Summary
Este artigo demonstra um modelo murino para estudar o desenvolvimento de hiperplasia myointimal (MH) após lesão aórtica balão.
Abstract
O uso de modelos animais é essencial para uma melhor compreensão do MH, uma das principais causas de estenose arterial. Neste artigo, vamos demonstrar um modelo de denudação murino de balão, que é comparável com os modelos de lesão navio estabelecido em animais de grandes porte. O modelo de desnudamento de aorta com cateteres balão imita o ambiente clínico e leva a mudanças fisiológicas e pathobiological comparáveis. Brevemente, após a realização de uma incisão horizontal na aorta abdominalis, um cateter balão será inserido dentro do vaso sanguíneo, inflado e introduziu retrogradely. Inflação do balão vai levar a lesão da íntima e hiperdistensão do navio. Depois de retirar o cateter, a incisão da aorta será fechada com pontos simples. O modelo mostrado neste artigo é reprodutível, fácil de realizar e pode ser estabelecida de forma rápida e confiável. É especialmente apropriado para avaliar caros agentes terapêuticos experimentais, que podem ser aplicados de forma econômica. Usando diferentes cepas de mata-mata-rato, pode ser avaliado o impacto de diferentes genes no desenvolvimento do MH.
Introduction
Estenose arterial nas artérias coronárias e periféricas tem um grande efeito sobre a morbidade e mortalidade de pacientes1. Um mecanismo patológico subjacente é hiperplasia myointima (MH), que é caracterizada pelo aumento da proliferação, migração e síntese de proteínas da matriz extracelular do músculo liso vascular células (SMC)2. SMC estão localizados na camada de mídia do navio e migrar a estimulação para a superfície do lúmen. Sinais estimulatórios incluem fatores de crescimento, citocinas, contato célula-célula, lipídeos, componentes de matriz extracelular e cisalhamento mecânico e estendem as forças3,4,5,6. Lesões da parede do vaso, patológica ou iatrogênica, causam células endoteliais e danos nas células musculares lisas e estimulam reações inflamatórias e assim levam a MH7.
Diferentes modelos animais estão atualmente disponíveis para estudar a lesão arterial e hiperplasia myointima. Grandes animais como porcos ou cães têm a vantagem de compartilhar uma artéria semelhante e anatomia coronariana com seres humanos e são especialmente adequados para estudos investigando angioplastia dispositivos, procedimento e técnicas8. No entanto, modelos de porco têm a desvantagem da maior trombogenicidade9,10, enquanto os cães só têm uma resposta suave ao navio lesão11. Além disso, todos os grandes modelos animais exigem especial habitação, equipamentos e funcionários, que estão conectados com custos elevados e não estão sempre disponíveis na instituição. Pequenos modelos animais incluem ratos e camundongos. Em comparação com ratos, os ratos têm as vantagens de custo mais baixo e a existência de uma variedade de nocaute do modelos. O modelo descrito neste vídeo pode ser combinado com ApoE-/-os ratos alimentados com uma dieta ocidental pròxima imitar o ambiente clínico de angioplastia em vasos aterosclerótica12. Modelos anteriores induzido por lesão vascular via fio lesão13, fluido dessecação14, Primavera15ou de lesão do manguito16. Desde que a natureza da lesão afetará grandemente o desenvolvimento e a constituição de MH, utilizar um cateter balão para induzir lesões no vaso é a melhor maneira para imitar o ambiente clínico.
Neste artigo nós descrevemos um método novo para induzir MH com um cateter de balão em camundongos. O uso de um cateter balão (1,2 x 6 mm) com um RX-Port (figura 1A) permite a raspagem da camada da íntima e, ao mesmo tempo, a indução de uma hiperdistensão do navio. Ambos esses fatores são gatilhos importantes para o desenvolvimento do MH. O tempo de observação para este modelo é de 28 dias17.
