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Medicine

Induktion und Mikro-CT-Bildgebung des zerebralen höhlenartigen Fehlbildungen im Mausmodell

Published: September 4, 2017 doi: 10.3791/56476
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2,3
1Lab of Cardiovascular Signaling, Centenary Institute, 2Faculty of Medicine, Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Australian Centre for Microscopy & Microanalysis, University of Sydney

Summary

Dieses Protokoll zeigt die Induktion der zerebralen höhlenartigen Fehlbildung Krankheit in einem Mausmodell und Verwendungen Kontrast verstärkt Mikro-Computertomographie um Läsion Belastung zu messen. Diese Methode steigert den Wert der etablierten Mausmodelle, die molekularen Grundlagen und mögliche Therapien für zerebrale höhlenartigen Missbildungen und anderen zerebrovaskulären Krankheiten zu studieren.

Abstract

Mutationen in den CCM1 (aka KRIT1), CCM2, oder CCM3 (aka PDCD10) gen zerebralen höhlenartigen Fehlbildung (CCM) beim Menschen verursachen. Maus-Modellen der CCM Krankheit wurden durch Tamoxifen induziert Löschung von Ccm -Genen in postnatale Tiere eingerichtet. Diese Mausmodelle bieten wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung von molekularen Mechanismen und therapeutische Ansätze für CCM-Krankheit. Eine genaue und quantitative Methode zur Bewertung der Läsion Belastung und Progression ist wichtig, den vollen Nutzen aus diesen Tiermodellen nutzbar zu machen. Hier zeigen wir die Induktion von CCM Krankheit in einem Maus-Modell und die Verwendung der Kontrast verbessert Röntgen Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) Methode zur Maßnahme CCM Läsion Belastung in Mäusegehirnen. Postnatale Tag 1 (P1) haben wir 4-Hydroxytamoxifen (4HT) um Kre Rekombinase Aktivität aus der Cdh5-CreErt2 Transgen, das Floxed Allel des Ccm2Spalten zu aktivieren. CCM-Läsionen im Gehirn der Maus wurden bei P8 analysiert. Für Mikro-CT wurde Jod Basis Lugolsche Lösung verwendet, um Kontrast im Gehirngewebe zu verbessern. Wir haben die Scan-Parameter optimiert und verwendet eine Voxel-Dimension von 9,5 µm führen zu eine minimale Strukturgröße von etwa 25 µm. Diese Auflösung ist ausreichend, um CCM Läsion Volumen und Anzahl weltweit und genau zu messen, und bieten qualitativ hochwertige 3D Mapping CCM Läsionen im Gehirn der Maus. Diese Methode erhöht den Wert der etablierten Mausmodelle zur Untersuchung der molekularen Grundlagen und mögliche Therapien für CCM und zerebrovaskulären Erkrankungen.

Introduction

CCM sind dünn eingemauert, Gefäßmissbildungen im Gehirn mit Prävalenz von bis zu 0,5 % in der menschlichen Bevölkerung1geweitet. CCM kann als dominante Erkrankung aufgrund von Verlust der Funktion Mutationen in einem der drei Gene vererbt werden: CCM1 (aka Krit1), CCM2und CCM3 (auch genannt PDCD10)2,3,4 ,5,6. Diese Gene sind in einer einzigen komplexen Signalisierung.

Verschiedene Modelle wurden entwickelt, Modell CCM Krankheiten und die nachgeschalteten Bahnen CCM Gene zu verstehen, die verantwortlich sind für CCM7,8,9,10. Das robusteste Modell ist, bedingt eine der Ccm -Gene mit Tamoxifen-induzierbaren Cdh5-CreERT2 auf P1 in neugeborenen Welpen8,10löschen. Diese Welpen CCM Läsionen im Gehirn von P6 weiter zu entwickeln und werden voraussichtlich ein ideales Modell für prä-klinischen Studien auf der Suche nach Mechanismen und therapeutische Wirkstoffe bei der Behandlung von Krankheiten CCM.

