Summary
Этот протокол описывает электрофизиологических оценки мышиных предсердия, используя систему оптического сопоставления с высоким временнóго и пространственного разрешения, включая двойной записи напряжения мембраны и Ca2 + переходных под запрограммирован стимуляция через катетер специализированных электрода.
Abstract
Недавние исследования генома всей ассоциации, таргетинг предсердий (AF) указали прочная связь между генотипом и электрофизиологические фенотип в предсердия. Это побуждает нас использовать генетически мышиной модели для выяснения механизма AF. Однако трудно оценить электрофизиологических свойств в мышиных предсердия вследствие их малого размера. Этот протокол описывает электрофизиологических оценки предсердия, с использованием системы оптического картирования с высоким временнóго и пространственного разрешения в Langendorff увлажненную мышиных сердцах. Системы оптических картирования собран с двойной высокоскоростной комплементарный металло-оксидный полупроводник камер и высокое увеличение объективов, чтобы обнаружить флуоресценции напряжения чувствительных красителя и Ca2 + индикатор. Сосредоточить внимание на оценке мышиных предсердия, оптические сопоставление выполняется с площадью 2 мм × 2 мм или 10 мм х 10 мм, с 100 × 100 пикселей (20 мкм/пиксель или 100 мкм/пиксель) и дискретизации до 10 кГц (0,1 мс) на максимум. 1-французский размер quadripolar электрод стимуляции катетер помещается в правое предсердие через верхней полой вены во избежание каких-либо механических повреждений в зимнем саду, и ходить стимуляции доставляется через катетер. Электрофизиологическое исследование выполняется с запрограммированной стимуляции, включая постоянной электрокардиостимуляции, ходить, и до тройной extrastimuli ходить. Спонтанное или ходить ритм оптических сопоставления записал потенциал действия продолжительность, активации карты, скорости проведения и Ca2 + переходных индивидуально в правого и левого предсердия. Кроме того запрограммированных стимуляции также определяет inducibility предсердий тахиаритмиями. Точной активации сопоставление выполняется для определения распространения возбуждения в зимнем саду во время индуцированные мерцательная тахиаритмия. Оптическая сопоставления с параметром специализированных позволяет тщательной оценки электрофизиологических атриум в мышиных моделях патологические.
Introduction
Сердце состоит из 4 камер, в млекопитающих. Верхних двух палат предсердия, и нижние желудочков. Желудочки работает как насос для извлечения системных или легочной циркуляции крови. Предсердия получают кровь, возвращающихся из системного или легочных вен и содействие в перевозке крови в желудочки для получения эффективного сердечного насоса функция. С электрофизиологических аспект важной функцией предсердий является для регулирования сердечного ритма. Электрические сигналы происходят из синусового узла, расположенного на стыке между верхней полой вены (SVC) и правого предсердия (РА), а затем распространить РА и левого предсердия (LA) и проводить желудочка через атриовентрикулярный узел и его Пуркинье проводящей системы.
Аритмии, которые являются нарушения сердечного ритма, подразделяются на предсердий и желудочков в зависимости от их происхождения. Фибрилляция предсердий (AF) является наиболее распространенной формой постоянной аритмии, характеризуется случайным и быстрого возбуждения предсердий. Недавние генетические анализы и исследования генома всей ассоциации (GWAS) показали связь между AF и генетические мутации или monopolymorphisms1,2,3,4. Эти заключения показывают что AF по крайней мере частично связан с генетические причины. Таким образом крайне важно для оценки генотип фенотип взаимодействий в предсердия, с использованием генетически животной модели. Широко признается, что мышь является наиболее авторитетных млекопитающих для генетической модификации.
Методику оптических сопоставления была разработана для оценки возбуждения ткани сердца. Однако наблюдение мышиных Атриум оптических сопоставлением затрудняется его относительно небольшой размер. Мы пытаемся достичь подробную оценку мышиных атриум с высоким временным и пространственным разрешением.
Protocol
Этот животных эксперимент был утвержден и осуществляется под регулирование институциональный уход животных и использование Комитета Токио медицинский и стоматологический университет.
