Summary
이 프로토콜 대뇌 동굴 같은 기형 질병 마우스 모델에서의 유도 및 고 사용 대비 향상 된 병 변 부담을 측정 하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영. 이 방법은 분자 기초 및 대뇌 동굴 같은 기형에 대 한 잠재적인 치료 및 기타 뇌혈관 질병 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.
Abstract
돌연변이 CCM1 (일명 KRIT1), CCM2, 또는 CCM3 (일명 PDCD10) 유전자는 인간의 대뇌 동굴 같은 기형 (CCM) 일으킬. CCM 질병 마우스 모델 출생 후 동물에서 Ccm 유전자의 tamoxifen 유도 삭제에 의해 설립 되었습니다. 이 마우스 모델 분자 메커니즘 및 CCM 질병에 대 한 치료 접근을 조사 하는 귀중 한 도구를 제공 합니다. 병 변 및 진행을 평가 하는 정확 하 고 양적 방법 이러한 동물 모델의 전체 가치를 활용 하기 위해 필수적 이다. 여기, CCM 질병 마우스 모델에서의 유도 시연 하 고 대비를 사용 하 여 향상 된 마우스 두뇌에서 측정 CCM 병 변 부담 x 선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 메서드. 출생 후 하루 1 (P1), 우리 다니엘 Ccm2의 floxed 대립 유전자를 Cdh5 CreErt2 transgene에서 Cre recombinase 활동을 활성화 하기 위해 4-hydroxytamoxifen (4HT) 사용. 마우스 두뇌 병 변 CCM P8에 분석 되었다. 마이크로-CT, 뇌 조직에 대비 향상을 기반으로 하는 요오드는 Lugol의 솔루션 사용 되었습니다. 우리는 검색 매개 변수를 최적화 하 고 이어질 약 25 µ m의 최소 기능 크기 9.5 µ m의 복 치수를 활용. 이 해결책은 세계적으로 그리고 정확 하 게, CCM 병 변 볼륨 및 수를 측정 하 여 마우스 두뇌 병 변 CCM의 높은-품질 3 차원 매핑을 제공 충분 합니다. 이 메서드는 CCM 및 기타 뇌혈관 질환에 대 한 분자 및 잠재적인 치료 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.
Introduction
CCM는 얇은 벽으로, 뇌의 혈관 기형 인간의 인구1에서 최대 0.5%의 보급으로 크기. CCM 3 개의 유전자 중 하나에 손실의 기능 돌연변이 때문에 지배적인 무질서로 상속 될 수 있습니다: CCM1 (일명 Krit1), CCM2및 CCM3 ( PDCD10라고도 함)2,3,4 ,,56. 이 유전자는 복잡 한 신호에 존재 하는.
CCM7,8,,910에 대 한 책임은 CCM 유전자의 다운스트림 경로 이해 하 고 모델 인간의 CCM 질병에 다양 한 모델 개발 되었습니다. 가장 강력한 모델 조건부로 신생아 강아지8,10p 1에서 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cdh5 CreERT2 와 함께 Ccm 유전자 중 하나를 삭제 하는 것입니다. 이 새끼는 이후 P6에서 뇌 병 변 CCM을 개발 하 고 검색 메커니즘에 대 한 전 임상 연구 및 치료제 CCM 질병 치료에 대 한 이상적인 모델이 될 것으로 예상 된다.
쥐의 뇌에서 CCM 병 변 부담 조직학 기반 방법, 매우 시간이 걸리는 하는 방식으로 주로 측정 되었다 하 고 조사에 따라 바이어스10,,1112. MRI 기반 방법 성인 마우스 모델9,13CCM 병 변 부담을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나, 고도로 전문화 된 작은 동물 MRI 계기와 하룻밤 몇 시간의 긴 검색 시간 CCM 병 변 식별에 만족 스러운 해결책을 달성 하기 위해 필요 합니다. 또한, 여부 MRI 신생아 쥐에 있는 CCM 장애 감지를 사용할 수 있는 보고 하지 않은 고 해상도 감도 제한할 수 있습니다.