CCM Läsion Belastung im Gehirn der Maus wurde in erster Linie durch Histologie-basierte Methoden, ein Konzept, das sehr zeitaufwändig ist gemessen und je nach Prüfer bias10,11,12. MRT-basierte Methoden wurden zur CCM Läsion Belastung in der erwachsenen Maus Modell9,13zu bewerten. Eine hoch spezialisierte kleine Tier MRI-Instrument und lange Scan-Zeit von mehreren Stunden, über Nacht ist jedoch erforderlich, eine zufrieden stellende Lösung zur Identifizierung von CCM Läsionen zu erreichen. Auch, ob MRI verwendet werden kann, um CCM Läsionen bei neugeborenen Mäusen zu erkennen nicht gemeldet und Auflösung kann Empfindlichkeit einschränken.

Vor kurzem haben wir eine Mikro-CT-Technik, um Bild und analysieren CCM Läsion14,15. Dieser hochauflösenden, Zeit- und kosteneffektive Methode verstärkt drastisch den Wert des Modells CCM Krankheit in mechanistischen und therapeutische Studien. Kontrast steigernde, ganze Berg Färbung Methoden wurden für die Mikro-CT-Bildgebung der Weichteile und Maus Embryonen16,17verwendet. Haben wir früher eine Osmium-basierte Färbung um Kontrast für die Mikro-CT-Bildgebung CCM Läsionen im Gehirn14zu erhöhen. In diesem Papier wir haben einen weniger toxisch, nicht-destruktiv, und kostengünstige Reagens ein Jod Basis Lugolsche Lösung, um Kontrast für die Mikro-CT-Bildgebung zu verbessern. Jod kann im gesamten Gehirn diffundieren und hat eine hohe Affinität für Blut18.

Das ausführliche Protokoll wird hier für die Induktion von CCM Läsionen in einem Neugeborenen Maus-Modell zusammen mit der Bildgebung und Analyse von CCM Läsionen mit einem Kontrast-basierten Mikro-CT dargestellt. Diese Mikro-CT basierte Methode liefert quantitative globale Messung von CCM Läsion Volumen, genau die Anzahl und die 3-d-Position der CCM Läsionen im Gehirn Maus identifiziert und reduziert die Kosten und Zeit erforderlich, um Phänotyp dieser Tiere.

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Protocol

alle Tierethik und Protokolle wurden von The Sydney lokale Gesundheit Bezirk Animal Welfare Committee und institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der medizinischen Universität Tianjin genehmigt. Alle Experimente wurden nach den Richtlinien/Verordnungen der Hundertjahrfeier Institute, University of Sydney und Tianjin Medical University

1. Induktion von zerebralen höhlenartigen Fehlbildungen in Mausmodellen

  1. Kreuz Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl Mäuse mit Ccm2 fl/fl, Würfe mit generieren Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) Welpen und stellt Steuerelemente (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 und Ccm2 fl/fl Tiere wurden zuvor beschriebenen 19.
  2. 4HT in 100 % igem Ethanol lösen und Lagern bei-80 ° C in Aliquote von 30 µL (4HT Konzentration: 10 mg/mL). Am Tag der Gebrauch verdünnen regelmÄÑig 4HT in Maisöl (0,5 mg/mL).
  3. Intragastrically 4HT 50 µL zu injizieren (0,5 mg/mL) neugeborenen Welpen im P1, experimentelle CCM Läsionen mit einer Insulin-Spritze zu induzieren.

