Summary
هذا البروتوكول يوضح التعريفي مرض دماغي تشوه الكهفي في نموذج ماوس وتعزيز استخدامات التباين الجزئي المقطعي لقياس عبء الآفة. ويعزز هذا الأسلوب قيمة نماذج الماوس المنشأة لدراسة الأساس الجزيئي والعلاجات المحتملة لتشوه الكهفي الدماغي وغيره من الأمراض المخية الوعائية.
Abstract
الطفرات في CCM1 (الملقب KRIT1)، CCM2، أو CCM3 (الملقب PDCD10) الجينات يسبب تشوه الكهفي الدماغي (الحزب الحاكم) في البشر. تم إنشاء نماذج الماوس CCM المرض قبل الحذف تاموكسيفين التي يسببها Ccm الجينات في الحيوانات بعد الولادة. توفر هذه النماذج الماوس أدوات لا تقدر بثمن للتحقيق في الآلية الجزيئية والنهج العلاجي للمرض CCM. أسلوب دقيق والكمي لتقييم عبء الآفة والتقدم ضروري للاستفادة من القيمة الكاملة لهذه النماذج الحيوانية. هنا نظهر التعريفي مرض CCM في نموذج ماوس وتعزيز استخدام التباين الأشعة السينية الجزئي المقطعي (الصغرى-CT) طريقة لقياس عبء الآفة CCM في أدمغة الفأر. في يوم الولادة 1 (P1)، استخدمنا 4-هيدروكسيتاموكسيفين (4HT) لتفعيل لجنة المساواة العرقية recombinase النشاط من التحوير Cdh5-CreErt2 تهزم اليل فلوكسيد من Ccm2. وجرى تحليل CCM الآفات في أدمغة الماوس في P8. الصغير-CT، استخدمت الحل اليود على أساس لوجول لتعزيز التباين في أنسجة المخ. لدينا الأمثل المعلمات المسح الضوئي واستخدمت بعدا فوكسل من 9.5 ميكرومتر، مما يؤدي إلى حجم ميزة الحد أدنى من حوالي 25 ميكرومتر. هذا القرار غير كاف لقياس حجم الآفة CCM وعدد عالمياً ودقة، وتوفير الخرائط ثلاثية الأبعاد عالية الجودة من آفات CCM في أدمغة الفأر. ويعزز هذا الأسلوب قيمة النماذج الماوس المنشأة لدراسة الأساس الجزيئي والعلاجات المحتملة لآلية التنسيق بالدولة وغيرها من الأمراض الدماغية الوعائية.
Introduction
CCM هي رقيقة الجدران، المتوسعة تشوهات الأوعية الدموية في الدماغ مع انتشار ليصل إلى 0.5 في المائة في عدد السكان1. يمكن توارث CCM كاضطراب مهيمن بسبب الطفرات الخسارة من الدالة في واحدة من ثلاثة جينات: CCM1 (الملقب Krit1) و CCM2و CCM3 (وتسمى أيضا PDCD10)2،3،4 ،،من56. هذه الجينات موجودة في واحد إشارات معقدة.
تم تطوير نماذج مختلفة لنموذج الإنسان CCM المرض وفهم مسارات المصب من الجينات CCM المسؤولة CCM7،،من89،10. يعتبر هذا النموذج أقوى لحذف أي من الجينات Ccm مع تاموكسيفين-إيندوسيبلي Cdh5-CreERT2 في P1 في الجراء حديثي الولادة8،10إفراجاً مشروطاً. هذه الجراء تطوير CCM الآفات في الدماغ من P6 فصاعدا، ومن المتوقع أن تكون نموذجا مثاليا للدراسات ما قبل السريرية في البحث عن آليات والعوامل العلاجية في علاج الأمراض CCM.
CCM عبء الآفة في الدماغ الماوس قد تقاس أساسا بأساليب قائمة على علم الأنسجة، نهج التي تستغرق وقتاً طويلاً جداً وتخضع للمحقق التحيز10،،من1112. وقد استخدمت أساليب التصوير بالرنين المغناطيسي على أساس تقييم عبء الآفة CCM في الماوس الكبار النموذجي9،13. ومع ذلك، مطلوب الصك الرنين المغناطيسي الحيوانية الصغيرة المتخصصة للغاية، والمسح الضوئي--منذ وقت طويل لعدة ساعات بين عشية وضحاها للتوصل إلى حل مرض لتحديد الآفات CCM. أيضا، لا قد ذكر ما إذا كان يمكن استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف عن الآفات CCM في الفئران حديثي الولادة والقرار قد يحد من الحساسية.
