Summary
Questo protocollo dimostra l'induzione della malattia di malformazione cavernosa cerebrale in un modello murino e usi contrasto migliorato micro tomografia computerizzata per misurare il carico lesionale. Questo metodo aumenta il valore di modelli murini stabilito per lo studio delle basi molecolari e le terapie potenziali per malformazione cavernosa cerebrale e altre malattie cerebrovascolari.
Abstract
Mutazioni nella CCM1 (aka KRIT1), CCM2, o CCM3 (aka PDCD10) gene causano malformazione cavernosa cerebrale (CCM) in esseri umani. Modelli murini di malattia CCM sono stati stabiliti da tamoxifene indotto da delezione dei geni Ccm in animali postnatali. Questi modelli di mouse forniscono preziosi strumenti per studiare il meccanismo molecolare e approcci terapeutici per la malattia CCM. Un metodo preciso e quantitativo per valutare la progressione e carico lesionale è essenziale per sfruttare il valore completo di questi modelli animali. Qui, dimostriamo l'induzione di malattia in un modello murino di CCM e l'uso del contrasto migliorato il metodo di (micro-CT) micro tomografia computerizzata a raggi x per misura CCM carico lesionale in cervelli di topo. Al giorno postnatale 1 (P1), abbiamo usato 4-hydroxytamoxifen (4HT) per attivare Cre ricombinasi attività dal transgene fendere floxed allele del Ccm2Cdh5-CreErt2. Le lesioni CCM in cervelli di topo sono state analizzate P8. Per micro-CT, soluzione di Lugol iodio basato è stato usato per migliorare il contrasto nel tessuto cerebrale. Abbiamo ottimizzato i parametri di scansione e utilizzate una dimensione del voxel di 9,5 µm, che conducono a una dimensione minima caratteristica di circa 25 µm. Questa risoluzione è sufficiente per misurare il numero e volume della lesione CCM a livello globale e con precisione e fornire alta qualità 3D mapping delle lesioni CCM in cervelli di topo. Questo metodo migliora il valore dei modelli del mouse stabilite per studiare le basi molecolari e le terapie potenziali per CCM e altre malattie cerebrovascolari.
Introduction
CCM sono con pareti sottili, dilatata malformazioni vascolari del cervello con prevalenza fino a 0,5% nella popolazione umana1. CCM può essere ereditato come un disordine dominante dovuta a mutazioni di perdita-de-funzione in uno dei tre geni: CCM1 (aka Krit1), CCM2e CCM3 (chiamato anche PDCD10)2,3,4 ,5,6. Questi geni sono presenti in un unico complesso di segnalazione.
Vari modelli sono stati sviluppati per malattia umana di CCM modello e capire le vie a valle dei geni CCM che sono responsabili per CCM7,8,9,10. Il modello più robusto è condizionalmente eliminare uno qualsiasi dei geni Ccm con tamoxifene-inducibile Cdh5-CreERT2 P1 in cuccioli appena nati8,10. Questi cuccioli sviluppano lesioni CCM nel cervello da P6 in avanti e si pensano che siano un modello ideale per studi pre-clinici nella ricerca dei meccanismi e agenti terapeutici nel trattamento delle malattie CCM.
Carico lesionale CCM nel cervello del topo è stato misurato principalmente di metodi basati su istologia, un approccio che è estremamente che richiede tempo e soggetto a investigatore bias10,11,12. Metodi di base di MRI sono stati utilizzati per valutare il carico lesionale CCM nel topo adulto modello9,13. Tuttavia, per raggiungere una soluzione soddisfacente per l'identificazione delle lesioni CCM è necessaria un strumento MRI piccolo altamente specializzato animale e lunghi tempi di scansione di diverse ore per una notte. Inoltre, se MRI può essere utilizzato per rilevare le lesioni CCM in topi neonatali non è stato segnalato e risoluzione può limitare la sensibilità.