2. Probenvorbereitung für Mikro-CT-Scans

  1. einschläfern Neugeborene Welpen bei P8 über Kohlendioxid Erstickung.
  2. Intra kardiale Perfusion führen Sie durch eine 29-Gauge Nadel mit 3 mL 2 % Paraformaldehyd in PBS in einer 10 mL Spritze in den Ventrikel des Herzens Maus.
    Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; entsprechenden Verschleißschutz.
  3. Trennen den Kopf vom Körper mit einer Schere. Entfernen Sie die Haut den Kopf mit einer Schere ab und ziehen Sie den Schädel mit Pinzette, das ganze Gehirn zergliedern.
  4. Bilder des Gehirns mit Stereomikroskop bei 7,82 x Vergrößerung, 1 X Gain, 0,6 Gamma und 20 ms Belichtungszeit nehmen.
  5. Fixieren die seziert Gehirne mit 4 % Paraformaldehyd in PBS-Lösung über Nacht.
    Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; entsprechenden Verschleißschutz.
  6. Am Folgetag, Hindbrains mit einer Pinzette entfernen und waschen mit PBS Lösung.
  7. Hindbrains in Lugol inkubieren ' s-Jod-Lösung für 48 h
  8. Nach der Inkubation kurz Luft trocknen Hindbrains entfernen überschüssige Lugol ' Jod-Lösung s.
  9. Packen die Lugol ' s Jod gebeizt Hindbrains 0,65 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Dichtung komplett mit Kunststoff Paraffin Film Gewebe schrumpfen ( Abb. 2 A) zu vermeiden.
  10. 5 mL Kunststoffrohre mit Schwämmen zu bewegen während des Scans ( Abbildung 2 B) hindern Mikrozentrifugenröhrchen entgegenbringen.

3. Mikro-CT Scan von CCM in das Gehirn der Maus

  1. vertikal montieren das Hinterhirn, verpackt in einem Rohr auf einer Aluminium-Halterung in das Mikro-CT-System.
  2. Legen Sie die Scanparameter auf 540 Projektionen und 2 s Belichtungszeit mit Quelle Bedingungen von 50 kV und 10 W tomographische Datasets (Bild Auflösung 9,5 µm/Pixel) zu erwerben.
  3. Röntgenbilder aus dem Scan werden rekonstruiert automatisch durch hardwarebasierte Projektion Rekonstruktion von Mikro-CT-System gelieferte Software produzieren eine Bildserie von 16-Bit axialen Scheiben (" TXM " Datei).

4. Analyse von Mikro-CT-Datensätzen

  1. die rekonstruierte Bild-Datei öffnen (" TXM " Datei) in der 3-d-Analysesoftware und zu visualisieren, das Gehirn mit der " Volumen-Rendering " Funktion.
  2. Verwandeln das Hinterhirn in die gewünschte Richtung mit der " bounding-Box " und " Schnittebene " Funktionen.
  3. Resample das transformierte Bild im erweiterten Modus und bewahren die Voxel Größe.
  4. Erstellen " bearbeiten neue Feld "Beschriftung" " auf das umgewandelte Bild (4.3) und markieren Sie nur die Verwendung von Graustufen Intensität Hinterhirn.
  5. Die hervorgehobenen Bereiche hinzufügen und ausführen " beschriften Analyse " Messungen von der ganzen Hinterhirn (d.h., Gesamtvolumen und Bereich). Messungen in einer Excel-Datei exportieren.
  6. Visualisieren das Hinterhirn mit der " Isofläche Render " Funktion.
  7. Erstellen Sie eine weitere " bearbeiten neue Feld "Beschriftung" " auf die transformierten Bild und markieren Sie Bereiche mit Läsionen mit Graustufen Intensität.
  8. Die hervorgehobenen Bereiche hinzufügen und ausführen " Label " Analysen, Messungen der Läsionen innerhalb der Hinterhirn (d.h., Gesamtvolumen und Bereich) zu erhalten. Messungen in einer Excel-Datei exportieren.
  9. Visualisieren die Läsionen mit der " Oberfläche erzeugen " und " Ansicht der Oberfläche " Funktionen.
  10. Snapshot-die Bilder von dem Hinterhirn bei gewünschten Ausrichtungen oder erstellen Sie einen Film für 3-d Visualisierung der Läsionen.

