Summary
Ce protocole montre l’induction de la maladie dans un modèle murin de malformation caverneuse cérébrale et utilisations contraste amélioré micro tomographie par ordinateur pour mesurer le fardeau de la lésion. Cette méthode améliore la valeur établie de modèles de souris pour étudier les bases moléculaires et des thérapies potentielles pour malformation caverneuse cérébrale et autres maladies cérébro-vasculaires.
Abstract
Des mutations dans le CCM1 (aka KRIT1), CCM2, ou CCM3 (aka PDCD10) gène cause malformation caverneuse cérébrale (CCM) chez les humains. Modèles murins de la maladie de la CCM ont été établis par tamoxifène induite par délétion de gènes de Ccm chez les animaux après la naissance. Ces modèles de souris offrent des outils précieux pour étudier les mécanismes moléculaires et des approches thérapeutiques pour la maladie de CCM. Une méthode précise et quantitative pour évaluer la progression et le fardeau de la lésion est indispensable pour exploiter la pleine valeur de ces modèles animaux. Ici, nous démontrons l’induction de la maladie dans un modèle murin CCM et l’utilisation du contraste amélioré la méthode de (micro-CT) micro tomographie par rayons x mesure CCM fardeau de lésion dans le cerveau de souris. Jours après la naissance 1 (P1), nous avons utilisé 4-hydroxytamoxifen (4HT) pour activer l’activité recombinase Cre du transgène en conjonction avec l’allèle floxed de Ccm2Cdh5-CreErt2. Des lésions dans le cerveau de souris CCM ont été analysées à P8. Pour micro-CT, de base d’iode Lugol a été utilisé pour renforcer le contraste dans le tissu cérébral. Nous avons optimisé les paramètres de numérisation et utilisé une dimension voxel de 9,5 µm, conduisant à une taille minimale de 25 µm environ. Cette résolution est suffisante pour mesurer le nombre et le volume de lésion CCM dans le monde et avec précision et garantir la qualité de cartographie 3D de lésions CCM dans le cerveau de souris. Cette méthode augmente la valeur des modèles souris établi pour étudier les bases moléculaires et des thérapies potentielles pour CCM et autres maladies cérébro-vasculaires.
Introduction
CCM sont à parois minces, dilaté des malformations vasculaires dans le cerveau avec une prévalence de 0,5 % dans la population humaine1. CCM peut être héritée comme un trouble dominant due à des mutations perte de fonction dans l’un des trois gènes : CCM1 (aka Krit1), CCM2et CCM3 (également appelé PDCD10)2,3,4 ,5,6. Ces gènes sont présents dans un seul complexe de signalisation.
Divers modèles ont été développés pour la maladie humaine de CCM modèle et comprendre les voies en aval des gènes CCM qui sont responsables de la CCM7,8,9,10. Le modèle plus robuste consiste à supprimer sous condition l’un des gènes Ccm avec tamoxifène-inducible Cdh5-CreERT2 P1 dans nouveau-nés8,10. Ces petits développent des lésions dans le cerveau de P6 onward CCM et sont censées être un modèle idéal pour les études précliniques dans recherche de mécanismes et d’agents thérapeutiques dans le traitement des maladies de la CCM.
Fardeau de lésion CCM dans le cerveau de souris a été mesurée principalement par des méthodes basées sur l’histologie, une approche qui est chronophage et sous réserve de l’enquêteur biaiser10,11,12. MRI basée méthodes ont été utilisées pour évaluer la charge de lésion CCM dans le modèle de souris adulte9,13. Toutefois, un hautement spécialisés petits animaux MRI instrument et un long temps de numérisation de plusieurs heures à la nuit est nécessaire pour parvenir à une solution satisfaisante à l’identification des lésions CCM. En outre, si MRI peut être utilisé pour détecter les lésions de la CCM en souris néonatales n’a été signalé et résolution peut-être limiter la sensibilité.