قمنا مؤخرا بتطوير تقنية الأشعة المقطعية الصغرى للصورة، وتحليل CCM الآفة14،15. هذا الاستبانة، طريقة فعالة من حيث التكلفة والوقت كبير عزز قيمة نموذج المرض CCM في الدراسات الميكانيكية والعلاجية. وقد استخدمت جبل تعزيز التباين، وكلها أساليب المصبوغة لتصوير مايكرو-CT الأنسجة الرخوة والماوس الأجنة16،17. سابقا، وقد استخدمنا المستندة إلى أوزميوم تلطيخ لتعزيز التباين لتصوير مايكرو-CT CCM الآفات في الدماغ14. في هذه الورقة، استخدمنا سمية أقل وغير مدمرة، وكاشف فعالة من حيث التكلفة، اليود على أساس الحل في لوجول، لتعزيز التباين للتصوير بالأشعة المقطعية الصغرى. يمكن منتشر في جميع أنحاء الدماغ اليود ولها صلة عالية للدم18.
البروتوكول مفصلاً يرد هنا الاستقراء آفات CCM في طراز ماوس الولدان جنبا إلى جنب مع التصوير وتحليل لآفات CCM مع قيراط الجزئي على أساس التباين هذا الأسلوب استناداً إلى الأشعة المقطعية الصغرى يوفر القياس العالمي الكمي لحجم الآفة CCM ويحدد بدقة عدد وموقع ثلاثي الأبعاد من آفات CCM في الدماغ الماوس ويقلل كثيرا من التكاليف والوقت اللازم للنمط الظاهري هذه الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أقر جميع الأخلاقيات الحيوان والبروتوكولات "سيدني اللجنة المحلية للصحة حي الحيوان الرعاية الاجتماعية" و "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة تيانجين الطبية. أجريت جميع التجارب ضمن المبادئ التوجيهية/النظام الأساسي للمعهد الذكرى المئوية وجامعة سيدني وجامعة تيانجين الطبية
1. التعريفي للتشوهات مجوف الدماغي في نماذج الماوس
- عبر
- Cdh5-CreErt2؛ Ccm2 fl/fl الفئران مع Ccm2 fl/فلوريدا لتوليد ليتر مع Cdh5-CreErt2؛ Ccm2 fl/fl الجراء (Ccm2 إييكو) وعناصر التحكم ليتيرماتي (Ccm2 fl/فلوريدا). الحيوانات Cdh5-CreErt2 و Ccm2 fl/فلوريدا تم وصفه سابقا 19-
- حل 4HT في الإيثانول 100% وتخزينها في-80 درجة مئوية في مختبرين من 30 ميليلتر (تركيز 4HT: 10 ملغ/مل). في يوم الاستخدام، تخفف من 4HT الكوتيد في زيت الذرة (0.5 ملغ/مل).
- إينتراجاستريكالي حقن 50 ميليلتر من 4HT (0.5 ملغ/مل) للمواليد الجراء في P1 للحث على آفات CCM تجريبية باستخدام حقنه الأنسولين.
2. نموذج إعداد الجزئي "المقطعي"
- Euthanize الجراء الولدان في P8 عن طريق الخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون-
- إجراء نضح داخل القلب بإدخال إبرة قياس 29 مع 3 مل بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني في حقنه 10 مل في البطين قلب الفأر.
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة. - فصل الرأس من نص باستخدام مقص. إزالة كل الجلد قبالة الرأس باستخدام مقص وتقشر الجمجمة باستخدام ملقط تشريح الدماغ كله.
- التقاط صور للدماغ مع ستيريوميكروسكوبي في 7.82 x 1 x مكسب وغاما 0.6، التكبير ووقت التعرض 20 مللي ثانية-
- إصلاح العقول تشريح مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني الحل بين عشية وضحاها.
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة. - اليوم التالي، فصل هيندبرينس استخدام ملقط ويغسل مع برنامج تلفزيوني الحل.
- احتضان هيندبرينس في لوجول ' الحل اليود s 48 h.
- بعد الحضانة، بإيجاز الهواء الجاف هيندبراينس لإزالة الزائدة لوجول ' الحل اليود s-
- حزمة لوجول ' اليود s الملون هيندبرينس في أنابيب ميكروسينتريفوجي مل 0.65 وختم تماما مع الفيلم البارافين البلاستيك لتفادي انكماش الأنسجة ( الشكل 2 ألف)-
- وضع أنابيب ميكروسينتريفوجي في أنابيب بلاستيكية 5 مل مع الأسفنج لمنعهم من الانتقال أثناء المسح الضوئي ( الشكل 2 ب)-
3. مسح CCM CT الدقيقة في "الدماغ الماوس"
- عمودياً جبل hindbrain معبأة في أنبوب على حائز ألومنيوم في النظام الجزئي-CT.
