Summary
Denne protokol beskriver den elektrofysiologiske evaluering af murine forkamre udnytter en optisk mapping system med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning, herunder dual optagelser af membran spænding og Ca2 + forbigående under programmeret stimulering gennem en specialiseret elektrode kateter.
Abstract
Seneste genome-wide association studier målretning atrieflimren (AF) har angivet en stærk association mellem genotype og elektrofysiologiske fænotype i hjertets forkamre. Det tilskynder os til at udnytte en genetisk manipuleret musemodel for at belyse virkningsmekanismen AF. Det er imidlertid vanskeligt at vurdere de elektrofysiologiske egenskaber i murine forkamre på grund af deres lille størrelse. Denne protokol beskriver den elektrofysiologiske evaluering af atria ved hjælp af en optisk mapping system med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning i Langendorff perfunderet murine hjerter. Optisk mapping system er samlet med dobbelt højhastigheds komplementær metal oxide semiconductor kameraer og høj forstørrelse målet linser, at opdage fluorescens af en spænding-følsomme farvestof og Ca2 + indikator. For at fokusere på vurdering af murine forkamre, er optisk kortlægning udført med et areal på 2 mm × 2 mm eller 10 mm x 10 mm, med en 100 × 100 opløsning (20 µm/pixel eller 100 µm/pixel) og samplingfrekvens op til 10 kHz (0,1 ms) på maksimum. En 1-fransk størrelse quadripolar elektrode pacing kateteret placeres i højre forkammer gennem den overlegne vena cava undgå mekaniske skader til atriet og pacing stimulation leveres gennem kateteret. En elektrofysiologiske undersøgelse er udført med programmerede stimulation herunder konstant pacing, brast pacing, og op til tredobbelt extrastimuli pacing. Under en spontan eller pacing rytme, registreres den optiske kortlægning aktionspotentialet varighed, aktivering kort, overledning hastighed og Ca2 + forbigående individuelt i højre og venstre forkamre. Derudover bestemmer de programmerede stimulation også inducibility af atrieflimren hjertebanken. Præcise aktivering kortlægning udføres for at identificere formering af excitation i atriet under en induceret atrieflimren takyarytmi. Optisk kortlægning med en specialiseret indstilling giver mulighed for en grundig elektrofysiologiske evaluering af atriet i murine patologiske modeller.
Introduction
Hjertet består af 4 kamre i pattedyr. De øverste to kamre er forkamre, og de lavere er hjertekamrene. Hjertekamrene arbejder som en pumpe til at skubbe blod til den systemiske eller pulmonal cirkulation. Forkamre modtage blod vender tilbage fra de systemiske eller pulmonal venerne, og bistå i transport af blod i ventrikler at opnå en effektiv hjerte pumpe funktion. Fra en elektrofysiologiske aspekt er hjertets forkamre vigtige funktion at regulere hjerterytmen. De elektriske signaler stammer fra sinusknuden placeret ved krydset mellem den overlegne vena cava (SVC) og højre atrium (RA), og derefter overføres til RA og venstre atrium (LA), og føre til ventrikel gennem AV-knuden og hans-Purkinje ledningssystem.
Arytmier, som er hjerterytmeforstyrrelser, inddeles i atrielle og ventrikulære efter deres oprindelse. Atrieflimren (AF) er den mest almindelige vedvarende form af en arytmi, karakteriseret ved en tilfældig og hurtige excitation af hjertets forkamre. Nyere genetiske analyser og genome-wide association studier (GWAS) har vist tilknytningen mellem AF og genetiske mutationer eller monopolymorphisms1,2,3,4. Disse resultater viser, AF er i det mindste delvis forbundet med en genetiske årsag. Derfor er det kritisk at vurdere genotype-fænotype interaktioner i hjertets forkamre, ved hjælp af en genetisk manipuleret dyremodel. Det er almindeligt accepteret, at musen er den mest etablerede pattedyr til genetisk modifikation.
Den optiske kortlægning teknik er udviklet til at evaluere excitation af hjertet væv. Observation af murine atrium af optiske kortlægning er imidlertid hæmmet af sin forholdsvis lille størrelse. Vi forsøger at opnå en detaljeret vurdering af murine atrium med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning.
Protocol
Dette dyr eksperiment blev godkendt og udføres i henhold til regulering af de institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Tokyo medicinske og dentale Universitet.
