Summary
Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.
Abstract
Recenti studi di associazione genome-wide targeting per la fibrillazione atriale (AF) hanno indicato una forte associazione fra il genotipo ed il fenotipo elettrofisiologico negli atrii. Che ci incoraggia ad utilizzare un modello di topo geneticamente per delucidare il meccanismo di AF. Tuttavia, è difficile valutare le proprietà elettrofisiologiche in atri murini grazie alle loro piccole dimensioni. Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii utilizzando un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale nei cuori murini Langendorff irrorati. Il sistema di mappatura ottico è assemblato con ossido di metallo complementare ad alta velocità dual semiconductor fotocamere e lenti dell'obiettivo ad alto ingrandimento, per rilevare la fluorescenza di un colorante tensione-sensibili e Ca2 + indicatore. Per concentrarsi sulla valutazione degli atrii murini, ottico mapping viene eseguito con una superficie di 2 × 2 mm o 10 mm x 10 mm, con un 100 × 100 ad alta risoluzione (20 µm/pixel o 100 µm/pixel) e frequenza di campionamento fino a 10 kHz (0.1 ms) al massimo. Un elettrodo quadripolar 1-francese dimensioni catetere di stimolazione è collocato nell'atrio destro attraverso la vena cava superiore evitando danni meccanici all'atrio, e la cadenza di stimolazione è trasportata attraverso il catetere. Uno studio elettrofisiologico viene eseguito con stimolazione programmata tra cui cadenza costante, burst pacing e fino a tripla extrastimuli stimolazione. In modo spontaneo o cadenza ritmica, la mappatura ottica registrata la durata del potenziale d'azione, mappa di attivazione, velocità di conduzione e Ca2 + transitoria individualmente negli atri destro e sinistro. Inoltre, la stimolazione programmata determina anche la 270ms dei tachyarrhythmias atriali. Mappatura precisa attivazione viene eseguita per identificare la propagazione dell'eccitazione nell'atrio durante una tachiaritmia atriale indotta. Ottica mapping con un ambiente specializzato consente un'approfondita valutazione elettrofisiologica dell'atrio in modelli murini di patologie.
Introduction
Il cuore è costituito da 4 camere in mammiferi. Le due camere superiori sono atri e quelle inferiori sono i ventricoli. Ventricoli funzionano come una pompa per espellere sangue alla circolazione sistemica o polmonare. Atri ricevono il sangue che ritorna dalle vene polmonari o sistemiche e assistono al trasporto del sangue nei ventricoli per ottenere una funzione di pompa cardiaca efficiente. Da un aspetto elettrofisiologico, l'importante funzione degli atrii è di regolare il ritmo cardiaco. I segnali elettrici hanno origine dal nodo del seno che si trova alla giunzione fra la vena cava superiore (SVC) e l'atrio destro (RA), quindi propagano il RA e l'atrio sinistro (LA) e conducono al ventricolo attraverso il nodo atrioventricolare e il suo-Purkinje sistema di conduzione.
Aritmia, che sono disturbi del ritmo cardiaco, sono classificate in atriali e ventricolari secondo la loro origine. La fibrillazione atriale (AF) è la forma più comune sostenuta di un'aritmia, caratterizzata da un'eccitazione rapida e casuale degli atrii. Recenti analisi genetiche e studi di associazione genome-wide (GWAS) hanno dimostrato l'associazione tra AF e mutazioni genetiche o monopolymorphisms1,2,3,4. Questi risultati indicano che AF è almeno in parte associato con una causa genetica. Pertanto, è fondamentale per valutare le interazioni genotipo-fenotipo negli atrii utilizzando un modello animale geneticamente. È ampiamente accettato che il mouse è il mammifero più affermato per la modificazione genetica.
La tecnica di mappatura ottico è stata sviluppata per valutare l'eccitazione del tessuto del cuore. Tuttavia, l'osservazione dell'atrio murino da ottico mapping è ostacolata dalla sua dimensione relativamente piccola. Tentiamo di realizzare una valutazione dettagliata dell'atrio murino con un'alta risoluzione temporale e spaziale.