1. Подготовка
- Акций решения
- Распустить напряжения чувствительных красители (ди-4-ANEPPS и RH237) и Ca2 + индикатор (кондицио-2 AM) с 100% диметилсульфоксида (ДМСО) чтобы сделать запасов растворов с концентрациями 6 мм, 10 мм и 10 мм, соответственно.
- Растворите возбуждения сокращение (E-C) uncoupler, blebbistatin, с 90% ДМСО сделать Стоковый раствор 50 мм.
- Аликвота акций решения в 0.2 мл ПЦР трубки в темной комнате и заменить воздух в складе трубки, используя газ азот, чтобы избежать окисления.
- Оберните складе труб в алюминиевой фольги индивидуально для защиты от света и хранить их в-20 градусов.
- Рабочие решения
- Подготовка 1 Л-фосфатный буфер (PBS) без Ca2 + (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 8.0 мм Na2HPO4и 1,5 мм х2PO4, pH регулируется NaOH 7.40)
- Подготовка 1 Л раствора в Tyrode (135 мм NaCl, 5.4 KCl, 1.8 мм2CaCl 0,53 MgCl2, 0,33 мм NaH2PO4, 5.5 мм D-глюкозы и 5,0 мм HEPES, рН 7.40, регулируется NaOH).
- Фильтр Tyrode в раствор с фильтром Топ бутылку 0,22 мкм и проветрить хорошо, пузырь аэрации, используя воздух камень, подключенных к O2 баллона.
2. оптические картирования в сердцах Langendorff увлажненную
- Соберите систему оптического сопоставления, используя две камеры комплементарный металло-оксидный полупроводник (CMOS) (рис. 1aи b)
- Соберите камеры CMOS, splitter луча, объективов, объектив револьвер, источник света, дихроичных зеркала, фильтры и другие части в системе оптических сопоставления, как показано на рисунке 1aи b.
- Выберите масштаб, изменив объектива в башни, с различных увеличениях (1.6 X и 5 X).
Примечание: Размер CMOS-датчик является 10 мм × 10 мм, с разрешением 100 × 100, что означает, что с 5 X объектив, эта система обеспечивает с пространственным разрешением 20 мкм. - Установите возбуждения света, с использованием светоизлучающих диодов (LED) лампой с длиной волны центр 530 нм, прошло через фильтр полосовой (520/35 Нм) и отражение с дихроичное зеркало (560 Нм).
- Запись сигнала выбросов, разделенных разделитель (665 нм), в котором настройки камеры 1 с длинным фильтр (697/75 Нм) обнаруживает флуоресцирования, с помощью мембраны напряжения чувствительных краситель (ди 4-ANEPPS или RH237) и камера 2 с полосовой фильтр (572/28 нм) обнаруживает сигнал Ca2 + индикатора (Rhod2-AM).
- Соберите Langendorff перфузии цепи
- Поливинилхлорид (ПВХ) трубы приложите перистальтического насоса.
- Поставил впускной стороне трубки ПВХ в Tyrode и решение пористый с 100% O2 , как указано в шаге 1.2.3.
- Подключите с напорной стороны трубы ПВХ для ручной воздуха ловушку, а затем организовать 5 мкм фильтром, трехходовые запорные краны, датчик давления, Отопление катушки стекла и 21-притупляются иглы (размер иглы меняется в соответствии с размером аорты) последовательно , используя другие трубы ПВХ.
- Заполните контур перфузии с Tyrode в решения, избегая любых воздушных пузырьков в цепи и остановить поток до тех пор, пока сердце подключена к цепи.
- Гепаринизация и анестезии
- Inject внутрибрюшинно нефракционированного гепарина (200 МЕ, независимо от веса тела) в мыши с помощью 25-иглы и шприца в 1-мл.
- Анестезировать мыши внутрибрюшинного введения Пентобарбитал (65 мг/кг) 10 мин после инъекции гепарина.
- Катетеризации и перфузии
- Поместите указатель мыши в лежачем положении. Подтвердите животных под наркозом, отсутствие реакции на носок пинча. Откройте брюшной стенки ниже уровня мечевидного отростка, с помощью ножниц. Сделать поперечный разрез в диафрагмы, вырежьте обе стороны ребра в средней подмышечной линии без каких-либо повреждений в сердце и флип вверх передней грудной стенки. Заранее Изогнутый пинцет за сердце и удерживайте нисходящей аорты, пищевода и нижней полой вены. Затем акцизных сердце с ножницами быстро вместе с прилегающих сосудов и тканей, например аорты, легких, трахеи, пищевода, жировой ткани и тимуса.