1. forberedelse
- Stamopløsninger
- Opløse spænding-følsomme farvestoffer (di-4-ANEPPS og RH237) og Ca2 + indikator (Rhod-2 AM) med 100% dimethylsulfoxid (DMSO) at gøre stamopløsninger med koncentrationer af 6 mM, 10 mM og 10 mM, henholdsvis.
- Opløse excitation-sammentrækning (E-C) uncoupler, blebbistatin, med 90% DMSO at gøre en 50 mM stamopløsning.
- Alikvot stamopløsninger i en 0,2 mL PCR rør i et mørkt rum, og udskifte luften i stock røret ved hjælp af nitrogen gas for at undgå oxidation.
- Wrap stock-rør i aluminiumsfolie individuelt for beskyttelse mod lyset, og gemme dem på-20 ˚C.
- Arbejde løsninger
- Forberede 1 L af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) uden Ca2 + (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4og 1,5 mM KH2PO4, pH 7.40 justeret af NaOH)
- Forberede 1 L Tyrodes løsning (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucose og 5,0 mM HEPES, pH 7.40 justeret af NaOH).
- Filtrer Tyrodes løsning med et 0,22 µm flaske top filter og lufte det godt ved at boble luftning ved hjælp af en luft sten tilsluttet en O2 gas cylinder.
2. optical kortlægning i Langendorff-perfunderet hjerter
- Samle den optiske mapping system ved hjælp af to supplerende metal oxide semiconductor (CMOS) kameraer (figur 1a& b)
- Samle CMOS kameraer, stråledeler, målet linser, linse revolver, lyskilde, dichroic spejle, filtre og andre dele til optisk mapping system som vist i figur 1a& b.
- Vælg forstørrelsen ved at ændre mål linsen i et tårn, udstyret med forskellige forstørrelser (1,6 X og 5 X).
Bemærk: Størrelsen af CMOS-sensor er 10 mm × 10 mm, med en 100 × 100 opløsning, hvilket betyder, med 5 X mål linse, dette system giver en 20 µm rumlige opløsning. - Sæt excitations lys ved hjælp af en lysdiode (LED) lampe med en center bølgelængde på 530 nm, passerede gennem et båndpas filter (520/35 nm), og afspejlede med dichroic-spejl (560 nm).
- Optag emission signal divideret med en splitter (665 nm), i hvilken indstilling kamera 1 med en lang pass filter (697/75 nm) registrerer fluorescens ved hjælp af en membran spænding-følsomme farvestof (di 4-ANEPPS eller RH237) og kamera 2 med et båndpas filter (572/28 nm) registrerer den signal af Ca2 + indikator (Rhod2-AM).
- Samle Langendorff perfusion kredsløb
- Tillægge en peristaltisk pumpe polyvinylchlorid (PVC) rør.
- Lagt i indtagelse side af PVC-rør i Tyrodes løsning beluftet med 100% O2 som nævnt i trin 1.2.3.
- Tilsluttes en håndlavet luft fælde udledning side af PVC rør, derefter arrangere den 5 µm filter, trevejsspærreventiler, tryktransduceren, varme glas coil, og 21-gauge afrundede nål (nål størrelse er foranderligt i overensstemmelse med aorta størrelse) sekventielt , ved hjælp af andre PVC rør.
- Fyld perfusion kredsløb med Tyrodes løsning at undgå eventuelle luftbobler i kredsløbet, og stoppe strømmen indtil hjertet er forbundet til kredsløbet.
- Heparinization og anæstesi
- Indsprøjtes ufraktionerede heparin (200 IE, uanset kropsvægten) intraperitoneal i en mus ved hjælp af en 25-gauge kanyle og 1 mL sprøjte.
- Bedøver musen ved en intraperitoneal injektion med pentobarbital (65mg/kg) 10 min efter heparin injektion.
- Cannulation og perfusion
- Placere musen i den liggende stilling. Bekræfte dyr er bedøvede ved manglende respons til tå knivspids. Åbn bugvæggen under formet som et sværd procesniveau ved hjælp af saks. Lave et tværgående snit i mellemgulvet, skære begge sider af ribbenene i den mediale aksillær linje uden nogen skade til hjertet og vende den forreste brystvæg opad. Forhånd buet pincet bag hjertet, og holde faldende aorta, spiserøret og ringere vena cava. Derefter, punktafgifter hjertet med saks hurtigt sammen med den tilstødende fartøjer og væv, som aorta, lungerne, luftrøret, spiserøret, fedtvæv og thymus.
