
Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga; bär lämpligt skydd. - Den följande dagen, lossa hindbrains med en pincett och tvätta med PBS lösning.
- Inkubera i hindbrains i Lugols ' s jodlösning för 48 h.
- Efter inkubering, kort luft torka hindbrains att ta bort överflödig Lugols ' s jodlösning.
- Packa Lugols ' s jod färgade hindbrains i 0,65 mL mikrocentrifugrör och tätningen helt med plast paraffin film att undvika vävnad krympning ( figur 2 A).
- Placera mikrocentrifugrör i 5 mL plaströr med svampar att hindra dem från att flytta under genomsökning ( figur 2 B).
3. Micro-CT Scan av CCM i mus hjärnan
- vertikalt montera hindbrain förpackade i ett rör på en aluminium hållare i mikro-CT systemet.
- Ange parametrarna skanning till 540 prognoser och 2 s exponeringstid med källa villkor för 50 kV och 10 W för att förvärva den tomografiska datamängder (bild upplösning 9,5 μm/pixel).
- Röntgenbilder från scan rekonstrueras automatiskt av maskinvarubaserad projektion återuppbyggnad programvara som levereras av mikro-CT systemet, producerar en bild serie 16-bitars axiella skivor (" TXM " fil).
4. Analys av mikro-CT datamängder
- Öppna filen rekonstruerad bild (" TXM " fil) i 3D-analys programvara och visualisera den hjärnan med den " volym rendering " funktion.
- Omvandla bakhjärnan till önskad orientering med den " begränsningsram " och " klippningsplan " funktioner.
- Sampla om bearbetade bilden i utökat läge och bevara storleken voxel.
- Skapa " redigera nya etikettfältet " på den bearbetade bilden (4.3) och markera endast hindbrain använda gråskala intensitet.
- Lägg till de markerade områdena och kör " etikett analys " att få mätningar av hela hindbrain (dvs, total volym och areal). Exportera mätningar i en Excel-fil.
- Visualisera den hindbrain med den " isosurface rendering " funktion.
- Skapa en annan " redigera nya etikettfältet " på bearbetade bilden och markera områden med lesioner med gråskala intensitet.
- Lägg till de markerade områdena och kör " etikett " analys för att få mätningar av lesioner inom hindbrain (dvs, total volym och areal). Exportera mätningar i en Excel-fil.
- Visualisera de lesioner som använder den " generera ytan " och " yta Visa " funktioner.
- Ögonblicksbild bilder av bakhjärnan på önskad riktlinjer eller generera en film för 3D-visualisering av lesioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enda injektion av 4HT P1 var tillräcklig för att framkalla CCM lesioner i cerebellum. Lugols jod kontrasterade mikro-CT tillräckligt upptäckt CCM lesioner och kan kvantifiera dess volym och nummer. Utnyttja den optimerade mikro-CT, avbildade vi CCM lesioner i hindbrains Ccm2iECKO möss. Skannade röntgenbilder rekonstruerades för att producera 3D-bilder av hjärnans mus, som tillåtet visualisering av hela lesioner i hjärnparenkymet på olika djup och riktlinjer, och bedömning struktur och 3D-läge av lesioner i hjärnan. Viktigast av allt, kan denna bild dataset också användas för effektiv och korrekt kvantifiering av lesionens storlekar och lesion siffror.
Figur 1 visar framgångsrika induktion av CCM lesioner i cerebellum av Ccm2iECKO (B) men inte i littermate kontroller (Ccm2fl/fl), (A) på P8.
Figur 2 visar ett packade prov för mikro-datortomografi (A–B), och företrädare rekonstruerade bilder från mikro-CT scan av kontroll (Ccm2fl/fl), (C) och Ccm2 iECKO (D–E). Figur 2 E' visar markerade lesioner i Ccm2iECKO.
Figur 3 visar en renderade 3D-bild av en Ccm2iECKO hjärna med lesioner (A–B). Intilliggande tabell visar ett exempel på kvantitativa utdata av märkt enskilda lesioner.