- Вымойте сердце с 10 мл ледяной PBS в чашке Петри и удалить прилегающих тканей.
- Ввести кончик 21-притупляются манометра подключен к схеме перфузии в восходящей части аорты и исправить ее с резьбой под стереомикроскопом.
- Начните perfuse с Tyrode в раствор, пористый с 100% O2сердце за 10 мин.
- Непрерывно контролировать перфузионного давления с датчика давления, подключены к усилителю и рекордер.
- Держите перфузионного давления между 80-100 мм рт.ст, (обычно соответствует 2-5 мл/мин скорость потока) во все следующие шаги.
- Во время начальной перфузии (шаг 2.4.4.), вставьте тонкий полиэтилен (ПЭ) труб (наружный диаметр: 0,8 мм) в SVC и исправить ее с потоком. Затем место сердце в камеру подогревом стекла (рис. 1b& c).
- Прокол иглой пребывает 24-го калибра (наружный диаметр: 0,7 мм) в полость левого желудочков (LV) через желудочков Апекс чтобы избежать повреждения атриум и удалить внутренний иглы оставляя внешнего канюли в LV.
- Ввести катетер электрод 1-французский размер пользовательских сделал через трубу PE в SVC для выполнения электростимуляции в РА. При необходимости, заранее катетер в правый желудочек (RV) для желудочковой ходить.
- Вставьте контактный электрода в желудочковой Апекс непрерывно записывать биполярного электрокардиограммы (ЭКГ) между ПИН электрода и катетеризации иглы в восходящей части аорты (рис. 1С).
- Продолжить мониторинг ЭКГ и перфузионного давления на протяжении всего исследования.
- Выключите свет и выполнить следующий эксперимент в темной комнате.
- Перейдите к шагу 2.5. для одной записи мембраны напряжения или 2.6. для записи двойной мембраны напряжения и Ca2 + преходящее.
- Пятнать для записи одного напряжения мембраны
- Поддерживать решения перфузии, нагревают при 37 ° c во время этой окрашивание протокол для записи одного напряжения мембраны.
- Разбавьте 8.3 мкл ди-4-ANEPPS раствор (6 мм) с 10 мл раствора Tyrode в (конечная концентрация составляет 5 мкм).
- Влить всего тома (10 mL) разбавленного раствора ди-4-ANEPPS в самом сердце через перфузии маршрут для 2-5 мин, затем размыва раствором Tyrode в течение 5 мин.
- Разбавьте 5 мкл blebbistatin раствор (50 мм) с 1 мл раствора в Tyrode (конечная концентрация составляет 250 мкм).
- Администрировать общий объем разреженных blebbistatin решения по маршруту перфузии.
- Пропустите шаг 2.6 и перейти к шагу 2.7 для размыва.
- Пятнать для двойной записи мембраны напряжения и Ca2 + переходные
- Держите Tyrode раствора при комнатной температуре.
Примечание: Эта первоначальная настройка температуры отличается от пятнать для одной записи мембраны напряжения (шаг 2.5.). - Администрирование blebbistatin таким же образом, как и шаги 2.5.4 и 2.5.5.
- Mix 3 мкл Rhod2AM раствор (10 мм) и 30 мкл оксиэтилированных polyoxypropylene блокировать сополимер F-127 (20% в ДМСО), а затем разбавляют смесь с 10 мл раствора в Tyrode.
- Загрузить общее количество Rhod2AM раствора (3 мкм) свыше 2-5 мин через тот же маршрут, как blebbistatin.
- Разбавьте 7 мкл RH237 раствор (10 мм) с 10 мл раствора в Tyrode.
- Управлять общее количество разбавленный раствор RH237 (7 мкм) свыше 2-5 мин.
- После завершения вышеупомянутой процедуры начинают Tyrode решение в 37 градусов тепла.
- Держите Tyrode раствора при комнатной температуре.