Recentemente abbiamo sviluppato una tecnica di micro-CT per immagine e analizzare CCM lesione14,15. Questo ad alta risoluzione, tempo e conveniente metodo drammaticamente incrementato il valore del modello di malattia CCM in studi meccanicistici e terapeutici. Metodi di colorazione del Monte dimiglioramento, tutta sono stati utilizzati per micro-CT imaging di tessuti molli e del mouse embrioni16,17. In precedenza, abbiamo usato una base di osmio macchiatura per aumentare il contrasto per micro-CT imaging delle lesioni CCM in cervello14. In questa carta, abbiamo usato meno tossico, non-distruttivo, e costo-efficiente reagente, un iodio basato soluzione di Lugol, per migliorare il contrasto per imaging di micro-CT. Lo iodio può diffondersi in tutto il cervello e ha un'alta affinità per sangue18.
Il protocollo dettagliato è presentato qui per l'induzione delle lesioni CCM in un modello murino neonatale con l'imaging e l'analisi delle lesioni CCM con micro-CT di contrasto-basato. Questo metodo di base di micro-CT fornisce una misura quantitativa globale del volume della lesione CCM, individua con precisione il numero e la posizione 3D di CCM lesioni nel cervello del topo e riduce notevolmente il costo e il tempo necessario per il fenotipo di questi animali.
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Protocol
tutti i etica animale e protocolli sono stati approvati dal The Sydney salute distretto Animal Welfare comitato locale e istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) di Tianjin Medical University. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto le linee guida/regolazioni del centenario Institute, Università di Sydney e Università medica di Tianjin
1. Induzione delle malformazioni cavernose cerebrali in modelli murini
- Croce Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl topi con Ccm2 fl/fl per generare cucciolate con Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) cuccioli e controlli littermate (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 e Ccm2 fl/fl animali sono stati descritti in precedenza 19.
- Sciogliere 4HT in etanolo al 100% e conservare a-80 ° C in aliquote di 30 µ l (4HT concentrazione: 10mg/mL). Il giorno di utilizzo, diluire 4HT aliquotati in olio di mais (0,5 mg/mL).
- Intragastrically iniettare 50 µ l di 4HT (0,5 mg/mL) per i cuccioli neonatali alla P1 per indurre lesioni CCM sperimentali utilizzando una siringa da insulina.
2. Preparazione per Micro-TAC del campione
- eutanasia neonatali cuccioli P8 via anidride carbonica asfissia.
- Eseguire perfusione intra-cardiaco inserendo un ago 29 con 3 mL di 2% paraformaldeide in PBS in una siringa da 10 mL nel ventricolo del cuore mouse.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata. - Staccare la testa dal corpo con un paio di forbici. Rimuovere tutta la pelle fuori della testa con un paio di forbici e staccare il cranio usando pinze per sezionare l'intero cervello.
- Prendere immagini del cervello con stereomicroscopio a 7.82 x ingrandimento, 1 x guadagno, gamma 0,6 e tempo di esposizione di 20 ms.
- Fissare i cervelli sezionati con paraformaldeide al 4% in soluzione PBS durante la notte.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata. - Il giorno seguente, staccare hindbrains utilizzando un forcipe e lavare con soluzione PBS.
- Incubare il hindbrains in Lugol ' soluzione di iodio di s per 48 h.
- Dopo l'incubazione, brevemente asciugare all'aria il hindbrains per rimuovere l'eccesso Lugol ' soluzione di iodio di s.
- Pack il Lugol ' iodio s macchiato hindbrains in microcentrifuga 0,65 mL e guarnizione completamente con pellicola di plastica paraffina per evitare il restringimento del tessuto ( Figura 2 A).
- Posto per microcentrifuga in tubi di plastica da 5 mL con spugne per impedirne lo spostamento durante la scansione ( Figura 2 B).
3. Micro-CT Scan del CCM nel cervello del topo
- montare verticalmente il hindbrain imballata in un tubo su un supporto di alluminio nel sistema di micro-CT.