- Vasker hjertet med 10 mL iskold PBS i en petriskål, og fjerne den tilstødende væv.
- Indføre spidsen af den 21-gauge afrundede kanyle tilsluttet perfusion kredsløb i opstigende aorta, og lave det med tråden under et stereomikroskop.
- Start til perfuse hjertet i 10 min med Tyrodes løsning beluftet med 100% O2.
- Løbende overvåge perfusion pres med tryktransduceren tilsluttet forstærkeren og optager.
- Holde perfusion pres mellem 80-100 mmHg (normalt svarende til 2-5 mL/min. for flowet) under alle de følgende trin.
- Under den indledende perfusion (trin 2.4.4.), indsætte det tynde polyethylen (PE) rør (ydre diameter: 0,8 mm) i den stående Veterinærkomité, og ordne det med en tråd. Placer derefter, hjertet i varmede glas kammer (figur 1b& c).
- Punktere en 24-gauge iboende nål (ydre diameter: 0,7 mm) i den venstre ventrikel (LV) hulrum gennem den ventrikulære apex at undgå skader til atriet og fjerne indre nålen forlader den eksterne kanyle i LV.
- Indføre en 1-fransk størrelse brugerdefineret gjort elektrode kateter gennem PE rør i den stående Veterinærkomité til at udføre elektrisk stimulation i RA. Hvis det er nødvendigt, skal du rykke kateteret ind i højre hjertekammer (RV) for ventrikulær pacing.
- Indsæt en pin elektroden i den ventrikulære apex løbende registrere de bipolare elektrokardiogrammer (EKG) mellem pin elektrode og cannulation nål i opstigende aorta (figur 1 c).
- Fortsætte overvågning EKG og perfusion trykket overalt i hele undersøgelsen.
- Sluk lyset, og udføre den følgende eksperiment i et mørkt rum.
- Gå til trin 2,5. for en enkelt optagelse af membran spænding eller 2.6. for en dobbelt optagelse af membran spænding og Ca2 + forbigående.
- Farvning for en enkelt optagelse af membran spænding
- Opretholde den perfusion løsning opvarmet til 37 ˚C under denne farvning protokol for en enkelt optagelse af membran spænding.
- Fortynd 8.3 µL af di-4-ANEPPS stamopløsningen (6 mM) med 10 mL af Tyrodes løsning (endelige koncentration er 5 µM).
- Indgyde det samlede volumen (10 mL) af fortyndede di-4-ANEPPS løsningen ind i hjertet via perfusion rute for 2-5 min, efterfulgt af en udvaskning med Tyrodes løsning i 5 min.
- Fortynd 5 µL af blebbistatin stamopløsningen (50 mM) med 1mL af Tyrodes løsning (endelige koncentration er 250 µM).
- Administrere det samlede beløb for den fortyndede blebbistatin løsning via perfusion rute.
- Spring trin 2.6 og Fortsæt til trin 2,7 for udvaskning.
- Farvning for en dobbelt optagelse af membran spænding og Ca2 + forbigående
- Holde den Tyrode løsning ved stuetemperatur.
Bemærk: Denne indledende indstilling af temperaturen er forskellig fra i farvning for en enkelt optagelse af membran spænding (trin 2.5.). - Administrere blebbistatin på samme måde som i trin 2.5.4 og 2.5.5.
- Mix 3 µL af Rhod2AM stamopløsning (10 mM) og 30 µL af polyoxyetylen-polyoxypropylene blokere copolymer F-127 (20% i DMSO) og derefter fortyndes blandingen med 10 mL af Tyrodes løsning.
- Indlæse det samlede beløb for Rhod2AM løsning (3 µM) over 2-5 min via den samme rute som blebbistatin.
- Fortynd 7 µL af RH237 stamopløsning (10 mM) med 10 mL af Tyrodes løsning.
- Administrere det samlede beløb for den fortyndede RH237 løsning (7 µM) over 2-5 min.
- Efter afslutningen af ovennævnte procedure, begynde at varme den Tyrode løsning på 37 ˚C.
- Holde den Tyrode løsning ved stuetemperatur.
- Udvaskning
- Holde temperaturen i Tyrodes løsning på 37 ˚C i den følgende eksperiment.
- Perfuse hjerte med Tyrodes løsning i mindst 5 min. til at vaske ud de overdrevne farvestoffer.