- Смыв
- Поддерживать температуру раствора Tyrode в 37 градусов в следующем эксперименте.
- Perfuse сердце с Tyrode в решение для по крайней мере 5 минут промыть чрезмерного красители.
Примечание: Существует не нужно увеличить скорость потока во время этой промывают шаг (обратитесь к шагу 2.4.6). - Подтвердите исчезновение любой артефакт движения из-за сужения и однородной окраски в самом перфузии.
- Отбор проб и анализ данных
- Наденьте Стекло покровное (25 × 60 мм) перфузии сердце тщательно, расплющивать предсердий поверхность без слишком много механического стресса и предотвратить движение артефакт от вибрации решения. Подтвердите, что Атриум придает Стекло покровное надлежащим образом.
- Запись флуоресценции CMOS камеры с выборки оценить до 0,1 мс для ди 4-ANEPPS и 1 мс для RH237 и Rhod2AM окрашивание.
- Проанализируйте полученные записи, с помощью анализа программного обеспечения, согласно инструкции производителя для фактического функционирования программного обеспечения.
- Создайте карту активации и кино после извлечения региона интерес, дрейф удаления, временной фильтрации и 3 X 3 биннинга5.
3. Электрофизиологические исследования
- Настройка pacing электродов и стимулятор
- Подтвердите контакт кончика на заказ ходить электрода в РА на ткани для стимуляции (обратитесь к шагу 2.4.9.).
- Доставить все ходить стимулы от стимуляции катетер, подключенных к программируемым стимулятор.
- Определение стимуляции порог
- Набор ходить интервал между 100 и 150 мс (пульс ширина 0,4 мс), избегая любых встроенных ритм, опережает уровень стимуляции.
- Доставить постоянной стимуляции стимуляции для по крайней мере 20 ударов для получения стабильной предсердий ходить.
- Установить выходной ходить на 5 МВ, затем постепенно сократить его до поставленного ходить не depolarize атриум.
- Подтверждения возбуждения предсердий наличием P волн в ЭКГ, и/или возбуждения предсердий сигнал записи оптических.
- Определите минимальное темпов вывода, который способен depolarize Атриум как порог стимуляции.
- Задайте вывод стимуляции для следующих исследований в два раза стимуляции порог.
- Постоянная и всплеск темпов
- Доставить постоянно ходить 99 ударов, с ходить интервал, начиная 150 мс, или длинный интервал, который избегает опережает внутренние ритм.
- Уменьшения интервала ходить постепенно с 5 мс шаги, вплоть до 40 мс или до достижения интервал, который не удается получить 1:1 захват атриум.
- Один extrastimulus ходить
- Установите ходить длину цикла основного диска (S1) 120 мс, 100 мс и 80 мс, если встроенные ритм опережает основные диск или ходить не добиться возбуждения предсердий 1:1.
- Задайте количество электрокардиостимуляции раздражители до 10 ударов для основных тяги.
- Установите первый extrastimulus (S2)-10 мс для длины базового цикла.
- Доставить S2 после последнего ходить стимул основного диска.
- Сократите интервал муфты S2 постепенно с 5 мс шаги, до тех пор, пока S2 не depolarize атриум.
- Как длинный интервал S2, который не depolarize Атриум определите эффективный рефрактерный период (ERP).
- Оцените ERP с по крайней мере 3 различных основных цикла длины оценить скорость адаптации ERP.
- Двойные и тройные extrastimuli электрокардиостимуляция побудить предсердий тахиаритмиями
- Сбросить интервал S2 к точке 20 мс за пределами ERP S2, если наблюдаются не аритмий.
- Добавьте второй extrastimulus (S3), начиная с одинаковым интервалом как S2.
- Уменьшите интервал муфты между S2 и S3 постепенно с 5 мс шаги до тех пор, пока S3 не depolarize атриум.
- Сбросить интервал S2 к точке 10 мс за пределами ERP, а затем повторите шаг 3.5.3.
- Сбросьте интервалы S2 и S3 очков 20 мс за пределами каждого ERP.
- Добавление третьего extrastimulus (S4), начиная с одинаковым интервалом как S3.
- Уменьшите интервал муфты между S3 и S4 постепенно с 5 мс шаги до тех пор, пока S4 не depolarize атриум.