- تعيين المعلمات المسح إلى إسقاطات 540 ووقت التعرض s 2 مع شروط المصدر من 50 كيلوفولت و 10 ث للحصول على مجموعات بيانات تمجربهك (صورة القرار 9.5 ميكرومترات بيكسل).
- الصور الشعاعية من التفحص بنائها تلقائياً حسب الإسقاطات المستندة إلى الأجهزة برامج إعادة الإعمار تم توفيره بواسطة نظام الأشعة المقطعية الصغرى، المنتجة لصورة سلسلة من الشرائح المحوري 16-بت (" تكسم " الملف)-
4. تحليل مجموعات البيانات المقطعية الصغرى
- فتح ملف الصورة أعيد بناؤها (" تكسم " ملف) في برنامج تحليل ثلاثي الأبعاد وتصور استخدام الدماغ " حجم التقديم " الدالة.
- تحويل هيندبراين إلى الاتجاه المرغوب فيه باستخدام " المربع المحيط " و " الطائرة القطع " المهام.
- إعادة تشكيل الصورة المحولة في وضع الموسعة، والحفاظ على حجم فوكسل-
- إنشاء " تحرير حقل التسمية الجديدة " في الصورة المحولة (4.3)، وتسليط الضوء على هيندبراين استخدام كثافة اللون الرمادي فقط.
- إضافة المناطق المبرزة وتشغيل " تسمية التحليل " للحصول على قياسات hindbrain كله (أي إجمالي حجم ومجال). تصدير القياسات في ملف Excel-
- تصور باستخدام هيندبراين " التقديم إيسوسورفيس " الدالة.
- إنشاء آخر " تحرير حقل التسمية الجديدة " على مجالات الصورة وتسليط الضوء على تحول مع الآفات استخدام كثافة اللون الرمادي-
- إضافة المناطق المبرزة وتشغيل " تسمية " تحليل للحصول على قياسات للآفات داخل hindbrain (أي إجمالي حجم ومجال). تصدير القياسات في ملف Excel-
- تصور الآفات باستخدام " إنشاء سطح " و " سطح عرض " المهام.
- لقطة صور hindbrain في التوجهات المرجوة أو توليد فيلم للتصور ثلاثي الأبعاد للآفات-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حقنه واحدة من 4HT في P1 كان كافياً لحمل آفات CCM في المخيخ. اليود يتناقض الصغرى-CT لوجول الكشف عن الآفات CCM بما فيه الكفاية ويمكن قياس حجمها وعدد. استخدام محسن الصغرى-CT، نحن تصويرها CCM الآفات في هيندبرينس الفئران Ccm2إيكو . تم إعادة الصور الممسوحة ضوئياً بالأشعة السينية لإنتاج صور ثلاثية الأبعاد للدماغ الماوس، وسمح لتصور آفات كامل في حمة الدماغ في أعماق مختلفة والتوجهات، وتقييم هيكل وموقع ثلاثي الأبعاد للآفات في الدماغ. الأهم من ذلك، يمكن أيضا استخدام dataset هذه الصورة لتقدير كفاءة ودقة الآفة أحجام وإعداد الآفة.
ويبين الشكل 1 توجيهي ناجح من آفات CCM في المخيخ Ccm2إييكو (ب) ولكن ليس في ليتيرماتي عناصر التحكم (Ccm2fl/fl) (A) في P8.
ويبين الشكل 2 عينة معبأة للصغير-الأشعة المقطعية (A–ب)، والممثل بناؤها صور من مايكرو-المقطعية للتحكم (Ccm2fl/fl) (C) و Ccm2 إيكو (د–ه). الشكل 2 هاء' يظهر علامة الآفات في Ccm2إييكو.
ويبين الشكل 3 صورة ثلاثية الأبعاد المقدمة من الدماغ Ccm2إيكو مع الآفات (A–ب). ويبين الجدول المجاور مثالاً على المخرجات الكمية للآفات الفردية المسمى.