Bemærk: Der er ingen grund til at øge flowet i denne vaskes ud trin (Se trin 2.4.6.) - Bekræfte forsvinden af enhver bevægelse artefakt sammentrækninger, og homogene farvning i det perfused hjerte.
- Prøveudtagning og data analyse
- Sætte dækslet glas (25 mm × 60 mm) til perfused hjertet omhyggeligt, for at tromle den atriale overflade uden for meget mekanisk stress og forebygge bevægelse artefakt fra vibrationer af løsningen. Bekræfte, at atrium tillægger cover glas korrekt.
- Optage fluorescens af CMOS kameraer med en prøveudtagning Vurder op til 0,1 ms for di 4-ANEPPS og 1 ms for den RH237 og Rhod2AM farvning.
- Analysere de opnåede optagelser ved hjælp af analyse software, ifølge producentens anvisninger for selve driften af softwaren.
- Oprette en aktivering kort og film efter uddrager regionen af interesse, afdrift fjernelse, temporal filtrering og 3 X 3 binning5.
3. elektrofysiologiske undersøgelse
- Indstilling af pacing elektroder og stimulator
- Bekræfte kontakt mellem spidsen af den skræddersyede pacing elektrode i RA til væv for stimulation (Se trin 2.4.9.).
- Levere alle pacing stimuli fra pacing kateteret tilsluttet den programmerbare stimulator.
- Bestemmelse af tærsklen pacing
- Sæt pacing intervallet mellem 100 og 150 ms (pulse bredde af 0,4 ms), undgå eventuelle iboende rytme overgår den pacing sats.
- Levere konstant pacing stimulation for mindst 20 beats til at opnå en stabil atrieflimren pacing.
- Angiv den pacing output på 5 mV og derefter gradvist reducere det indtil de leverede pacing undlader at depolarisere atrium.
- Bekræfte den atriale excitation af tilstedeværelsen af P-bølger EKG, og/eller en atrial excitation signal af den optiske registrering.
- Bestemme minimum pacing output, som er i stand til depolarisere atrium som pacing grænse.
- Indstille pacing output for følgende undersøgelser på to gange den pacing tærskel.
- Konstant og brast pacing
- Levere konstant pacing for 99 beats, med en pacing interval starter ved 150 ms eller den længste interval, der undgår overgår den iboende rytme.
- Reducere pacing intervallet gradvist med 5 ms trin, ned til 40 ms, eller indtil at nå intervallet, der undlader at få 1:1 erobringen af atriet.
- Enkelt extrastimulus pacing
- Indstil pacing cyklus længden af de grundlæggende drev (S1) til 120 ms, 100 ms, og 80 ms, medmindre den iboende rytme udskiftet adskillige gange det grundlæggende drev eller de pacing undlader at få 1:1 atrieflimren excitation.
- Angive antallet af pacing stimuli til 10 slag for grundlæggende drive toget.
- Angiv den første extrastimulus (S2) til-10 ms for den grundlæggende cyklus længde.
- Levere S2 efter den sidste pacing stimulus af grundlæggende drevet.
- Forkorte kobling interval af S2 gradvist med 5 ms trin, indtil S2 undlader at depolarisere atrium.
- Bestemme den effektive refraktære periode (ERP) som den længste S2 interval, der undlader at depolarisere atrium.
- Evaluere ERP med mindst 3 forskellige grundlæggende cyklus længder for at vurdere sats tilpasning af ERP.
- Dobbelt og tredobbelt extrastimuli pacing for at fremkalde atrieflimren hjertebanken
- Nulstille S2 interval til et punkt 20 ms uden for ERP S2, hvis ingen arytmier er observeret.
- Tilføje en anden extrastimulus (S3), begyndende med den samme interval som S2.
- Formindske kobling intervallet mellem S2 og S3 gradvist med 5 ms trin indtil S3 undlader at depolarisere atrium.
- Reset interval af S2 til et punkt 10 ms uden for ERP og derefter gentage trin 3.5.3.
- Nulstille S2 og S3 intervallerne til point 20 ms uden for hver ERP.
- Tilføje et tredje extrastimulus (S4), begyndende med den samme interval som S3.
- Formindske kobling intervallet mellem S3 og S4 gradvist med 5 ms trin indtil S4 undlader at depolarisere atrium.
- Nulstille S3 interval til et punkt 10 ms uden for ERP og derefter gentage trin 3.5.7.