- S3 интервал сброса к точке 10 мс за пределами ERP, а затем повторите шаг 3.5.7.
- Сбросить S2 и S3 интервалы пунктов 10 мс за пределами ERP, а затем повторите шаг 3.5.7.
- Определите inducibility предсердий тахиаритмиями воспроизводимые индукции, используя аналогично запрограммированных раздражители.
- Оценка inducibility предсердий тахиаритмиями
- Непрерывно запишите ЭКГ во всех протоколах стимуляции (шаг 3.3-3.5.).
- Выполняйте оптическое записи, во время и после каждого стимуляции, чтобы записать индукции предсердная тахикардия (AT) или повторяющихся предсердий ответ (RAR).
- Подтвердите воспроизводимость, применяя один и тот же ходить протокол при AF или RAR индуцируется.
Representative Results
Оптических карт являются эксперименты с использованием устройств, как показано на рисунке 1a. Схема оптической системы проиллюстрирована на рисунке 1b. Система обеспечивает высоким разрешением анализ мембранного потенциала и Ca2 + переходных в зимнем саду.
Как показано на рисунке 1 c и d, изолированные сердца позиционируется в контролируемой температурой камеры. Катетер 1-французский размер электрода помещается в РА через PE трубки вставляется в SVC, и еще пребывает PE трубки вставляется в полость LV от LV Апекс избежать чрезмерного давления на камеры сердца. Для одновременной записи ЭКГ, катода (свинец [-] ЭКГ) подключен к катетеризации иглы, и анода (свинец [+] ЭКГ) подключен к ПИН электрод вставляется в желудочковой Апекс. Особенность этой Ассамблеи, чтобы избежать каких-либо механических повреждений предсердий.
Для оценки напряжения мембраны флуоресценции с помощью ди-4-ANEPPS записывается с до 10 000 кадров в секунду дискретизации (рис. 2). Карта активации получается во время постоянной электрокардиостимуляции доставлены из РА. Тонкой сопоставления позволяет анализ шаблона подробной проводимости в небольших мышиных предсердия.
Рисунок 3 показывает представитель следы мембраны напряжений и Ca2 + переходных в Ла, используя RH237 и Rhod2AM во время постоянной электрокардиостимуляции от РА. Мы уменьшить дискретизации сопоставления для 1000 кадров/сек для получения достаточной соотношение сигнал/шум сигнала Rhod2AM с нынешней обстановке. Однако система обеспечивает достаточное качество для анализа взаимосвязи между потенциал действия и Ca2 + переходных.
Затем выполняем индукции мерцательная тахиаритмия с запрограммированной стимуляции с помощью мыши под патологического состояния. Рисунок 4 экспонатов оптической записи индуцированных в мышиных Атриум витражи с ди-4-ANEPPS. Мышь проходит процедура поперечной сужение аорты применить давление перегрузки в зимнем саду за 10 дней до эксперимента6. Мы вызвать AT, тройной extrastimuli ходить (120/100/100/80) и наблюдать за распространение реентерабельной цепи.