Nous avons récemment mis au point une technique de micro-CT de l’image et d’analyser les CCM lésion14,15. Cette haute résolution, temps et méthode rentable boosté considérablement la valeur du modèle maladie CCM dans les études mécanistiques et thérapeutiques. Amélioration de contraste, toute monture coloration méthodes ont été utilisées pour l’imagerie des tissus mous et des embryons de souris16,17micro-CT. Auparavant, nous avons utilisé une coloration de base osmium pour renforcer le contraste pour l’imagerie des lésions de la CCM en cerveau14micro-CT. Dans cet article, nous avons utilisé une moins toxiques, non destructive, et réactif rentable, un iode Lugol solution, pour renforcer le contraste pour l’imagerie micro-CT basée sur. Iode peut se diffuser dans tout le cerveau et a une forte affinité pour le sang18.
Le protocole détaillé est présenté ici pour l’induction des lésions CCM dans un modèle de souris néonatales avec l’imagerie et l’analyse des lésions CCM avec un contraste base micro-CT. Cette méthode basée sur des micro-CT permet la quantification globale du volume de lésion CCM, identifie avec précision le nombre et l’emplacement 3D des lésions CCM dans le cerveau de souris et réduit considérablement le coût et temps requis au phénotype de ces animaux.
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Protocol
tous les protocoles et éthique animale ont été approuvées par le Sydney Health District Animal Welfare Comité Local et animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université médicale de Tianjin. Toutes les expériences se sont déroulées sous les directives et règlements du centenaire Institute, University of Sydney et Université médicale de Tianjin
1. Induction of Cerebral Cavernous Malformations chez les modèles murins
- Cross Cdh5-CreErt2 ; Ccm2 fl/fl souris avec Ccm2 fl/fl pour générer des portées avec Cdh5-CreErt2 ; Ccm2 fl/fl chiots (Ccm2 iECKO) et les contrôles de même portée (Ccm2 fl/fl). Animaux Cdh5-CreErt2 et Ccm2 fl/fl ont été décrites précédemment 19.
- Dissoudre 4HT éthanol à 100 % et stocker à-80 ° C dans les parties aliquotes de 30 µL (4HT concentration : 10 mg/mL). Le jour d’utilisation, diluer 4HT aliquotés dans l’huile de maïs (0,5 mg/mL).
- Par voie intragastrique injecter 50 µL de 4HT (0,5 mg/mL) à petits néonatales au P1 pour induire des lésions expérimentales de CCM à l’aide d’une seringue à insuline.
2. L’échantillon de préparation pour les analyses Micro-CT
- euthanasier les chiots nouveau-nés P8 par asphyxie de dioxyde de carbone.
- Effectuer perfusion intracardiaque en insérant une aiguille de calibre 29 avec 3 mL de paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS dans une seringue de 10 mL dans le ventricule du coeur souris.
ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée. - Détacher la tête du corps à l’aide d’une paire de ciseaux. Enlever toute la peau de la tête à l’aide d’une paire de ciseaux et Décollez le crâne à l’aide de pinces à disséquer le cerveau entier.
- Prendre des images du cerveau avec stéréomicroscope à 7,82 x grossissement 1 x gain, gamma 0,6 et temps d’exposition de 20 ms.
- Fixer les cerveaux disséqués avec paraformaldéhyde à 4 % dans une solution de PBS du jour au lendemain.
ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée. - Le jour suivant, hindbrains à l’aide d’une pince de détacher et laver avec une solution de PBS.
- Incuber l’hindbrains en soluté iodo-ioduré ' solution s d’iode pendant 48 h.
- Après l’incubation, brièvement sécher à l’air les hindbrains pour enlever l’excès Lugol ' solution d’iode de s.
- Pack le Lugol ' iode s teinté hindbrains en tubes de microcentrifuge de 0,65 mL et joint complètement avec film plastique paraffine pour éviter le rétrécissement des tissus ( Figure 2 A).
- Placer les tubes de microcentrifuge dans des tubes en plastique de 5 mL avec des éponges pour empêcher tout mouvement pendant le balayage ( Figure 2 B).