- Nulstille S2 og S3 intervallerne til point 10 ms uden for ERP og derefter gentage trin 3.5.7.
- Define inducibility af atrieflimren hjertebanken af reproducerbare induktion ved hjælp af tilsvarende programmeret stimuli.
- Evaluering af inducibility af atrieflimren hjertebanken
- Løbende registrere EKG under alle pacing protokoller (trin 3.3-3.5.).
- Udføre optisk optagelser, under og efter hver stimulation, optage induktion af atrial takykardi (AT) eller gentagne atrieflimren svar (RAR).
- Bekræfte reproducerbarhed ved at anvende den samme pacing protokol, når AF eller en RAR er induceret.
Representative Results
Optisk kortlægning eksperimenter er udført ved hjælp af enheder, som vist i figur 1a. Skemaet for den optiske system er illustreret i figur 1b. Systemet giver en høj opløsning analyse af membran potentiale og Ca2 + forbigående i atriet.
Afbilledet i figur 1 c og d, er isolerede hjertet placeret i en temperatur-kontrolleret kammer. En 1-fransk størrelse elektrode kateteret placeres i RA gennem en PE rør indsat i den stående Veterinærkomité, og en anden iboende PE rør er sat ind i LV hulrummet fra LV apex at undgå overdreven pres på hjertet kammer. For en samtidige ECG optagelse, katode (ECG bly [–]) er tilsluttet cannulation nål og anoden (ECG bly [+]) er tilsluttet pin elektrode indsat i den ventrikulære apex. Funktionen af denne forsamling er at undgå eventuelle mekaniske skader på hjertets forkamre.
Evaluering af membran spænding, er fluorescens ved hjælp af di-4-ANEPPS indspillet med en 10.000 rammer/s samplingfrekvens (figur 2). Aktivering kortet er fremstillet under konstant pacing leveret fra RA. Den fine kortlægning muliggør analysen af detaljerede overledning mønster i små murine forkamre.
Figur 3 illustrerer repræsentative spor af membran spændinger og Ca2 + forbigående i LA ved hjælp af RH237 og Rhod2AM under konstant pacing fra RA. Vi reducerer samplingfrekvens af tilknytningen til 1000 frames/s til at opnå en tilstrækkeligt signal/støj forholdet mellem Rhod2AM signalet med den nuværende indstilling. Systemet indeholder dog en tilstrækkelig kvalitet til at analysere forholdet mellem aktionspotentialet og Ca2 + forbigående.
Vi udfører derefter en induktion af en atrial takyarytmi med programmerede stimulation ved hjælp af mus under en patologisk tilstand. Figur 4 udstiller en optisk registrering af en induceret på i en murine atrium farves med di-4-ANEPPS. Musen gennemgår en tværgående aorta konstriktion procedure for at anvende et pres overbelastning atrium 10 dage før eksperimentet6. Vi inducere AT ved tredobbelt extrastimuli pacing (120/100/100/80), og observere formering af de tilbagevendende kredsløb.
Figur 1. Optisk mapping system. a. generalforsamlingen af Elektrofysiologi/optisk mapping system. b. skematisk af sammensætningen af det optiske mapping system: den blå pil angiver excitation lys genereret af lyskilden. Mål linsen kan udveksles med tårnet. Udsendes lyset fra de farvede hjertet er delt mellem kamera 1 og kamera 2. Kamera 1 registrerer de lange bølgelængde signaler for membran spænding, og kameraet 2 registrerer bølgelængder med en bandpass filter i 580 ± 20 nm for Ca2 + forbigående. Under proceduren, EKG og perfusion trykket registreres løbende, og EKG-signalet er også samtidig indført til den optiske kort optagelse software. c. forberedelse af isolerede hjerter: hjerter er kanylerede med afrundede nål via opstigende aorta for perfusion. For samtidige ECG optagelser, katoden er tilsluttet cannulation nål og anode med pin elektrode er indsat i den ventrikulære apex. d. Cannulation tube og elektroderne: hjertet er kanylerede med en 21-gauge afrundede nål for perfusion (cannulation nål). En 1-fransk størrelse stimulere elektroden (elektrode) er placeret i højre forkammer gennem en polyethylen rør indsat i den overlegne vena cava. Glas kammer er varmet på 37 ˚C af opvarmet vand cirkulerer i hulrummet af salen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Aktivering kort i atriet. a. repræsentative aktivering kortene i den anterior udsigt med 5 X mål linse, og b. i den bageste opfattelse med en 1,6 X mål linse. (Venstre panel) Skematisk af isolerede hjerte og atrium. (Højre panel) Aktivering kort over venstre atrium fremstillet med di-4-ANEPPS farvning på 10.000 rammer/s. Optagelsen foregår under konstant pacing med stimulerende elektrode placeret i højre atrium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dobbelt optagelse af aktionspotentialet og Ca2 + forbigående