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Protocol
Os animais receberam atendimento humano em conformidade com o guia para os princípios de animais de laboratório, preparado pelo Instituto de recursos animais de laboratório e publicado pela National Institutes of Health. Todos os protocolos de animais foram aprovados pela autoridade local competente (' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, (serviço de saúde e defesa do consumidor) de Hansestadt Hamburg ').
1. cateter preparação
Nota: Consulte a Tabela de materiais , para obter informações sobre o cateter.
- Retire o cateter o titular do cateter.
- Puxe o fio-guia do lúmen através do orifício distal para fora.
- Colocar em uma gota de adesivo de cianoacrilato na extremidade distal do cateter.
Cuidado: Use luvas de látex ou nitrilo. - Coloque o fio-guia na porta RX do cateter e avançá-lo através do lúmen para o porto distal. Depois, puxe o fio-guia ligeiramente para deixar um espaço de ~ 5 mm até o fim.
- Espere 5 minutos para permitir que o adesivo secar.
- Mover o fio-guia, deve ser fixado. Se é ainda móvel, repita os passos 1.3-1.6.
- Encher uma seringa de 3 mL com soro fisiológico a 0,9% 1,5 mL e conectá-lo à porta de insuflação do balão.
- Empurre o êmbolo da seringa para teste de insuflação do balão. Deixe 0,6 mL de soro fisiológico na seringa.
2. preparação do rato
- Obter camundongos machos na idade de 14 semanas, pesando aproximadamente 30 g.
Nota: Usamos animais obtidos a partir do Instituto de animais de laboratório. Aqui usamos C57BL/6J. - Use uma câmara de indução para anestesiar o mouse com isofurane de 2.0-2.5% (taxa de fluxo de oxigênio de 500 mL/min).
- Coloque o mouse sobre as costas de uma almofada de aquecimento e manter anestesia com uma máscara cobrindo a boca e o nariz do mouse. Verifique se há suficiente profundidade da anestesia beliscar as patas e cauda para verificar a ausência de reflexos.
- Remova o cabelo abdominal usando uma máquina de cortar cabelo.
- Espalhe as patas traseiras e fixar sua posição usando a fita.
- Desinfete a área abdominal usando iodo-povidona, seguido por 80% de etanol. Repita mais duas vezes.
- Use um pano cirúrgico para garantir local cirúrgico não ser contaminado. Abra as camadas de pele e músculo ao longo da linea alba com uma tesoura (ou bisturi) para expor os órgãos abdominais.
- Colocar os intestinos em uma luva de hidratada salina 0,9% e enrole para mantê-los húmida.
- Use dois pinça fina para remover o tecido adiposo acima a aorta abdominal.
- Usando uma seringa de insulina (30G), injetar 250 µ l de solução de heparina (50 U/mL) para a veia Cava Inferior (VCI) e espere 3 min para sua distribuição sistêmica. Heparina poderá suprimir a hemostasia e evitar coagulação indesejada durante a cirurgia.
- Usando duas pinças, disse a aorta infra-renal até sua bifurcação e seus vasos de ramo a saída.
- Ligar os vasos colaterais, que são esperados para ser colocado na área do preso, com um cauterizador de alta temperatura.
- Interromper o fluxo de sangue, fixando a aorta infra-renal diretamente abaixo das artérias renais.
- Coloque uma segunda pinça em uma posição distal logo acima da bifurcação da aorta.
- Realize uma pequena incisão horizontal usando a tesoura no ponto médio entre os grampos ao longo do navio.
Nota: O tamanho da incisão deve ser equivalente a 1/3 da circunferência do vaso. - Introduza uma seringa com uma agulha (30G) da incisão e liberar a aorta com 250 µ l de solução heparina (50 U/mL).
- Utilizar suturas de 10-0, coloque um único nó de cada lado da incisão.
- Dilatação da aorta inserindo um dilatador de vaso a incisão e espalhar o recipiente ligeiramente. Repita a dilatação de 2 a 3 vezes.