Protocol
Questo esperimento sugli animali è stato approvato ed eseguito ai sensi del regolamento della istituzionale Animal Care e uso Comitato di Tokyo Medical and Dental University.
1. preparazione
- Soluzioni di riserva
- Sciogliere i coloranti di tensione-sensibili (di-4-ANEPPS e RH237) e Ca2 + indicatore (Rhod-2 AM) con 100% di dimetilsolfossido (DMSO) per fare soluzioni di riserva con le concentrazioni di 6 mM, 10 mM e 10 mM, rispettivamente.
- Sciogliere il disaccoppiatore di eccitazione-contrazione (E-C), blebbistatin, con 90% DMSO per rendere una soluzione stock di 50 mM.
- Aliquotare le soluzioni di riserva in un 0,2 mL PCR tubo in una stanza buia e sostituire l'aria nel tubo d'archivio utilizzando gas di azoto per evitare l'ossidazione.
- Avvolgere i tubi d'archivio in un foglio di alluminio individualmente per protezione dalla luce e conservare a-20 ˚ c.
- Soluzioni di lavoro
- Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) senza Ca2 + (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4e 1,5 mM KH2PO4, pH 7,40 regolato da NaOH)
- Preparare 1 L di soluzione di Tyrode (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosio e 5,0 mM HEPES, pH 7,40 regolato da NaOH).
- Filtrare la soluzione di Tyrode con un filtro di 0,22 µm bottiglia superiore e aerilo bene da aerazione bolla usando una pietra di aria collegato ad una bombola di gas O2 .
2. ottico mappatura nei cuori irrorati Langendorff
- Assemblare il sistema di mappatura ottico utilizzando due telecamere di semiconductor (CMOS) di ossido di metallo complementare (Figura 1a& b)
- Montare le telecamere CMOS, divisore di fascio, lenti dell'obiettivo, obiettivo revolver, fonte di luce, specchi dicroici, filtri e altre parti nel sistema ottico mappatura come mostrato in Figura 1a& b.
- Selezionare l'ingrandimento modificando la lente dell'obiettivo in una torretta, attrezzata con diversi ingrandimenti (1.6 X e 5x).
Nota: La dimensione del sensore CMOS è 10 mm × 10 mm, con una risoluzione di 100 × 100, che significa, con obiettivo 5x, questo sistema fornisce una risoluzione spaziale di 20 µm. - Impostare la luce di eccitazione utilizzando una lampada diodo luminoso (LED) con una lunghezza d'onda concentrare di 530 nm, passata attraverso un filtro passa-banda (520/35 nm) e riflette con uno specchio dicroico (560 nm).
- Registrare il segnale di emissione diviso da uno splitter (665 nm), filtro passa-in quale impostazione fotocamera 1 con una lunga (697/75 nm) rileva la fluorescenza usando una tintura di membrana voltaggio-dipendenti (di 4-ANEPPS o RH237) e fotocamera 2 con un filtro passa-banda (572/28 nm) rileva la segnale dell'indicatore del Ca2 + (Rhod2-AM).
- Montare il circuito di perfusione di Langendorff
- Collegare tubi in cloruro di polivinile (PVC) di una pompa peristaltica.
- Mettere il lato di aspirazione del tubo in PVC nella soluzione di Tyrode aerato con 100% O2 come indicato al punto 1.2.3.
- Collegare il lato di scarico del tubo del PVC a una trappola aria fatti a mano, quindi disporre il 5 µm filtro, rubinetto a tre vie, trasduttore di pressione, riscaldamento bobina di vetro e ago smussata da 21 gauge (la dimensione dell'ago è variabile secondo le dimensioni dell'aorta) in sequenza , utilizzando altri tubi di PVC.
