Summary
本文对小鼠主动脉球囊损伤后 myointimal 增生 (MH) 的发育进行了研究。
Abstract
使用动物模型对更好地了解 MH 是至关重要的, 这是动脉狭窄的主要原因之一。在这篇文章中, 我们演示了一个小鼠气球剥脱模型, 这是与建立在大型动物的血管损伤模型比较。主动脉剥脱模型与球囊导管模拟临床设置, 并导致可比病理和生理变化。简单地, 在主动脉紫癜中进行水平切口后, 气球导管将插入容器中, 充气, 并引入逆行。气球的膨胀会导致血管内膜损伤和 overdistension。取出导管后, 主动脉切口将与单拆线闭合。本文所介绍的模型重现性好, 易于执行, 且能快速可靠地建立。它特别适用于评价昂贵的实验性治疗剂, 可以在经济的方式应用。利用不同的击倒-小鼠菌株, 可以评估不同基因对 MH 发育的影响。
Introduction
冠状动脉和外周动脉狭窄对患者的发病率和死亡率有很大的影响1。一个潜在的病理机制是 myointima 增生 (MH), 其特点是增加增殖, 迁移, 并合成细胞外基质蛋白从血管平滑肌细胞 (SMC)2。SMC 位于容器的介质层, 并在对腔表面进行刺激后迁移。刺激信号包括生长因子、细胞因子、细胞接触、脂质、细胞外基质成分、机械剪切和拉伸力3、4、5、6。血管壁损伤, 病理或医源性, 导致内皮细胞和平滑肌细胞损伤, 刺激炎症反应, 从而导致 MH7。
目前有不同的动物模型可用于研究动脉损伤和 myointima 增生。像猪或狗这样的大型动物, 具有与人类分享相似的动脉和冠状动脉解剖的优势, 特别适合研究血管成形技术、过程和设备的调查8。然而, 猪模型有更高的缺点血栓9,10, 而狗只对船只伤害有轻微的反应11。此外, 所有大型动物模型都需要特殊的住房、设备和工作人员, 这些都与高昂的费用联系在一起, 而且并不总是在一个机构中提供。小动物模型包括老鼠和老鼠。与大鼠相比, 小鼠具有成本低且存在各种敲出模型的优点。本视频中描述的模型可以与以西方饮食喂养的载脂蛋白小鼠相结合, 以密切模仿动脉粥样硬化血管成形术的临床设置12。既往模型通过钢丝损伤诱发血管损伤13, 液体脱水的14, 春季15, 或袖扣伤16。由于损伤的性质将极大地影响 MH 的发展和构成, 使用气囊导管诱导血管损伤是模拟临床环境的最佳方法。
本文介绍了一种用气囊导管诱导小鼠 MH 的新方法。使用带 RX 端口 (图 1A) 的气囊导管 (1.2 mm x 6 mm) 可使内膜层的刮擦, 同时还能诱导血管的 overdistension。这两个因素都是 MH 发展的重要诱因。此模型的观察时间为28天17。
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Protocol
动物接受了人道护理, 符合《实验室动物原则指南》, 由实验室动物资源研究所编写, 并由国家卫生研究所出版。所有动物协议由负责任的地方当局批准 ("Amt Gesundheit 和 Verbraucherschutz, Hansestadt (办公室为健康和消费者保护) 汉堡")。
1. 导管制备
注: 有关导管的信息, 请参阅材料表。
- 从导管架上取导管。
- 将丝从管腔中通过远端端口拉出。
- 在导管远端放置一滴氰胶。
注意: 戴上乳胶或腈手套。 - 将丝置于导管的 RX 口, 并将其通过管腔推进至远端端口。之后, 把丝向后轻轻地留出一个5毫米的空间到最后。
- 等待5分钟, 使胶粘剂干燥。
- 移动丝, 它应该是固定的。如果它仍然是移动的, 重复步骤 1.3-1.6。
- 用1.5 毫升0.9% 盐水填充3毫升注射器, 并将其连接到气球充气端口。
- 推动注射器柱塞测试气球膨胀。在注射器里留下0.6 毫升盐水
2. 鼠标准备
- 在14周的年龄获得雄性小鼠, 体重约30克。
注: 我们用动物实验动物研究所获得。我们在这里用 C57BL/6J - 使用诱导室麻醉 2.0-2.5% isofurane (500 毫升/分钟氧气流量) 的鼠标。
- 将鼠标放在加热垫上, 并用口罩覆盖鼠标的嘴和鼻子来维持麻醉。通过捏后腿和尾部检查是否有足够的麻醉深度, 以验证是否没有反应。
- 用理发剪掉腹部的毛发。
- 伸展后腿, 用胶带固定好自己的位置。
- 用聚维酮碘消毒腹部面积, 其次为80% 乙醇。重复此步骤两次。
- 使用手术的悬垂, 以确保外科网站不会受到污染。打开皮肤和肌肉层沿式阿尔巴与剪刀 (或手术刀), 以揭露腹部器官。
- 放置在0.9% 盐水滋润手套和包装的肠道, 以保持他们的湿润。
- 用两个好的镊子来除去腹主动脉上方的脂肪组织。
- 使用胰岛素注射器 (30G), 注入250µL 肝素溶液 (50 U/毫升) 进入下腔静脉 (下静脉) 和等待3分钟, 其系统性分布。肝素在手术中会抑制止血, 防止不受欢迎的凝血。