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Representative Results

Eine einmalige Injektion von 4HT im P1 reichte aus, um CCM Läsionen im Kleinhirn zu induzieren. Lugol Jod kontrastiert Mikro-CT ausreichend CCM Läsionen erkannt und konnte sein Volumen und seine Nummer zu quantifizieren. Nutzen die optimierte Mikro-CT, abgebildet wir CCM Läsionen in der Hindbrains von Ccm2iECKO Mäusen. Gescannte Röntgenbilder wurden rekonstruiert, um 3-d-Bilder des Mausgehirns,, die Visualisierung der gesamten Läsionen im Gehirn Parenchym in verschiedenen Tiefen und Orientierungen erlaubt und Beurteilung der Struktur und 3-d-Lage der Läsionen im Gehirn zu erzeugen. Wichtig ist, kann dieses Bild Dataset auch für effiziente und genaue Quantifizierung der Läsion Größen und Läsion Zahlen verwendet werden.

Abbildung 1 zeigt erfolgreiche Induktion von CCM Läsionen im Kleinhirn Ccm2iECKO (B) aber nicht im stellt Steuerelemente (Ccm2fl/fl) (A) bei P8.

Abbildung 2 zeigt eine gepackte Probe für Mikro-CT-Untersuchung (A–B), und Vertreter rekonstruiert die Bilder aus der Mikro-CT-Scan des Steuerelements (Ccm2fl/fl), (C) und Ccm2 iECKO (D–E). Abbildung 2 E' zeigt Läsionen in Ccm2iECKOgekennzeichnet.

Abbildung 3 zeigt ein gerendertes 3-d-Bild eines Ccm2iECKO Gehirns mit Läsionen (A–B). Nebenstehenden Tabelle zeigt ein Beispiel für quantitative Ausgabe der beschrifteten einzelnen Läsionen.

Figure 1
Abbildung 1 : Induktion von CCM Läsionen bei Neugeborenen Maus. Makroskopische Bilder von Ccm2fl/fl (A) und Ccm2iECKO (B) Gehirn am postnatale Tag 8. Skalieren von Bars (weiß), 5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Probenvorbereitung und rekonstruiert 2D-Bilder. Probe verpackt in einem Microcentrifuge Schlauch (A) und 5 mL Rohre (B). Grüner Pfeil zeigt die Probe. Repräsentative Bilder von Ccm2fl/fl (C) und Ccm2iECKO (D–E) Gehirne. (E') Markierten Läsionen im Gehirn Ccm2iECKO . Skalieren von Bars (weiß), 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Gerenderte 3-d-Bilder. Gerendertes Bild Ccm2iECKO Gehirn mit Läsionen (A) und Läsionen nur (B). Läsionen sind rot markiert. Tabelle auf der rechten Seite zeigt ein Beispiel für qualitative Ausgabe individuell markierten Läsionen. Skalieren von Bars (weiß), 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

CCM ist eine gemeinsame vaskulären Fehlbildung, die bis zu 0,5 % von Einzelpersonen1betrifft. CCM kann in sporadischen oder familiäre Form auftreten. Die Prognose der Patienten ist oft unklar, da CCM Läsionen unerwartet Bruch können, Schlaganfall und anderen neurologischen Folgen verursachen. Derzeit ist die einzige Behandlungsmöglichkeit Läsionen, chirurgisch zu entfernen, die mit hohem Risiko einhergehen.

Menschlichen CCM Bedingungen haben vor kurzem reproduziert worden Tiermodelle7,8,9,10. Diese Modelle bieten wertvolle Werkzeuge um Mechanismen beteiligt CCM Krankheit zu untersuchen. Eine präzise, effiziente und quantitative Analyse-Methode hilft, um den vollen Wert dieser Modelle zu nutzen.