3. Micro-CT Scan de CCM dans le cerveau de souris
- monter verticalement le rhombencéphale emballé dans un tube sur un support en aluminium dans le système de micro-CT.
- Définir les paramètres de numérisation à 540 projections et 2 s temps d’exposition aux conditions de la source de 50 kV et 10 W pour acquérir les ensembles de données tomographiques (image résolution 9,5 μm/pixel).
- Les radiographies de l’analyse sont reconstruits automatiquement par le logiciel de reconstruction de projection basée sur le matériel fourni par le système de micro-CT, production d’une série d’image de 16-bit tranches axiales (" TXM " file).
4. Analyse des ensembles de données Micro-CT
- ouvrir le fichier d’une image reconstruite (" TXM " fichier) dans le logiciel d’analyse 3D et de visualiser le cerveau en utilisant le " rendu volumique " fonction.
- Transformer le cerveau postérieur à l’orientation souhaitée en utilisant le " englobant " et " plan de délimitation " fonctions.
- Ré-échantillonner l’image transformée en mode étendu et conserver la taille du voxel.
- Create " modifier nouvelle étiquette champ " sur l’image transformée (4.3) et sélectionnez seulement le cerveau postérieur à l’aide de niveaux de gris intensité.
- Ajouter les sections lumineuses et exécutez " étiquette analyse " d’obtenir des mesures du rhombencéphale entier (c.-à-d., volume total et région). Exportation des mesures dans un fichier Excel.
- Visualiser le cerveau postérieur à l’aide du " rendu de l’isosurface " fonction.
- Créer un autre " modifier nouvelle étiquette champ " sur les zones image et mise en surbrillance transformées avec des lésions à l’aide de niveaux de gris intensité.
- Ajouter les sections lumineuses et exécutez " label " analyse d’obtenir des mesures des lésions dans le cerveau postérieur (c.-à-d., volume total et région). Exportation des mesures dans un fichier Excel.
- Visualiser les lésions à l’aide de la " générer surface " et " vue de surface " fonctions.
- Les images du cerveau postérieur à orientations souhaitées de capture instantanée ou de générer un film pour la visualisation 3D des lésions.
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Representative Results
Une seule injection de 4HT P1 a été suffisante pour induire des lésions CCM dans le cervelet. Lugol iode contrasté micro-CT suffisamment décelé des lésions de la CCM et pourrait quantifier son volume et nombre. En utilisant le micro-CT optimisée, nous imagés lésions CCM dans les hindbrains de Ccm2iECKO souris. Radiographies numérisées ont été reconstruites pour produire des images 3D du cerveau de souris, ce qui a permis la visualisation des lésions ensemble dans le parenchyme du cerveau à différentes profondeurs et orientations et évaluation de la structure et l’emplacement 3D des lésions dans le cerveau. Ce qui est important, cet ensemble de données image utilisable également pour la quantification précise et efficace de la taille de la lésion et le nombre de lésion.
La figure 1 illustre induction réussie des lésions CCM dans le cervelet du Ccm2iECKO (B), mais pas chez les témoins de même portée (Ccm2fl/fl) (A) P8.
La figure 2 montre un échantillon emballé pour micro-CT scan (A–B), et représentant reconstruit des images de la micro-scanner de contrôle (Ccm2fl/fl) ()C) et Ccm2 iECKO D–E. Figure 2 E' spectacles marqués des lésions chez Ccm2iECKO.
La figure 3 montre une image 3D d’un cerveau Ccm2iECKO présentant des lésions (A–B). Tableau ci-contre montre un exemple de résultat quantitatif des lésions individuelles étiquetées.