- Hidrate o cateter-balão com soro fisiológico a 0,9%.
- Insira o cateter-balão achatado na aorta e avançá-lo em direção a pinça proximal na aorta.
- Quando chegar a pinça proximal, cuidadosamente Abra a pinça proximal e insuflar o balão para evitar o vazamento de sangue, através da injeção de ~0.6 mL de solução salina.
Nota: A relação do balão inflado de navio é 1.5: 1. - Avance o cateter retrógrado para aproximadamente 2 cm.
- Puxe o cateter expandido, enquanto desinflar o balão ligeiramente liberando a seringa.
- Quando o cateter chega a incisão da aorta, recolocar a pinça proximal. Esvazie o balão completamente e removê-lo.
- Enxágue a aorta com 250 µ l de solução heparina (50 U/mL), utilizando uma seringa de 30G.
- Feche a incisão da aorta usando suturas de 10-0. Lugar interrompido pontos de cada lado lateral, seguido por um ou dois pontos no lado ventral.
- Abra a pinça distal. Em caso de sangramento, fechar a pinça novamente e colocar pontos adicionais.
- Abra a pinça proximal com cuidado.
- Coloque dois cotonetes na sutura para apoiá-lo e parar qualquer sangramento.
- Coloque hemostatos absorvíveis na sutura para sustentá-lo.
Nota: Um pulso aórtico deve ser visível distal da incisão. - Coloque os intestinos para o abdômen.
- Enxaguar a cavidade abdominal com solução salina 0,9%, que foi previamente aquecido a 37 ° C.
- Feche a camada muscular abdominal usando suturas execução de 6-0.
- Feche a pele com suturas de execução de 5-0.
- Injete o carprofeno de 4-5 mg/kg por via subcutânea antes de permitir que o mouse para acordar. Monitorar o animal até ganhou consciência, manter a prostração esternal. Manter o animal em uma gaiola até recuperação completa.
- Adicionar o metamizol à água potável (50 mg/100 mL) como medicação para a dor por 3 dias e monitorar o animal diariamente. Geralmente os ratos como o doce sabor de dipirona e começam a beber imediatamente após a cirurgia. Se preferirem, agentes injetáveis de liberação sustentada podem ser usados em vez de dipirona.
Nota: O período de observação para este modelo é de 28 dias.
3. histopatologia
- Colheita da aorta com balão-ferido depois de 28 dias, preparando os ratos como descrito nos passos 2.2 a 2.9.
- Use a tesoura para remover a balão-ferido da aorta (entre a bifurcação e 0,3 mm acima dos vasos renais) e eutanásia o mouse cortando seu coração.
- Irrigue o lúmen do vaso com 0,9% NaCl.
- Consertar o navio colhido em paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite e desidratá-lo em concentrações crescentes de etanol, começando com etanol a 70% por 2 horas, 80% de etanol por 1 hora, etanol 95% por 2 horas e 100% de etanol por 5 horas. Então, Incube as amostras em xilol durante 2 horas 3 vezes, antes de me infiltrar as amostras com parafina.
Nota: em vez de liberar o navio colhido com 0,9% NaCl, ele pode ser liberado com 4% PFA.
Cuidado: PFA e xileno são tóxicos e devem ser manuseados com cuidado especial. - Incorporar a amostra em parafina e cortados em fatias de espessura de 5 µm usando um micrótomo.
- Deparaffinize os slides com xileno 3 vezes durante 5 minutos.
- Reidratar slides de tecido usando uma série decrescente de etanol. Comece com 100% de etanol 2 vezes por 5 min, seguido de 3 minutos de etanol 95%, 80% e 70%.
- Mancha os slides com coloração tricromo de Masson como descrito18.
- Desidrate corrediças manchadas em etanol 100% 2 vezes por 10 min cada. Limpar com xilol 2 vezes por 10 min cada e montar no meio de montagem.