الشكل 1 : الاستقراء آفات CCM في الماوس الولدان. صور عيانية Ccm2fl/فلوريدا (A) والعقول Ccm2إييكو (ب) في يوم الولادة 8. تغيير حجم أشرطة (الأبيض)، 5 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نموذج إعداد وإعادة بنائها في 2D الصور. وجبات العينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي (A) ومل 5 أنابيب (ب). يظهر سهم أخضر العينة. صور الممثل Ccm2fl/فلوريدا (ج) والعقول Ccm2إيكو (د–ه). (ه ') ملحوظة من الآفات في الدماغ Ccm2إيكو . تغيير حجم أشرطة (الأبيض)، 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الصور ثلاثي الأبعاد المقدمة- تقديم الصورة للدماغ Ccm2إيكو مع الآفات (ألف) والآفات فقط (ب). وتتميز الآفات باللون الأحمر. ويبين الجدول على اليمين مثالاً على نوعية الناتج من آفات ملحوظ على حدة. تغيير حجم أشرطة (الأبيض)، 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هو CCM تشوه الأوعية الدموية مشتركة التي تؤثر على يصل إلى 0.5 في المائة من الأفراد1. يمكن أن يحدث CCM بشكل متقطع أو الأسرية. تشخيص المريض غالباً غير واضحة كما يمكن أن تمزق CCM الآفات بشكل غير متوقع تسبب السكتة الدماغية وغيرها من العواقب العصبية. حاليا، هو خيار العلاج الوحيد إزالتها جراحيا الآفات، التي تقترن بمخاطر عالية.
مؤخرا جرى استنساخ البشر CCM الظروف في النماذج الحيوانية7،،من89،10. توفر هذه النماذج أدوات لا تقدر بثمن للتحقيق في الآليات التي تشارك في CCM المرض. سوف يساعد أسلوب تحليل الكمي، فعالة ودقيقة للاستفادة من القيمة الكاملة لهذه النماذج.
وقد وضعنا مؤخرا أسلوب الصغرى-CT للصورة CCM الآفات في نماذج الماوس باستخدام تيتراوكسيدي أوزميوم ك عامل متناقضة14. في الدراسة الحالية، واستخدمنا في وقت لاحق اليود الحل لوجول لتحسين تباين أنسجة المخ للكشف عن الآفات. لوجول لليود الحل أقل سمية وغير مدمرة، وأرخص بالمقارنة مع تيتراوكسيدي الازميوم. ومن ثم، يمكن إعادة استخدام العينات لأغراض أخرى، مثل الأنسجة بعد أن جرفت اليود الحل لوجول.
لدينا طريقة الأشعة المقطعية الصغرى يمكن أن تنتج جودة الصورة كافية للكشف عن الآفات CCM في الدماغ الماوس. إعداد نموذج بسيط ولا تتطلب تقنيات عالية التخصص. هذا الأسلوب يمكن تقديم توقعات عالية الدقة مع وقت المسح الضوئي لمدة ساعة تقريبا. الجمع بين مجموعات البيانات من الأشعة المقطعية الصغرى وبرمجيات تحليل ثلاثي الأبعاد وسيلة قوية إنشاء طريقة عرض ثلاثي الأبعاد عالمية للآفات CCM في الدماغ. التمثيل الكمي والنوعي للآفات بالنسبة إلى تشريح الدماغ ويتحقق بسهولة. بالمقارنة مع إعادة البناء ثلاثي الأبعاد المستندة إلى علم الأنسجة، أسلوبنا هو الغاية الوقت--وفعالة من حيث التكلفة وينتج تمثيلات ثلاثية الأبعاد أكثر دقة بكثير.
ومع ذلك، هناك أيضا قيود والخطوات الحاسمة التي يمكن النظر فيها. أولاً، يتطلب الأسلوب نظام CT الجزئي لمعدات متخصصة للغاية وقد لا تكون متاحة بسهولة. وثانيا، تشريح الدماغ الماوس الأطفال حديثي الولادة يمكن أن تكون صعبة جداً بسبب ليونة وحجم أنسجة المخ. من المهم جداً ليس تلف الدماغ أثناء تشريح بغية الحصول على قياسات دقيقة والتصور للآفات CCM في الدماغ. وأخيراً، إعداد نموذج للصغير-المقطعية أمر بالغ الأهمية. يجب أن تكون معبأة اليود في لوجول الملون العقول تماما لتجنب انكماش الأنسجة بسبب التبخر. أيضا، يجب أن توضع العينات بشكل أمن خلال مايكرو-المقطعية. أي حركة أثناء الفحص سوف يغير نوعية الفحص ومن ثم القياس الكمي والتصور.
وقد طبقنا أسلوبنا في أدمغة الفأر حديثي الولادة الثابتة فقط. ومع ذلك، هذا الأسلوب لديه القدرة على استخدامها لدراسات أخرى شملت عينات مختلفة وتكون بمثابة أداة مبتكرة ومثيرة للبحوث تشوه الأوعية الدموية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يعترف أصحاب التسهيلات والمساعدة العلمية والتقنية للفحص المجهري سيدني & مرفق البحوث سليكية (أممرف) والمركز الأسترالي للفحص المجهري & سليكية (أكمم) في جامعة سيدني. حظيت هذه الدراسات "الصحة الوطنية الأسترالية" ومنح المشروع مجلس البحوث الطبية (NHMRC) 161558 و APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