Figure 1 : Induction des lésions de la CCM en souris néonatale. Images macroscopiques de Ccm2fl/fl (A) et de la cervelle Ccm2iECKO (B) jours après la naissance 8. Échelle des barres (blanc), 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation des échantillons et de reconstruire des images 2D. Échantillon emballé dans un tube de microcentrifuge (A) et 5 mL tubes (B). Flèche verte montre l’exemple. Images représentant des Ccm2fl/fl (C) et de la cervelle Ccm2iECKO (D–E). (E') Marqué de lésions dans le cerveau Ccm2iECKO . Échelle des barres (blanc), 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Rendu des images 3-d. Image de cerveau Ccm2iECKO avec lésions (A) et lésions rendue seule (B). Les lésions sont marquées en rouge. Tableau sur la droite montre un exemple de sortie qualitative des lésions marquées. Échelle des barres (blanc), 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
CCM est une malformation vasculaire commune qui affecte jusqu'à 0,5 % d’individus1. CCM peut se produire sous forme sporadique ou familiale. Pronostic de patients est souvent obscure comme lésions CCM peuvent entraîner une rupture inattendue pour provoquer des accidents vasculaires cérébraux et autres conséquences neurologiques. Actuellement, l’option seul traitement consiste à enlever chirurgicalement les lésions qui s’accompagnent d’un risque élevé.
Des conditions humaines de CCM ont récemment été reproduites en modèles animaux7,8,9,10. Ces modèles fournissent des outils précieux pour étudier les mécanismes impliqués dans la maladie CCM. Une méthode d’analyse quantitative, efficace et précis vous aidera à exploiter la pleine valeur de ces modèles.
Nous avons récemment développé une méthode de micro-CT aux lésions CCM image dans des modèles murins utilisant le tétraoxyde d’osmium comme un contraste agent14. Dans la présente étude, nous avons par la suite utilisé de Lugol pour renforcer le contraste des tissus du cerveau pour détecter les lésions. Solution d’iode Lugol est moins toxique, non destructive et moins cher par rapport au tétraoxyde d’osmium. Par conséquent, les échantillons peuvent être réutilisées à d’autres fins, telles que l’histologie après de Lugol est emporté.
Notre méthode de micro-CT pourrait produire une qualité d’image suffisante pour détecter les lésions de la CCM dans le cerveau de souris. La préparation de l’échantillon est simple et ne nécessite pas de techniques hautement spécialisées. Cette méthode peut fournir des projections haute résolution avec un temps de recherche d’environ une heure. Combinant des datasets de micro-tomographie par ordinateur et des logiciels d’analyse 3D est un moyen puissant pour générer une vue 3D globale des lésions CCM dans le cerveau. La représentation quantitative et qualitative des lésions relatives à l’anatomie du cerveau est facile à réaliser. Par rapport à la reconstruction 3D axée sur l’histologie, notre méthode est hautement temps - et rapport coût - entrée et produit des représentations 3D beaucoup plus précises.
Cependant, il y a aussi limites et des étapes critiques à prendre en considération. Tout d’abord, la méthode requiert un système de micro-CT, ce qui est matériel hautement spécialisé et ne peut-être pas être facilement disponibles. Deuxièmement, il peut être assez difficile en raison de la douceur et la taille du tissu cérébral de dissection du cerveau de souris néonatales. Il est très important de ne pas endommager le cerveau au cours de la dissection afin d’obtenir des mesures précises et la visualisation des lésions CCM dans le cerveau. Enfin, la préparation des échantillons pour analyse micro-CT est essentielle. Iode Lugol teinté cerveaux doit être emballé complètement pour éviter le rétrécissement des tissus due à l’évaporation. En outre, les échantillons doivent être placés en toute sécurité lors de l’analyse micro-CT. Tout mouvement pendant l’analyse modifiera la qualité de la numérisation et donc la quantification et la visualisation.
Nous avons appliqué notre méthode uniquement dans le cerveau de souris néonatales fixe. Toutefois, cette méthode est en mesure d’être utilisé pour d’autres études portant sur différents échantillons et peut constituer un outil passionnant et nouveau pour une autre recherche de malformation vasculaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les installations et l’assistance scientifique et technique de la microscopie de Sydney & microanalyse Research Facility (AMMRF) et le Centre australien pour la microscopie & microanalyse (APD) à l’Université de Sydney. Ces études ont été pris en charge par l’Australian National Health et projet Medical Research Council (NHMRC) grant 161558 et APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
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