- 使用两个镊子, 解剖下主动脉下到它的分岔和其传出分支血管。
- 结扎的侧血管, 预计将放置在固定的地区, 与高温 cauterizer。
- 通过在肾动脉下直接夹紧下主动脉来阻止血液流动。
- 在主动脉分岔的远端位置放置第二夹钳。
- 用剪刀在容器的夹钳中点进行一个小的水平切口。
注: 切口尺寸应相当于容器周长的1/3。 - 将注射器与 (30G) 针插入切口, 用250µL 肝素溶液冲洗主动脉 (50 U/毫升)。
- 使用10-0 缝线, 在切口的两侧放置一个单一的结。
- 通过将血管扩张插入切口并略微展开血管来扩张主动脉。重复扩张2到3次。
- 用0.9% 盐水滋润气囊导管。
- 将扁平气囊导管插入主动脉, 向主动脉上的近端钳推进。
- 当到达近端钳, 小心打开近端钳和充气气球, 以防止血液泄漏, 通过注射〜0.6 毫升盐水。
注: 充气气球与容器的比例为 1.5: 1。 - 推进导管逆行约2厘米。
- 将膨胀的导管拉回, 同时通过释放注射器使气球略微收缩。
- 当导管到达主动脉切口时, 重新连接近端钳。将气球完全放气并将其取出。
- 使用30G 注射器冲洗主动脉与250µL 肝素溶液 (50 U/毫升)。
- 用10-0 缝合线关闭主动脉切口。在每个侧面的地方间断针, 其次是一个或两个针在腹侧。
- 打开远端钳。在出血的情况下, 再次关闭钳, 并放置额外的针。
- 仔细打开近端钳。
- 将两个拭子放在缝合线上以支持它并止血。
- 将可吸收止血放在缝合线上以维持它。
注: 从切口远端可见主动脉搏动。 - 把肠子放回腹部
- 用无菌0.9% 盐水冲洗腹腔, 已预热至37° c。
- 关闭腹部肌肉层使用6-0 运行缝合线。
- 关闭皮肤与5-0 运行缝合线。
- 注射4-5 毫克/千克卡洛芬皮下, 让鼠标醒来。监测动物, 直到它已经获得意识, 保持胸骨卧床。把动物单独关在笼子里, 直到完全恢复。
- 添加乃到饮用水 (50 mg/100 毫升) 作为止痛药3天, 并监测动物的日常。通常老鼠喜欢甜味的乃, 并在手术后立即开始饮用。如果首选, 可持续释放的注射剂可以使用, 而不是乃。
注: 该模型的观察期为28天。
3. 组织病理学
- 28天后, 通过准备步骤2.2 到2.9 中描述的小鼠来收获气球损伤的主动脉。
- 使用剪刀去除气球受伤的主动脉 (在分岔和0.3 毫米之间的肾血管) 和安乐的老鼠通过切割出它的心脏。
- 用0.9% 氯化钠冲洗容器的流明。
- 在4% 甲醛 (粉煤灰) 过夜和脱水它在增加乙醇浓度, 从70% 乙醇为2小时, 80% 乙醇为1小时, 95% 乙醇为2小时, 100% 乙醇为5小时。然后, 在二甲苯中孵育样品2小时3次, 然后用石蜡浸润样品。
注: 与其用0.9% 氯化钠冲洗收获的容器, 倒不如用4% 的煤灰冲水。
注意: 粉煤灰和二甲苯是有毒的, 应特别小心处理。 - 将样品嵌入石蜡切片, 用切片切割成5µm 厚度的薄片。
- 用二甲苯 Deparaffinize 3 次, 5 分钟。
- 用减少的乙醇系列水化组织切片。开始与100% 乙醇2次5分钟, 其次是3分钟的 95%, 80% 和70% 乙醇。
- 用马尾松的三染色对幻灯片进行着色, 如18所述。
- 脱水染色幻灯片100% 乙醇2次, 每10分钟。用二甲苯清除2次, 每次10分钟, 装入安装介质。
- 用明亮的野外显微镜查看幻灯片。使用一个5x 放大倍数的镜头和一个数字孔径为0.12 的概述图片或一个镜头与20x 放大的数字孔径为 0.35, 详细观察。
4. 免疫荧光显微镜
- 用减少的乙醇系列水化组织切片。开始与100% 乙醇2次5分钟, 其次是3分钟的 95%, 80% 和70% 乙醇。
- 在20分钟的蒸笼中, 通过加热抗原检索溶液中的玻片来进行抗原检索。
- 让幻灯片冷却到室温。
- 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗三次后, 在切片上应用抗原阻滞溶液30分钟。
- 冲洗幻灯片三次, 5 分钟与 PBS。
- 在初级抗体稀释剂中稀释初级抗体的孵育部分。
注意: 每种抗体应分别选择合适的浓度和孵育时间。 - 清洗幻灯片三次, 5 分钟与 PBS, 以消除未绑定的抗体。
- 在二次抗体稀释剂中稀释的预共轭二级抗体孵育部分。
注意: 每种抗体应分别选择合适的浓度和孵育时间。 - 通过冲洗5分钟三次的幻灯片来去除未绑定的抗体。
- Counterstain 细胞核使用 4 ', 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 15 分钟;最后的 DAPI 浓度应为 350 nM。
- 在免疫荧光兼容安装解决方案中安装幻灯片。