Wir haben vor kurzem eine Mikro-CT-Methode, um Bild CCM Läsionen in Mausmodellen mit Osmium Tetraoxide als eine kontrastierende Agent14entwickelt. In der aktuellen Studie haben wir anschließend Lugol-Jod-Lösung verwendet, um den Kontrast des Gehirngewebes Läsionen erkennen zu verbessern. Lugol-Jod-Lösung ist weniger toxisch, nicht-destruktive und billiger im Vergleich zu Osmium Tetraoxide. Daher können die Proben wiederverwendet werden, für andere Zwecke, z. B. Histologie nach Lugol-Jod-Lösung abgespült werden.

Unsere Mikro-CT-Methode könnte ausreichend Bildqualität um CCM Läsionen im Gehirn Maus zu erkennen. Die Probenvorbereitung ist unkompliziert und erfordert keine hochspezialisierte Techniken. Diese Methode kann hochauflösende Projektionen mit einer Scan-Zeit von etwa einer Stunde bereit. Kombination von Datensätzen aus Mikro-CT-Scans und 3-d-Analyse-Software ist eine leistungsfähige Methode zur globalen 3D-Ansicht CCM Läsionen im Gehirn erzeugen. Die quantitative und qualitative Darstellung der Läsionen im Vergleich zu Anatomie des Gehirns ist problemlos möglich. Im Vergleich zur Histologie-basierte 3-d-Rekonstruktion, unsere Methode ist sehr Zeit - und Kosten - wirtschaftlicheren und produziert sehr viel genauere 3-d-Darstellungen.

Es gibt jedoch auch Einschränkungen und wichtige Schritte zu beachten. Die Methode erfordert erstens eine Mikro-CT-System, die hochspezialisierten Geräten und kann nicht ohne weiteres zugänglich sein. Zweitens kann das sezieren die neonatale Mäusegehirn ziemlich schwierig aufgrund der Weichheit und der Größe des Hirngewebes sein. Es ist sehr wichtig, nicht das Gehirn während der Präparation zu beschädigen, um genaue Messungen und Visualisierung der CCM Läsionen im Gehirn zu erwerben. Zu guter Letzt ist Probenvorbereitung für Mikro-CT-Untersuchung von entscheidender Bedeutung. Lugol Jod gebeizt Gehirne muss komplett verpackt werden, um Gewebe schrumpfen durch Verdunstung zu vermeiden. Außerdem müssen Proben sicher während des Mikro-CT-Scans platziert werden. Jede Bewegung während des Scans wird die Qualität des Scans verändern und damit die Quantifizierung und Visualisierung.

Wir haben unsere Methode nur in festen neonatale Mäusegehirnen angewandt. Aber diese Methode hat die Fähigkeit, für andere Studien mit verschiedenen Proben verwendet werden und kann als ein spannendes und neuartiges Werkzeug für andere Vaskuläre Fehlbildungen Forschung dienen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen die Einrichtungen und die wissenschaftliche und technische Unterstützung Sydney Mikroskopie & Mikroanalyse Research Facility (AMMRF) und das australische Zentrum für Mikroskopie und Mikroanalyse (ACMM) an der University of Sydney. Diese Studien wurden unterstützt von Australian National Health und Medical Research Council (NHMRC) Projekt zu gewähren, 161558 und APP1124011 (XZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxy tamoxifen Sigma-Aldrich H6278 To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope Leica M205FA To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution Sigma-Aldrich L6146 To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film Parafilm PM992 To package samples
Micro-CT Xradia MicroXCT-400 Micro-CT
3D rendering software FEI Visualization Science group Avizo 3D image processing software To analyse micro-CT scans

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References

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Medizin Ausgabe 127 Micro berechnet Tomographie zerebrale höhlenartigen Fehlbildung Maus-Modell vaskuläre Fehlbildungen CCM1-Gens Krit1gene
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Choi, J. P., Yang, X., Foley, M.,… More

Choi, J. P., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model. J. Vis. Exp. (127), e56476, doi:10.3791/56476 (2017).

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