- Riempire il circuito di perfusione con soluzione di Tyrode evitando eventuali bolle d'aria nel circuito e fermare il flusso fino a quando il cuore è collegato al circuito.
- Eparinizzazione e anestesia
- Iniettare l'eparina non frazionata (200 IU, indipendentemente dal peso corporeo) intraperitonealmente in un mouse utilizzando un calibro 25 ago e siringa da 1 mL.
- Anestetizzare il mouse tramite un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (65mg/kg) 10 min dopo l'iniezione di eparina.
- Inserimento di una canula e perfusione
- Posizionare il mouse nella posizione supina. Confermare gli animali è anestetizzati da mancanza di risposta alla punta pizzico. Aprire la parete addominale sotto il livello del processo xifoideo usando le forbici. Fare un'incisione trasversale nel diaframma, tagliare entrambi i lati delle nervature nella linea ascellare mediale senza alcun danno al cuore e capovolgere la parete di cassa anteriore verso l'alto. Fare avanzare la pinza curva dietro il cuore e conservare l'aorta discendente, esofago e vena cava inferiore. Quindi, asportare il cuore con le forbici rapidamente insieme ai vasi adiacenti e il tessuto, come l'aorta, polmoni, trachea, esofago, tessuti adiposi e timo.
- Lavare il cuore con 10 mL di PBS ghiacciata in una capsula Petri e rimuovere il tessuto adiacente.
- Introdurre la punta dell'ago blunted 21-manometro collegato al circuito di perfusione in aorta ascendente e fissarla con filo sotto un microscopio stereoscopico.
- Iniziare a irrorare il cuore per 10 min con soluzione di Tyrode aerato con 100% O2.
- Monitorare la pressione di perfusione continuamente con il trasduttore di pressione collegato all'amplificatore e registratore.
- Mantenere la pressione di perfusione tra 80-100 mmHg (solitamente corrispondente a 2-5 mL/min per la velocità di flusso) durante tutti i passaggi seguenti.
- Durante la perfusione iniziale (punto 2.4.4.), inserire il tubo sottile in polietilene (PE) (diametro esterno: 0,8 mm) in SVC e fissarlo con un thread. Poi, posto il cuore nella camera di vetro riscaldato (Figura 1b& c).
- Puntura di un ago 24-interiore (diametro esterno: 0,7 mm) nella cavità di ventricolare sinistra (LV) attraverso l'apice ventricolare per evitare eventuali danni all'atrio e rimuovere l'ago interno lasciando la cannula esterna in LV.
- Introdurre un catetere elettrodo 1-francese formato personalizzato fatto attraverso il tubo di PE nello SVC per eseguire la stimolazione elettrica in RA. Se necessario, far avanzare il catetere nel ventricolo di destro (RV) per la stimolazione ventricolare.
- Inserire un elettrodo pin all'apice ventricolare per registrare continuamente i bipolari elettrocardiogrammi (ECG) tra l'ago elettrodo e inserimento di una canula di perno nell'aorta ascendente (Figura 1C).
- Continuare a monitorare l'ECG e l'aspersione pressione durante l'intero studio.
- Spegnere la luce ed eseguire il seguente esperimento in una stanza buia.
- Andare al punto 2.5. per una singola registrazione di tensione della membrana o 2.6. per una doppia registrazione della tensione della membrana e Ca2 + transitori.
- Colorazione per una singola registrazione della tensione della membrana
- Mantenere la soluzione di perfusione riscaldata a 37 ˚ c durante questo protocollo di colorazione per una singola registrazione della tensione della membrana.
- Diluire 8,3 µ l della soluzione madre di-4-ANEPPS (6 mM) con 10 mL di soluzione di Tyrode (la concentrazione finale è di 5 micron).
- Infondere il volume totale (10 mL) della soluzione diluita di-4-ANEPPS in cuore la via della perfusione per 2-5 min, seguita da un lavaggio con soluzione di Tyrode per 5 min.