Рисунок 1. Система оптических картографирования. a. Генеральная Ассамблея электрофизиологии/оптической системы картирования. b. Схема состава системы оптических картирования: голубая стрелка указывает возбуждения света порожденных источника света. Объектива может быть обменен с башни. Излучаемый свет от окрашенных сердца делится между камерой 1 и камера 2. Камера 1 обнаруживает длинные волны сигналов для напряжения мембраны, камеры 2 записи и длин волн с полосовой фильтр 580 Нм ± 20 для Ca2 + преходящем. Во время процедуры ЭКГ и перфузионного давления непрерывно записываются, и сигнала ЭКГ также одновременно импортировать в оптических карта записи программного обеспечения. c. подготовка изолированных сердец: сердца канюлированной с затупленными иглой через восходящей части аорты для перфузии. Для одновременной записи ЭКГ катод подключен к катетеризации иглы, и анода с ПИН электрод вставляется в желудочковой Апекс. d. катетеризации трубки и электродов: сердце является канюлированной притупляются иглой 21-Калибруйте для перфузии (катетеризации иглы). 1-французский размер стимулирования электродов (электродов) помещается в правое предсердие через полиэтиленовые трубки вставляется в верхней полой вены. Палата стекло нагревается в 37 градусов подогреваемой водой, циркулирующей в полости камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Активация карты в атриуме. а. представитель активации карты в представлении передней с 5 X объектив и б. в представлении задняя с 1,6 X объектив. (Левая панель) Схема изолированные сердца и атриум. (Правая панель) Активация карты левого предсердия, полученные с ди-4-ANEPPS окрашивания на 10 000 кадров в секунду. Запись выполняется под постоянной электрокардиостимуляции с стимулирующих электродов, помещены в правое предсердие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Двойная запись потенциал действия и Ca2 + преходящее в левое предсердие. a. схема изолированные сердца. b. представитель изображение интенсивности флуоресценции в левое предсердие, используя RH237 для мембраны напряжения (Vm) и Rhod2AM для Ca2 + преходящем. Запись проводится с 5 X объектив на 1000 кадров/s. c. Одновременная запись ЭКГ (вверху), RH237 сигнала (в середине) и Rhod2AM сигнал (внизу), во время постоянной электрокардиостимуляции с электрод стимуляции в правое предсердие. Черные стрелки указывают стимуляции шипы и Желтые стрелки возбуждения желудочков. Рассеяние света эффект из желудочка также можно наблюдать (Желтые стрелки) как в RH237 и Rhod2AM сигнал. d. Объединенный RH237 и Rhod2AM следа. Потенциал действия и переходных Ca2 + изменения записываются одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Активация сопоставления во время предсердная тахикардия. (Левая панель) Схема изолированные сердца. (Средний панель) Карта активации во время предсердная тахикардия (AT). AT было вызвано тройной extrastimuli ходить из правого предсердия. (Правая панель) Карта активации во время синусовый ритм в самом же мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные фильм 1. Представитель фильм мембранного потенциала в атриуме с помощью окрашивания с ди-4-ANEPPS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные фильм 2. Представитель фильмы активации сопоставления во время предсердная тахикардия и синуса ритм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Оптическая сопоставления является устоявшейся маневр для изучения сердечной электрофизиологии7и является весьма полезным инструментом для оценки не только желудочковых аритмий8,9, но также мерцательной10,11 . Одновременное отображение трансмембранного потенциала и Ca2 + транзиентов полезно для понимания основных механизмов аритмии, сердечная недостаточность и другие болезни сердца12,13. При сравнении другие методы электрофизиологических оценки, например, с использованием на одну ячейку или ячейки листа, один из абсолютного превосходства оптических карт в самом перфузии является оценка шаблоне проводимости в нетронутыми атриум и желудочка, не только во время синусовый ритм, но и во время индуцированной аритмий14. Попытка использовать мышиных сердца, особенно Атриум, как суррогат людей трудности главным образом из-за их небольшого размера, однако, мышь является привлекательным экспериментальной модели с точки зрения оценки в генетически животных модель и эта проблема должна быть преодолены. Наш подход обеспечивает в одном направлении, чтобы разрешить его.
Хотя наши оптические сопоставления аппарат был в основном аналогична обычной системой для всей мышиных сердца15, наш метод имеет преимущество оценки мышиных Атриум, сделав некоторые изменения к нему. Во-первых мы стремились добиться высокого пространственного и временного разрешения до 0,1 мс/рама и 20 мкм/пиксель, и это с высоким разрешением сопоставление, способствовали более точное измерение проводимости скорости и распространения шаблона в мышиных атриум. Во-вторых чтобы избежать любого ненужного механических повреждений или растягивать Атриум, который может изменить электрофизиологических свойств 16,17, пребывает игла вводится непосредственно в LV для снижения давления внутри камеры, Вместо вставки через Ла, как в предыдущие исследования15. Кроме того ходить стимула доставляется через катетер пользовательских сделал 1-французский размер электрода помещается в РА, но не иглы электродом, который может травмировать атриум. Любые контакты избегаются при установлении предсердий придаток, которые использовались в прошлом исследования15. В-третьих с точки зрения оценки базового механизма аритмий, запрограммированных стимуляции протокол побудить предсердий тахиаритмиями — решающее значение18,19. Мы выполняем запрограммированных стимуляции идентична в клинических электрофизиологических исследований, включая взрыв ходить и до тройной extrastimuli электрокардиостимуляция, с модификацией ходить интервала для мыши сердца. Таким образом помимо базовых измерений параметров, протокол может оценить inducibility AT. При необходимости, inducibility AT оценивается с администрацией isoproterenol или других наркотиков. По нашему опыту мышах одичал тип вряд ли показать любую САР даже после полной стимуляции протокол. Таким образом inducibility AT должны быть важную информацию для оценки вклада ряда патологических условий, таких как генетические мутации, хирургические вмешательства и отправления наркотиков11. Эти изменения могут оптимизировать точные электрофизиологический оценки в нетронутыми мышиных атриум.