우리는 최근 이미지 CCM 병 변14,15를 분석 하는 마이크로-CT 기술 개발. 이 고해상도, 시간 및 비용 효율적인 방법을 극적으로 증가 기계 및 치료 연구에 CCM 질병 모델의 값. 대비 향상, 전체 마운트 착 방법 부드러운 조직 및 마우스 배아16,17의 마이크로-CT 영상에 대 한 사용 되었습니다. 이전에 우리는 오스뮴 기반 얼룩을 사용 뇌14병 변 CCM의 마이크로-CT 영상에 대 한 대비 향상. 이 문서에서 우리는 더 적은 독성, 비-파괴적인, 사용 하 고 비용 효율적인 시는 요오드 기반 Lugol의 솔루션, 마이크로-CT 영상에 대 한 대비를 강화 하. 요오드 두뇌에 걸쳐 확산 수 있으며 혈18에 대 한 높은 선호도 있습니다.
자세한 프로토콜은 여기는 이미징 함께 신생아 마우스 모델에서 CCM 변의 유도 및 발표 대비 기반 마이크로 중부와 CCM 장애의 분석 이 마이크로-CT 기반된 메서드 CCM 병 변 양의 양적 글로벌 측정, 수와 쥐의 뇌 병 변 CCM의 3 차원 위치를 정확 하 게 식별 하며 비용을 크게 줄일 수와 시간 표현 형이이 동물 있어야 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 윤리 및 프로토콜 시드니 지역 건강 지구 동물 복지 위원회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 천진 의과대학의에 의해 승인 했다. 모든 실험 100 주년 연구소, 시드니 대학, 천진 의과대학의 지침/규정에 따라 실시 했다
1. 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 유도
- 크로스 Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/플로리다 Ccm2 fl/플로리다와 새끼를 생성 하와 쥐 Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/플로리다 (Ccm2 iECKO) 새끼 및 littermate 컨트롤 (Ccm2 fl/플로리다). Cdh5-CreErt2 및 Ccm2 fl/플로리다 동물 앞에서 설명한 19 되었습니다.
- 4HT 100% 에탄올에 녹이 고 30 µ L의 aliquots에서-80 ° C에서 저장 (4HT 농도: 10 mg/mL). 사용 당일, 옥수수 오일 (0.5 mg/mL)에서 aliquoted 4HT 희석.
- Intragastrically 4HT의 50 µ L를 주사 (0.5 mg/mL)는 인슐린 주사기를 사용 하 여 실험 CCM 장애를 유도 하는 p 1에서 신생아 강아지를.
2. 마이크로-CT 검사에 대 한 준비를 샘플
- 이산화탄소 질 식 통해 P8에 신생아 강아지를 안락사.
- 마우스 심장의 심 실에 10 mL 주사기에 PBS에 2% paraformaldehyde 3 mL와 29 게이지 바늘을 삽입 하 여 내 심장 관류 수행.
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 착용. - 는가 위를 사용 하 여 본문에서 머리를 분리 합니다. 머리는 위를 사용 하 여 모든 피부를 제거 하 고 껍질 전체 뇌 해 부를 집게를 사용 하 여 두개골을.
- Stereomicroscope와 두뇌의 확대, 1 x 이득, 0.6, 감마와 20 ms 노출 시간 x 7.82에서 촬영할.
- 해결 해 부 두뇌 PBS 솔루션에서 4 %paraformaldehyde 하룻밤.
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 착용. - 다음 날에는 집게를 사용 하 여 hindbrains를 분리 하 고 PBS 솔루션 세척.
- Lugol에 hindbrains를 품 어 ' 48 h. s 요오드 솔루션
- 인큐베이션, 다음 짧게 공기 건조 초과 Lugol 제거 하려면 hindbrains ' s 요오드 솔루션.
- 는 Lugol 팩 ' s 요오드 스테인드 0.65 mL microcentrifuge 튜브에 조직을 수축 ( 그림 2 A)를 피하기 위해 플라스틱 파라핀 영화와 완전히 물개 hindbrains.
- 스캔 ( 그림 2 B) 동안 이동에서 그들을 방지 하기 위해 스폰지와 함께 5 mL 플라스틱 튜브에서 microcentrifuge 튜브 장소.
3. 쥐의 뇌에서 CCM 마이크로-CT 스캔
- 수직 마이크로 CT 시스템에서 알루미늄 홀더에 튜브에 포장 hindbrain 탑재.
- 540 투영 및 50의 소스 상태 2 s 노출 시간에 검색 매개 변수를 설정할 단층 데이터 집합 (이미지 해상도 9.5 μ m/픽셀)을 얻으려고 kV 및 10 W.