- Impostare i parametri di scansione per 540 proiezioni e 2 tempo di esposizione di s con le condizioni di origine di 50 kV e 10 W per acquisire i dati tomografici (immagine risoluzione 9,5 µm/pixel).
- Radiografie dalla scansione vengono ricostruite automaticamente dal software di ricostruzione di proiezione basati su hardware forniti dal sistema di micro-CT, producendo una serie di immagini di fette assiali 16-bit (" TXM " file).
4. Analisi dei Micro-CT DataSet
- aprire il file di immagine ricostruita (" TXM " file) nel software di analisi 3D e visualizzare il cervello usando il " rendering di volume " funzione.
- Trasformare il hindbrain per l'orientamento desiderato utilizzando la " casella di delimitazione " e " piano di ritaglio " funzioni.
- Ricampionare l'immagine trasformata in modalità estesa e mantenere la dimensione del voxel.
- Crea " modificare nuova etichetta campo " sull'immagine trasformata (4.3) ed evidenziare solo il hindbrain utilizzando la scala di grigi intensità.
- Aggiungere le aree evidenziate ed eseguire " etichetta analisi " per ottenere misurazioni del hindbrain intero (cioè, volume totale e area). Esportare misurazioni in un file Excel.
- Visualizzare il hindbrain utilizzando il " isosurface rendering " funzione.
- Creare un altro " modificare nuova etichetta campo " sulle aree immagine ed evidenziare trasformate con lesioni mediante scala di grigi intensità.
- Aggiungere le aree evidenziate ed eseguire " etichetta " analisi per ottenere misurazioni delle lesioni all'interno del hindbrain (cioè, volume totale e area). Esportare misurazioni in un file Excel.
- Visualizzare le lesioni utilizzando il " generare superficie " e " vista di superficie " funzioni.
- Snapshot le immagini del hindbrain orientamenti desiderata o generare un filmato per la visualizzazione 3D delle lesioni.
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Representative Results
Una singola iniezione di 4HT P1 era sufficiente per indurre le lesioni CCM nel cervelletto. Lugol iodio contrastato micro-CT sufficientemente rilevato lesioni CCM e potrebbe quantificare il volume e il numero. Utilizzando il micro-CT ottimizzato, abbiamo ripreso lesioni CCM in hindbrains di topi Ccm2iECKO . Immagini digitalizzate di raggi x sono stati ricostruiti per produrre immagini 3D del cervello del mouse, che ha permesso la visualizzazione delle lesioni intere nel parenchima del cervello alle diverse profondità e gli orientamenti e valutazione della struttura e la posizione 3-d delle lesioni nel cervello. D'importanza, questo set di dati di immagine può essere utilizzato anche per efficiente e accurata quantificazione della lesione dimensioni e i numeri di lesione.
La figura 1 Mostra riuscita induzione di lesioni CCM nel cervelletto di Ccm2iECKO (B) ma non nei comandi littermate (Ccm2fl/fl), (A) P8.
La figura 2 Mostra un esempio compressi per micro-TAC (A–B), e rappresentante ricostruite immagini dalla micro-TAC di controllo (Ccm2fl/fl) (C) e Ccm2 iECKO (D–E). Figura 2 E' Mostra segnato lesioni in Ccm2iECKO.
La figura 3 Mostra un'immagine di rendering 3D di un cervello Ccm2iECKO con lesioni (A–B). Tabella a lato indica un esempio di output quantitativa delle lesioni individuali con etichettate.