i venstre atrium. a. skematisk af isolerede hjertet. b. repræsentativt billede af intensiteten af fluorescens i venstre atrium ved hjælp af RH237 for membran spænding (Vm) og Rhod2AM for Ca2 + forbigående. Optagelsen er udført med en 5 X mål linse på 1.000 rammer/s. c. Simultan optagelse af EKG (top), RH237 signal (i midten) og Rhod2AM signal (nederst), under konstant pacing med stimulation elektrode i højre atrium. De sorte pile angiver stimulation pigge og gule pile ventrikulær excitation. En lysspredning effekt fra ventriklen kan også observeres (gul pilespidser) både i RH237 signal og Rhod2AM signal. d. fusionerede RH237 og Rhod2AM spor. Aktionspotentialet og forbigående Ca2 + ændringer registreres samtidig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Aktivering kortlægning under atrial takykardi. (Venstre panel) Skematisk af isolerede hjertet. (Midten panel) Aktivering kort under en atrial takykardi (AT). AT var fremkaldt af tredobbelt extrastimuli pacing leveret fra højre atrium. (Højre panel) Aktivering kort under sinusrytme i samme mus hjertet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende movie 1. Repræsentative film af membran potentiale i atrium ved hjælp af farvning med di-4-ANEPPS. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende movie 2. Repræsentative film af aktivering kortlægning under atrial takykardi og sinus rytme. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Optisk mapping er en veletableret manøvre for at studere den kardiale Elektrofysiologi7, og er en ganske nyttig værktøj til at vurdere ventrikulære arytmier8,9, men også atrieflimren dem10,11 . Samtidige kortlægning af transmembrane potentiale og Ca2 + transienter er nyttige for at forstå de underliggende mekanismer af arytmi i forhold til hjertesvigt og andre hjertesygdomme12,13. Når man sammenligner de andre elektrofysiologiske vurderingsmetoder, såsom dem, der bruger en enkelt celle eller celle ark, en af de absolutte superiorities optisk kortlægning i til perfused hjertet er vurderingen af varmeledning mønster i den intakte atrium og ventrikel, induceret ikke kun under sinusrytme, men også under arytmier14. Et forsøg på at udnytte murine hjerter, især atrium, som et surrogat for mennesker er stødt på vanskeligheder hovedsageligt på grund af deres lille størrelse, men musen er en attraktiv eksperimentel model med hensyn til vurderingen i en genetisk manipuleret dyr model, og dette problem skal løses. Vores tilgang giver én retning for at løse konflikten.
Selv om vores tilknytning af optiske apparater var dybest set svarer til det konventionelle system for hele murine hjerter15, har vores metode fordelen at vurdere murine atrium ved at foretage nogle ændringer i det. Først, vi forfølger for at opnå en høj rumlige og tidsmæssige opløsning på op til 0,1 ms/ramme og 20 µm/pixel og denne høj opløsning kortlægning bidraget til en mere præcis måling af varmeledning hastighed og formering mønster i murine atrium. For det andet for at undgå unødvendige mekaniske skader eller strækning af atrium, som kunne ændre elektrofysiologiske egenskaber 16,17, indsættes en iboende nål direkte i LV til at reducere trykket intra-kammer stedet for at indsætte det gennem LA, som udføres i den tidligere undersøgelse15. Derudover pacing stimulus er leveret gennem en custom made 1-fransk størrelse elektrode kateteret placeres i RA, men ikke af en nål-elektrode, som kan skade atrium. Nogen ben undgås ved fastsættelsen af den atriale vedhæng, som blev brugt i den tidligere undersøgelse15. For det tredje med hensyn til vurdering af den underliggende mekanisme i arytmier er en programmeret stimulation protokol at fremkalde atrieflimren hjertebanken afgørende18,19. Vi udføre programmeret stimulation identisk i klinisk elektrofysiologiske undersøgelser, herunder burst pacing og tredobbelt extrastimuli pacing, med en ændring af den pacing interval for musen hjerte. Således ud over parametrene baseline måling kunne protokollen evaluere ved inducibility. Når det er nødvendigt, vurderet ved inducibility med administrationen af isoprenalin eller andre stoffer. Vores erfaring vise wild-type mus næppe nogen ATs selv efter en fuld stimulation protokol. Derfor bør inducibility af AT være vigtige oplysninger til evaluering af flere patologiske tilstande som genetiske mutationer, kirurgiske procedurer og administration af medicin11bidrag. Disse ændringer kunne optimere den præcise elektrofysiologiske vurdering i den intakte murine atrium.