- 검사에서 검사는 재건축 자동으로 하드웨어 기반 투영 재구성 소프트웨어 마이크로 CT 시스템을 제공한 16-비트 축 조각의 이미지 시리즈 생산 (" TXM " 파일).
4. 마이크로-CT 데이터 집합의 분석
- 복원된 이미지 파일 (" TXM " 파일) 3 차원 분석 소프트웨어에서 두뇌를 사용 하 여 시각화는 " 볼륨 렌더링 " 함수.
- 변환 사용 하 여 원하는 방향 hindbrain는 " 경계 상자 " 및 " 클리핑 평면 " 기능.
- 확장된 모드에서 변환 된 이미지를 다시 샘플링 하 고 복 크기 보존.
- 만들기 " 새 레이블 필드 편집 " 변환 된 이미지 (4.3)에 hindbrain 스케일 강도 사용 하 여 강조.
- 강조 표시 된 영역을 추가 하 고 실행 " 분석 라벨 " 전체 hindbrain (즉, 전체 볼륨 및 지역)의 측정을 얻을. 측정 Excel 파일로 내보내기.
- Hindbrain를 사용 하 여 시각화는 " isosurface 렌더링 " 함수.
- 다른 만드는 " 새로운 레이블 필드 편집 " 병 변과 스케일 강도 사용 하 여 변환 된 이미지와 하이라이트 영역에.
- 강조 표시 된 영역을 추가 하 고 실행 " 레이블 " hindbrain (즉, 전체 볼륨 및 지역) 내에서 장애의 측정을 얻기 위해 분석. 측정 Excel 파일로 내보내기.
- 시각화를 사용 하 여 병 변은 " 표면 생성 " 및 " 보기 표면 " 기능.
- Hindbrain 원하는 방향에서의 이미지를 스냅숏 또는 생성 하는 장애의 3 차원 시각화를 위한 영화.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P 1에서 4HT의 단일 주사 소 뇌 병 변 CCM을 유도 하기 충분 했다. Lugol의 요오드 화물 대조 마이크로-CT는 충분히 CCM 장애를 감지 하 고 그것의 양 및 수 정할 수 있습니다. 최적화 된 마이크로-CT를 활용 하 여, 우리 Ccm2iECKO 쥐의 hindbrains 병 변 CCM을 몇 군데. 검사 x-레이 이미지 생산 다른 깊이 방향에 뇌 실질에 전체 장애의 시각화를 허용, 마우스 뇌의 3 차원 이미지 평가의 구조와 병 변 두뇌에서의 3 차원 위치를 재건 했다. 중요 한 것은,이 이미지 데이터 집합 병 변의 크기와 병 변 숫자의 효율적이 고 정확한 정량화에 대 한 또한 사용할 수 있습니다.
그림 1 에서는 CCM 변의 성공적인 유도 Ccm2iECKO (B)의 소 뇌 P8에 littermate 컨트롤 (Ccm2fl/플로리다) (A)에.
그림 2 는 마이크로-ct (BA-), 대 한 포장된 샘플 하 고 재구성 하는 대표 이미지 컨트롤의 마이크로-CT 스캔에서 (Ccm2fl/플로리다) (C) 및 Ccm2 iECKO (ED-). 그림 2 E' Ccm2iECKO병 변 표시 보여줍니다.
그림 3 Ccm2iECKO 뇌 병 변 (A-B)로 렌더링된 3 차원 이미지를 보여준다. 인접 한 테이블 표시 개별 장애의 정량적 출력의 예를 보여 줍니다.