Figura 1 : Induzione delle lesioni CCM nel topo neonatale. Immagini macroscopiche di Ccm2fl/fl (A) e cervello Ccm2iECKO (B) a 8 giorno postnatale. Scala bar (bianco), 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Preparazione del campione e ricostruite immagini 2D. Campione imballato in un tubo del microcentrifuge (A) e 5 mL provette (B). Freccia verde indica il campione. Immagini rappresentative di Ccm2fl/fl (C) e cervelli Ccm2iECKO (D–E). (E') Contrassegnato lesioni nel cervello Ccm2iECKO . Scala bar (bianco), 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Il rendering di immagini 3-d. Immagine del cervello Ccm2iECKO con lesioni (A) e le lesioni di resa unica (B). Le lesioni sono contrassegnate in rosso. Tabella sulla destra mostra un esempio di output qualitativa delle lesioni singolarmente contrassegnate. Scala bar (bianco), 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
CCM è una malformazione vascolare comune che colpisce fino allo 0,5% di individui1. CCM può verificarsi in forma sporadica o familiare. Prognosi paziente spesso non è chiara come le lesioni CCM possono rompersi in modo imprevisto per causare ictus e altre conseguenze neurologiche. Attualmente, l'unica opzione di trattamento è di rimuovere chirurgicamente le lesioni, che sono accompagnate da ad alto rischio.
Condizioni umane CCM recentemente sono state riprodotte in modelli animali di7,8,9,10. Questi modelli forniscono preziosi strumenti per studiare i meccanismi coinvolti nella malattia di CCM. Un metodo di analisi quantitativa, efficiente e accurato vi aiuterà a sfruttare il valore completo di questi modelli.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di micro-CT per le lesioni CCM immagine in modelli murini utilizzando osmio tetraoxide come un agente a contrasto14. Nello studio corrente, abbiamo successivamente usato soluzione di Lugol per migliorare il contrasto del tessuto cerebrale di rilevare le lesioni. Soluzione di Lugol è meno tossico, non-distruttivo e più conveniente rispetto al tetraoxide di osmio. Quindi, i campioni possono essere riutilizzati per altri scopi, come l'istologia dopo la soluzione di Lugol è lavata via.
Il nostro metodo di micro-CT potrebbe produrre sufficiente qualità dell'immagine per rilevare le lesioni CCM nel cervello del topo. La preparazione del campione è semplice e non richiede tecniche altamente specializzate. Questo metodo può fornire proiezioni ad alta definizione con un tempo di scansione di circa un'ora. Combinando i DataSet da micro-TAC e software per l'analisi 3D è un potente mezzo per generare una vista 3D globale delle lesioni CCM nel cervello. La rappresentazione qualitativa e quantitativa delle lesioni relativo Anatomia del cervello è facilmente ottenibile. Rispetto alla ricostruzione 3D basato sull'istologia, il nostro metodo è molto tempo e costi efficaci e produce rappresentazioni 3D molto più precise.
Tuttavia, ci sono anche limitazioni e passaggi critici da considerare. In primo luogo, il metodo richiede un sistema di micro-CT, che è di attrezzature altamente specializzate e non può essere prontamente disponibili. In secondo luogo, la dissezione del cervello neonatale del mouse può essere abbastanza impegnativo a causa della morbidezza e le dimensioni del tessuto cerebrale. È molto importante non danneggiare il cervello durante la dissezione al fine di acquisire misurazioni accurate e la visualizzazione delle lesioni CCM nel cervello. Infine, la preparazione del campione per micro-TAC è fondamentale. Iodio Lugol macchiato cervelli dovrà essere imballato completamente per evitare il restringimento del tessuto a causa dell'evaporazione. Anche, i campioni devono essere collocati in modo sicuro durante la micro-TAC. Qualsiasi movimento durante la scansione altererà la qualità della scansione e quindi la quantificazione e la visualizzazione.
Abbiamo applicato il nostro metodo solo in cervelli di topo neonatale fisso. Tuttavia, questo metodo ha la capacità di essere utilizzato per altri studi condotti su campioni diversi e può servire da strumento eccitante e romanzo per altre ricerche di malformazione vascolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono le strutture e l'assistenza scientifica e tecnica di microscopia del Sydney & microanalisi Research Facility (AMMRF) e il centro australiano per microscopia & microanalisi (ACMM) presso l'Università di Sydney. Questi studi sono stati sostenuti da Australian National Health e il progetto del Consiglio di ricerca medica (NHMRC) concedere 161558 e APP1124011 (XZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
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