- Visualizar os slides com um microscópio de campo claro. Use uma lente com 5x ampliação e uma abertura numérica de 0,12 por imagens uma visão ou uma lente com 20 ampliações de x com uma abertura numérica de 0.35 para observação detalhada.
4. microscopia de imunofluorescência
- Reidratar slides de tecido usando uma série decrescente de etanol. Comece com 100% de etanol 2 vezes por 5 min, seguido por 3 min de etanol 95%, 80% e 70%.
- Execute recuperação de antígeno aquecendo as lâminas em solução de recuperação do antígeno em um navio a vapor por 20 min.
- Deixe arrefecer o slides até à temperatura.
- Depois de lavar os slides por três vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS), aplica solução de bloqueio de antígeno em seções por 30 min.
- Lave slides três vezes por 5 min com PBS.
- Incube as seções com anticorpo primário diluído em diluente de anticorpo primário.
Nota: O momento de concentração e a incubação deve ser escolhido separadamente para cada anticorpo. - Lave slides três vezes por 5 min com PBS para remover anticorpos não acoplado.
- Incube as seções com um anticorpo secundário conjugado previamente diluído em diluente de anticorpo secundário.
Nota: O momento de concentração e a incubação deve ser escolhido separadamente para cada anticorpo. - Remova anticorpos desacoplados lavando os slides por 5 min, três vezes.
- Counterstain os núcleos de célula usando 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 15 min; a concentração final de DAPI deve ser de 350 nM.
- Monte as lâminas na imunofluorescência compatível com solução de montagem.
Nota: Usando a solução de montagem errada pode obscurecer o sinal de fluorescência. - Exibição de slides com um microscópio de fluorescência. Use uma lente de ampliação de 40x com uma abertura numérica de 1.3.
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Representative Results
Desnudamento do balão é um modelo adequado para estudar o desenvolvimento de MH em camundongos. Animais recuperar bem da cirurgia e mostram uma pós-operação condição física excelente. Nós estabelecemos este modelo em 50 ratos com menos de 3% de mortalidade devido a procedimento cirúrgico. Figuras 1B -C mostrar as principais etapas cirúrgicas. Após uma incisão de pele ao longo do linea alba, identificar a aorta abdominalis. Coloque braçadeiras microcirúrgicos (figura 1B). Faça uma pequena incisão no meio da aorta, defina um cateter balão no navio e slide é retrógrada, contra a direção do fluxo de sangue (Figura 1). Movimento do balão inflado leva a raspagem da íntima e, ao mesmo tempo, hiperdistensão do navio. A incisão da aorta será fechada com pontos simples. Um pulso aórtico deve ser visível distal da incisão.
MH desenvolve progressivamente no enxerto ao longo do tempo. Histológicas de coloração com Masson tricromo demonstra myointima formação dentro da lâmina elástica interna (Figura 2A). Myointimal lesões consistiam principalmente de componentes celulares positivos para SM22 e alguns componentes da matriz extracelular (Figura 2B). Myointimal células são mais avaliadas pela mancha da imunofluorescência. A população principal no myointima consiste de células musculares lisas (músculo liso actina (SMA) positiva) e células de miofibroblastos (fibroblasto ativação da proteína (FAP) positivo) (Figura 2B).
Figura 1. Esquemas do cateter e sua implantação. (A) esquema detalhado do cateter. Porto distal, balão, porta de troca rápida (RX-port), fio-guia, lúmen único para RX-port, duplo lúmens de RX-Port para o balão, cubo, porta de insuflação do balão. (B) ilustração esquemática do procedimento cirúrgico. Fluxo sanguíneo da Aorta abdominalis está parado com duas pinças micro e uma pequena incisão é realizada. C. inflado cateter dentro aorta abdominalis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Formação de Myointima dentro da lâmina elástica interna. (A) Denuded rato aorta é colhida, parafina incorporado, e uma secção transversal representativa é mostrada na coloração tricromo. (B) mancha de duplo da imunofluorescência de balão-desnudada aortae é mostrado. A linha superior mostra lesões myointimal manchadas para SM22 e colágeno III. Na linha inferior, os vasos estão manchados para SMA e FAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo demonstra um modelo murino para estudar o desenvolvimento de hiperplasia myointimal e permite a exploração dos processos patológicos subjacentes e os testes de novas drogas ou opções terapêuticas.