그림 1 : CCM 변의 신생아 마우스에서 유도. Ccm2fl/플로리다 (A)와 산 후 주 8에서 Ccm2iECKO (B) 두뇌의 거시적인 이미지. 바 (흰색), 5. 규모 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 샘플 준비와 2D 이미지 재건. 샘플 튜브 (B)는 microcentrifuge (A)와 5 mL 포장. 녹색 화살표는 샘플을 보여 줍니다. Ccm2fl/플로리다 (C)와 Ccm2iECKO (D-E) 두뇌의 대표 이미지. (E') Ccm2iECKO 두뇌에서 표시 된 병 변. 스케일 바 (흰색), 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 3 차원 이미지를 렌더링. Ccm2iECKO 뇌 병 변 (A) 및 병 변의 이미지 렌더링만 (B). 병 변은 빨간색으로 표시 됩니다. 테이블 오른쪽에 개별적으로 표시 된 병 변의 질적 출력의 예를 보여 줍니다. 스케일 바 (흰색), 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CCM은 개인1의 0.5%까지 영향을 미치는 일반적인 혈관 기형입니다. CCM 산발적 또는 가족 형태로 발생할 수 있습니다. 환자 예 후 명확 하지 않습니다 종종 CCM 병 변 원인 뇌졸중 및 기타 신경학 상 결과 예기치 않게 파열 수로. 현재 유일한 치료 옵션은 높은 위험을 동반 하는 병 변 수술로 제거 하는.
인간의 CCM 조건에 재현 되어 최근 동물 모델7,8,,910. 이러한 모델 메커니즘 CCM 질병에 관련 된 조사를 귀중 한 도구를 제공 합니다. 효율적이 고 정확한 양적 분석 방법은 이러한 모델의 전체 가치를 활용 하는 데 도움이 됩니다.
최근 이미지 CCM 병 변14대조 대리인 오스뮴 tetraoxide를 사용 하 여 마우스 모델에서 마이크로-CT 방법을 개발 했습니다. 현재 연구에서 뇌 조직의 병 변 검출을 대비 향상을 Lugol의 요오드 화물 해결책을 사용 이후 했습니다. Lugol의 요오드 화물 해결책은 덜 독성, 비-파괴적인, 그리고 싼 오스뮴 tetraoxide에 비해. 따라서, 샘플 조직학 Lugol의 요오드 화물 해결책은 씻은 후 등 다른 용도로 활용할 수 있습니다.
우리의 마이크로 CT 메서드는 CCM 병 변 쥐의 뇌에서 감지 하 충분 한 이미지 품질을 생산할 수 있습니다. 샘플 준비는 간단 하 고 고도의 전문된 기술이 필요로 하지 않습니다. 이 방법은 검색 시간으로 1 시간 거리의 고해상도 예측을 제공할 수 있습니다. 마이크로-CT 검사 및 3 차원 분석 소프트웨어에서 데이터 집합을 결합 하 여 뇌에 CCM 변의 3 차원 지구 보기를 생성 하는 강력한 방법입니다. 뇌 해부학을 기준으로 장애의 양적 및 질적 표현 쉽게 이루어집니다. 조직학 기반 3 차원 재구성에 비해, 우리의 방법은 매우 시간-고 비용-effective 이며 훨씬 더 정확한 3d 표현을 생성.
그러나, 또한 있다 제한 및 고려해 야 할 중요 한 단계. 첫째, 메서드는 마이크로-CT 시스템을 고도로 전문화 된 장비 이며 쉽게 사용할 수 있습니다 되지 않을 수 있습니다 필요 합니다. 둘째, 신생아 쥐의 뇌를 해 부 부드러움과 뇌 조직의 크기 때문에 매우 도전 수. 있습니다 그것은 매우 정확한 측정 및 CCM 병 변 두뇌에서의 시각화를 습득 하기 위해 절 개 하는 동안 두뇌를 손상 중요 하지 않습니다. 마지막으로, 마이크로-CT 검사를 위한 샘플 준비가 중요 합니다. Lugol의 요오드 스테인드 두뇌 조직 수축 때문에 증발을 피하기 위해 완전히 포장 해야 합니다. 또한, 샘플 마이크로 CT 스캔 하는 동안 안전 하 게 배치 되어야 합니다. 스캔 하는 동안 어떤 운동 든 지 스캔의 품질을 바꿀 것 이다 그러므로 정량화 및 시각화.
우리는 우리의 방법은 고정된 신생아 마우스 두뇌에만 적용 했습니다. 그러나,이 방법은 다른 샘플을 포함 하는 다른 연구에 사용할 수 있으며 다른 혈관 기형 연구에 대 한 흥미롭고 새로운 도구가 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 인정 시설 및 현미경 검사 법 및 시드니의 대학에 Microanalysis (ACMM)에 대 한 시드니 현미경 및 Microanalysis 연구 시설 (AMMRF)와 호주 중심의 과학 및 기술 지원. 이러한 연구는 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트는 161558 및 APP1124011 (XZ)를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