Этот метод также имеет некоторые ограничения. Во-первых, используя максимальное пространственное разрешение с 5 X объектив, поле зрения (FOV) ограничивается частью Атриум (т.е. только левого предсердий придаток, как показано на рисунке 2А). Для получения более крупных ПЗ Атриум, 1.6 X объектив иногда является предпочтительным (рис. 2b). Во-вторых без фиксации атриум с булавками, иногда это трудно измерить предсердий проводимости свойства правильно, потому что предсердная поверхность искривляется. Таким образом мы разместили стекла покрытия на его поверхности, чтобы сгладить это вместо фиксации булавками. Этот метод также полезен для предотвращения артефактов движения от вибрации решения. В-третьих, с нашим методом, это довольно трудно получить весь ПЗ, так, чтобы правильно использовать передний и задний вид более важна в наш подход, чем в другой подход, как показано на рисунке 2. Преимущество спереди бы четкое наблюдение спускаемого в случае патологических состояний, особенно в довесок (рис. 4). С другой стороны представление задняя имеет преимущество получения хорошее представление о мерцательной задней стенки и может быть подробную запись запуска активности миокарда рукав. Когда это трудно получить соответствующее представление и придавить его криволинейной поверхности с нашим методом, Атриум может быть исправлено с минимальным напряжение булавками.
С нашего метода есть 3 возможные проблемы, неудачи окрашивание, ходить, и аритмии индукции. За провал окрашивание, если нет или наблюдается небольшое флуоресценции, вы должны проверить ли оптических сопоставления аппарат правильно смонтирован, и ли реагент надлежащим образом хранится и используется. Состояние перфузии решения также важно, который также может повлиять на электрофизиологических свойств самого сердца, так что, состояние решения, включая рН, температуры, и существует ли достаточно аэрации должна строго контролироваться. Важно также избежать каких-либо воздушных эмболии в самом сердце. Для электрокардиостимуляции провал, если ходить стимулы не возбуждают Атриум, исследователи должны проверить ли проводки правильно с помощью тестера цепи. Когда ходить раздражители правильно выводятся, проблема контакта электродов с ткани. Изменение расположения электродов может решить эту проблему, и наш подход с использованием ходить катетер делает его легко. Трудности в индукции аритмии RV ходить может использоваться для индукции AT в некоторых ограниченных случаях. С помощью quadripolar электрод катетер из которых дистальной двух электродов и проксимальной электроды могут быть расположены в RV и РА, соответственно, это легко изменить ходить сайта от РА для RV. Этот катетер полезен также для смены возбуждения желудочков при одновременной желудочков активации сигнала маски сигнала возбуждения предсердий.
Этот метод будет способствовать оценке генотип фенотип взаимодействий в AF связанных генов, вновь обретенной Роман исследований, таких как GWAS, особенно для генов, с которыми в ходе расследования не показать их на другие подходы. С прогрессом в области приборов и методов электрофизиологические свойства легочной вены рукав, который является важным источником AF20, могут оцениваться в самом нетронутыми с этим подходом.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается программой для совершенствования исследовательской среды для молодых исследователей из специальных фондов координации для поощрения науки и техники (SCF) (для т.с.), дотаций для научных исследований (№ 16K 09494, т.с., № 26293052, для т.ф.) от министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ) Японии. Мы высоко ценим Brainvision и г-н Кендзи Tsubokura для оказания технической помощи, и мы также признательны г-н Джон Мартин для его языковой помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