Denne metode har også nogle begrænsninger. Først ved hjælp af en maksimal rumlige opløsning med en 5 X mål linse, field of view (FOV) er begrænset til en del af atriet (dvs. kun den venstre atriale vedhæng som vist i figur 2a). For at opnå større FOV af atriet, er en 1,6 X mål linse undertiden at foretrække (figur 2b). For det andet uden fastsættelse af atriet med knappenåle, nogle gange er det vanskeligt at måle atrial overledning egenskaber korrekt, fordi den atriale overflade er buet. Så, vi placeret cover glas på dens overflade at flade det i stedet for at løse det af pins. Denne metode er også gavnligt for at forhindre bevægelse artefakt fra vibrationer af løsningen. For det tredje, med vores metode, det er ganske vanskeligt at opnå den hele FOV af det, så at bruge visningen anteriore og posteriore korrekt er vigtigere i vores tilgang end i anden tilgangen som vist i figur 2. Fordelen ved den forreste opfattelse ville være klart observation af reentry for patologiske tilstande, især i vedhæng (figur 4). På den anden side den bageste opfattelse er en fordel at få et godt overblik over den atriale bageste væg, og kan være en detaljeret registrering af udløser aktivitet fra Myokardie ærmet. Når det er vanskeligt at opnå en passende vis og at flade sine buet overflade med vores metode, kan atrium være fastgjort med minimal spænding af pins.
Med vores metode er der 3 mulige problemer, fejl i farvningen, pacing, og arytmi induktion. For manglende farvning, hvis ingen eller svag fluorescens er overholdt, skal du kontrollere om optisk kortlægning apparater er korrekt samlet, og hvorvidt reagenset er passende gemmes og bruges. Tilstanden af perfusion løsning er også afgørende, hvilket også kan påvirke de elektrofysiologiske egenskaber af hjertet selv, så tilstanden af løsning herunder pH, temperatur, og om der var nok beluftning skal overvåges nøje. Det er også vigtigt at undgå enhver luft emboli i hjertet. For pacing fiasko, hvis de pacing stimuli ikke kan ophidse atrium, bør forskere kontrollere, om ledninger er korrekt ved hjælp af et kredsløb tester. Når de pacing stimuli er korrekt udsendes, er problemet kontakt af elektrode med væv. Repositionering af elektroderne kan løse problemet, og vores tilgang med pacing kateteret gør det nemt. For sværhedsgrad i arytmi induktion, kan RV pacing anvendes til induktion af en AT i visse begrænsede tilfælde. Ved hjælp af en quadripolar elektrode kateter som distale to elektroder og proksimale elektroder kan være placeret i RV og RA, henholdsvis, er det nemt at ændre webstedet pacing fra RA til RV. Denne kateter er også nyttige til at flytte den ventrikulære excitation, når en samtidig ventrikulær aktivering signal masker atrieflimren excitation signal.
Denne metode vil bidrage til vurderingen af genotype-fænotype interaktioner i vinduet AF relaterede gener nyligt fundet af de roman undersøgelser såsom GWAS, især for de gener, som undersøgelsen mislykkedes at vise dem ved andre metoder. Med udviklingen af enheder og teknikker, kan de elektrofysiologiske egenskaber af pulmonale vene ærme, som er en vigtig kilde til AF20, vurderes i det intakte hjerte med denne tilgang.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af programmet for forbedring af forskningsmiljø for unge forskere fra særlige koordinering midler til fremme af videnskab og teknologi (SCF) (til T.S.), Grants-in-Aid for videnskabelig forskning (nr. 16K 09494, til T.S., No. 26293052, til T.F.) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) i Japan. Vi sætter pris på Brainvision og Mr. Kenji Tsubokura for den tekniske bistand, og vi værdsætter også Mr. John Martin for hans sproglig bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