Figur 1 : Induktion av CCM lesioner i neonatal mus. Makroskopiska bilder av Ccm2fl/fl (A) och Ccm2iECKO (B) hjärnor vid postnatal dag 8. Skala barer (vit), 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Provberedning och rekonstrueras 2D-bilder. Prov packade i en mikrocentrifug rör (A) och 5 mL rör (B). Grön pil visar provet. Representativa bilder av Ccm2fl/fl (C) och Ccm2iECKO (D–E) hjärnor. (E') Markerade lesioner i Ccm2iECKO hjärna. Skala barer (vit), 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Renderade 3D-bilder. Renderade bilden av Ccm2iECKO hjärna med lesioner (A) och lesioner bara (B). Lesioner är markerade i rött. Tabellen till höger visar ett exempel på kvalitativa utdata av individuellt märkta lesioner. Skala barer (vit), 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CCM är en gemensam vaskulära missbildningar som drabbar upp till 0,5% av individer1. CCM kan uppstå i sporadiska eller familjär form. Patientens prognos är ofta oklart eftersom CCM lesioner kan brista oväntat för att orsaka stroke och andra neurologiska konsekvenserna. För närvarande är det enda behandlingsalternativ att kirurgiskt avlägsna lesioner, som åtföljs av hög risk.
Mänskliga CCM villkor har nyligen reproducerats i djur modeller7,8,9,10. Dessa modeller ger ovärderliga verktyg för att undersöka mekanismer som i CCM sjukdom. En korrekt, effektiv och kvantitativ analysmetod hjälper till att utnyttja det fulla värdet av dessa modeller.
Nyligen har vi utvecklat en metod för mikro-CT att bilden CCM lesioner i musmodeller med osmium tetraoxide som en kontrasterande agent14. I den aktuella studien har vi därefter använt Lugols jodlösning för att öka kontrasten av hjärnvävnaden att upptäcka lesioner. Lugols jodlösning är mindre giftig, icke-förstörande och billigare jämfört med osmium tetraoxide. Proverna kan därför återanvändas för andra ändamål, såsom histologi efter Lugols jodlösning tvättas bort.
Vår micro-CT metod kunde producera tillräcklig bildkvalitet för att upptäcka CCM lesioner i mus hjärnan. Provberedningen är enkelt och kräver inte mycket specialiserade tekniker. Denna metod kan ge högupplösta prognoser med en bildläsningstid av cirka en timme. Att kombinera datamängder från mikro-CT-scanning och 3D-analysprogramvara är ett kraftfullt sätt att generera en 3D-globala vy av CCM lesioner i hjärnan. Kvantitativa och kvalitativa framställningen av lesioner i förhållande till hjärnans anatomi uppnås enkelt. Jämfört histologi-baserade 3D-rekonstruktion, vår metod är mycket tid - och kostnads - effective och producerar mycket mer exakt 3-D representationer.
Men finns det också begränsningar och kritiska steg som skall beaktas. För det första kräver metoden ett mikro-CT-system, vilket är högt specialiserad utrustning och kan inte vara lätt tillgängliga. För det andra, dissekera neonatal mus hjärnan kan vara ganska krävande på grund av mjukhet och storleken på hjärnvävnaden. Det är mycket viktigt att inte skada hjärnan under dissektion för att erhålla noggranna mätningar och visualisering av CCM lesioner i hjärnan. Slutligen, provberedning för mikro-datortomografi är kritisk. Lugols jod färgade hjärnor måste packas helt för att undvika vävnad krympning på grund av avdunstning. Dessutom måste prover placeras säkert under den mikro-datortomografi. Någon rörelse under genomsökningen kommer att förändra kvaliteten på sökningen och därmed den kvantifiering och visualisering.
Vi har tillämpat vår metod endast i fasta neonatal mus hjärnor. Men denna metod har kapacitet att användas för andra studier på olika prover och kan tjäna som ett spännande och nya verktyg för andra vaskulära missbildningar forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner faciliteter samt vetenskaplig och teknisk hjälp av Sydney microscopyen & mikroanalys Research Facility (AMMRF) och australiska centrum för mikroskopi och mikroanalys (ACMM) vid University of Sydney. Dessa studier stöddes av Australian National Health och medicinsk forskning rådet (NHMRC) projektanslag 161558 och APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