O passo mais crítico neste protocolo é o desnudamento da aorta. Cuidado especial deve ser dada durante esta etapa como denudação excessiva conduzirá à formação de aneurisma e fracasso do modelo. Por outro lado, se a denudação é executada insuficientemente, myointima muito pouco irá desenvolver. Portanto, a intensidade da etapa de desnudamento é crucial para o resultado e o sucesso deste modelo animal.
No que diz respeito o procedimento cirúrgico, é fundamental que as duas paredes do navio não são furadas, definindo os pontos, que podem resultar em falha precoce de patência do vaso. Descrevemos anteriormente um modelo de mouse em que induzimos a estenose do vaso na aorta abdominal de ratos18. No entanto, isto e a maioria dos outros modelos só fornecem quantidades muito pequenas de tecido para análise. Uma vantagem deste método é a quantidade relativamente grande de tecidos obtidos (segmento de navio ~ 1 cm). Um enxerto de nave única, portanto, pode ser dividido em várias partes e usado por diversas análises, efetivamente reduzir o número de animais experimentais necessários.
Além disso, os animais aptos de mata-mata podem ser usados para estudar o desenvolvimento de hiperplasia myointima em condições diferentes da doença. Os planos de fundo genéticos também podem ser combinados com este modelo animal para entender os mecanismos de hiperplasia myointimal em uma variedade de configurações ou o impacto de determinados genes.
Em resumo, o modelo descrito aqui é reprodutível, fácil de realizar e pode ser estabelecida de forma rápida e confiável. Testado com êxito tratamento opções neste modelo podem ser confirmadas no animal grande modelos de19.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores Christiane Pahrmann agradecer a assistência técnica.
D.W. foi apoiado por Max Kade Foundation. T.D. recebido concede a outra Kröner Fondation (2012_EKES.04) e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1. _. Bolsas de investigação S. S. recebeu o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 3 mL Syringe | BD Medical | 309658 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Antigen retrieval solution | Dako | S1699 | |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| C57BL/6J | Charles River | Stock number 000664 | |
| Clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | JAW DIMS: 4 x 0.75 mm LENGTH: 13 mm |
| Collagen 3 | abcam | ab7778 | Antibody |
| DAPI | Thermo Fischer | D1306 | |
| Donkey anti-Goat IgG AF555 | Invitrogen | A21432 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A21206 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A11055 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF555 | Invitrogen | A31572 | Secondary antibody |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| FAP | abcam | ab28246 | Antibody |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Heparin | Rotexmedica | PZN 3862340 | 25.000 I.E./mL |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| Image-iT FX Signal Enhancer | Invitrogen | I36933 | Blocking solution |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4mm |
| MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange | Abbott | 1012268-06U | |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| NaCl 0,9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| PBS pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Prolong Gold Mounting solution | Thermo Fischer | P36930 | Mounting solution for immunofluorescence stained slides |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Resorcin-Fuchsin Weigert | Waldeck | 2E-30 | Trichrome staining |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Scissors Vannas-style | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| Fast acting Adhesive MINIS 3x1g | UHU | 45370 | Cyanoacrylate |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| SM22 | abcam | ab10135 | Antibody |
| SMA | abcam | ab21027 | Antibody |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Tabotamp fibrillar | Ethicon | 431962 | Absorbable hemostat |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| U-100 Insulin syringe | BD Medical | 324825 | |
| Vessel Dilator | Fine Science Tools | 18603-14 | |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 |
References
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