注: 使用错误的安装解决方案可以掩盖荧光信号。 - 用荧光显微镜查看幻灯片。使用一个数字光圈为1.3 的40x 放大镜头。
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Representative Results
球囊剥脱是研究小鼠 MH 发育的一个合适的模型。动物从手术中恢复良好, 并显示出良好的身体状况后手术。我们在50只小鼠中建立了这个模型, 由于手术的原因, 死亡率不到3%。图 1B-c显示关键的手术步骤。沿式阿尔巴进行皮肤切口后, 确定主动脉紫癜。放置显微外科钳 (图 1B)。做一个小切口在中间的主动脉, 设置一个气囊导管, 并滑动它逆行, 反对血流的方向 (图 1C)。充气气球的运动导致内膜的刮擦, 同时 overdistension 血管。主动脉切口将封闭, 单拆线。从切口远端可见主动脉搏动。
随着时间的推移, MH 在嫁接中逐步发展。组织学染色与马尾松的三显示 myointima 形成内部弹性叶片 (图 2A)。Myointimal 病变主要包括细胞成分阳性的 SM22 和一些细胞外基质组件 (图 2B)。用免疫荧光染色法进一步评价 Myointimal 细胞。myointima 的主要种群包括平滑肌 (平滑肌肌动蛋白 (SMA) 阳性) 细胞和肌 (即成纤维细胞活化蛋白质 (FAP) 阳性) 细胞 (图 2B)。
图1。导管及其植入示意图(A)导管详细示意图。远端端口、气球、快速交换端口 (rx 端口)、丝、单腔至 rx 端口、双流明从 rx 端口到气球、轮毂、气球充气端口。(B)外科手术的示意图。主动脉紫癜的血流通过两个微钳停止, 并进行小切口。在主动脉紫癜内充气导管。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。内部弹性层内 Myointima 形成。(a)在三染色中, 剥去老鼠脉, 石蜡镶嵌, 并有代表性的横断面。(B)显示气球裸露主动的双免疫荧光染色。上排描述 myointimal 病变染色 SM22 和胶原 III。在底部的行列, 船舶染色 SMA 和 FAP。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文介绍了小鼠模型研究 myointimal 增生的发展, 并允许探索的基础病理过程和测试新药或治疗方案。
该协议最关键的步骤是主动脉的剥蚀。在这一步中应特别注意, 过度的剥蚀会导致动脉瘤形成和模型衰竭。另一方面, 如果剥蚀的执行不够, 太少的 myointima 将发展。因此, 剥蚀台阶的强度对该动物模型的结果和成功至关重要。
关于外科手术, 这是至关重要的两个壁的船只没有刺穿通过设置拆线, 这可能导致早期失败的船只通畅。我们以前描述了一个小鼠模型, 我们在其中诱导血管狭窄在腹主动脉18。然而, 这和多数其他模型只提供非常少量组织为分析。这种方法的优点是获得的组织数量比较大 (约1厘米的血管段)。单血管移植可分为多个部分, 用于各种分析, 有效减少实验动物所需的数量。
此外, 适宜的敲出动物可用于研究不同疾病条件下 myointima 增生的发展。遗传背景也可以结合这种动物模型, 以了解 myointimal 增生的机制, 在不同的设置或某些基因的影响。
总之, 本文所描述的模型具有重现性, 易于执行, 并且可以快速可靠地建立。在大型动物模型19中可以进一步确认此模型中成功测试的治疗选项。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢克里斯蒂娜 Pahrmann 的技术援助。
. 得到了最大凯基金会的支持。李政道获得了其他 kr 基金会 (2012_EKES 04) 和德意志 Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1 _。从德意志 Forschungsgemeinschaft (DFG) 获得了研究补助金;SCHR992/3-1, SCHR992/4-1)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 3 mL Syringe | BD Medical | 309658 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Antigen retrieval solution | Dako | S1699 | |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| C57BL/6J | Charles River | Stock number 000664 | |
| Clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | JAW DIMS: 4 x 0.75 mm LENGTH: 13 mm |
| Collagen 3 | abcam | ab7778 | Antibody |
| DAPI | Thermo Fischer | D1306 | |
| Donkey anti-Goat IgG AF555 | Invitrogen | A21432 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A21206 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A11055 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF555 | Invitrogen | A31572 | Secondary antibody |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| FAP | abcam | ab28246 | Antibody |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Heparin | Rotexmedica | PZN 3862340 | 25.000 I.E./mL |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| Image-iT FX Signal Enhancer | Invitrogen | I36933 | Blocking solution |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4mm |
| MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange | Abbott | 1012268-06U | |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| NaCl 0,9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| PBS pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Prolong Gold Mounting solution | Thermo Fischer | P36930 | Mounting solution for immunofluorescence stained slides |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Resorcin-Fuchsin Weigert | Waldeck | 2E-30 | Trichrome staining |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Scissors Vannas-style | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| Fast acting Adhesive MINIS 3x1g | UHU | 45370 | Cyanoacrylate |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| SM22 | abcam | ab10135 | Antibody |
| SMA | abcam | ab21027 | Antibody |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Tabotamp fibrillar | Ethicon | 431962 | Absorbable hemostat |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| U-100 Insulin syringe | BD Medical | 324825 | |
| Vessel Dilator | Fine Science Tools | 18603-14 | |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 |
References
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