- Diluire 5 µ l di soluzione di riserva blebbistatin (50 mM) con 1mL di soluzione di Tyrode (la concentrazione finale è 250 µM).
- Amministrare l'importo totale della soluzione diluita blebbistatin la via della perfusione.
- Saltare punto 2.6 e procedere al punto 2.7 per dilavamento.
- Colorazione per una doppia registrazione della tensione della membrana e Ca2 + transitori
- Mantenere la soluzione di Tyrode a temperatura ambiente.
Nota: Questa impostazione iniziale della temperatura è diversa da quello della colorazione per una singola registrazione della tensione di membrana (passo 2.5.). - Amministrare la blebbistatin nello stesso modo come in passaggi 2.5.4 e 2.5.5.
- Mix 3 µ l di soluzione madre di Rhod2AM (10 mM) e 30 µ l di poliossietilene-poliossipropilene F-127 (20% in DMSO) copolimero a blocchi, quindi stemperate il composto con 10 mL di soluzione di Tyrode.
- Caricare la quantità totale di soluzione Rhod2AM (3 µM) oltre il 2-5 min la stessa via come il blebbistatin.
- Diluire 7 µ l di soluzione di riserva di RH237 (10 mM) con 10 mL di soluzione di Tyrode.
- Amministrare l'importo totale della soluzione diluita di RH237 (7 µM) oltre 2-5 min.
- Dopo il completamento della procedura di cui sopra, iniziare a riscaldare la soluzione di Tyrode a 37 ˚ c.
- Mantenere la soluzione di Tyrode a temperatura ambiente.
- Washout
- Mantenere la temperatura della soluzione di Tyrode a 37 ˚ c nel seguente esperimento.
- Irrorare il cuore con soluzione di Tyrode per almeno 5 min lavare fuori i coloranti eccessivi.
Nota: Non esiste alcuna necessità di aumentare il tasso di flusso durante questo lavaggio fuori passo (vedere il passaggio 2.4.6.) - Confermare la scomparsa di qualsiasi manufatto di movimento a causa di contrazioni e la colorazione omogenea nel cuore irrorato.
- Campionamento e analisi dei dati
- Mettere il vetro di copertura (25 mm × 60 mm) cuore irrorato con grande cura, per appiattire la superficie atriale senza troppo stress meccanico e prevenire artefatto movimento dalle vibrazioni della soluzione. Confermare che l'atrio attribuisce per il vetro di copertura in modo appropriato.
- Registrare la fluorescenza dalle telecamere CMOS con un campionamento votare fino a 0.1 ms per di 4-ANEPPS e 1 ms per la RH237 e la Rhod2AM di colorazione.
- Analizzare le registrazioni ottenute utilizzando il software di analisi, secondo le istruzioni del produttore per l'effettivo funzionamento del software.
- Creare una mappa di attivazione e il film dopo l'estrazione della regione di interesse, rimozione di drift, filtro temporale e 3x3 binning5.
3. studio elettrofisiologico
- Impostazione di elettrodi di stimolazione e stimolatore
- Confermare il contatto della punta dell'elettrodo stimolazione su misura nella RA al tessuto per stimolazione (fare riferimento al passaggio 2.4.9.).
- Fornire stimoli tutti stimolazione dal catetere stimolazione collegato allo stimolatore programmabile.
- Determinazione della soglia di stimolazione
- Imposta un intervallo di stimolazione tra 100 e 150 ms (larghezza di impulso di 0,4 ms), evitando qualsiasi ritmo intrinseco superando il tasso di stimolazione.
- Erogare la stimolazione costante stimolazione per almeno 20 battiti ottenere una stabile pacing atriale.
- Impostare il ritmo uscita a 5 mV, quindi ridurre gradualmente fino a errore della stimolazione consegnati a depolarizzarsi l'atrio.
- Confermare l'eccitazione atriale dalla presenza di onde P all'ECG e/o un segnale di eccitazione atriale di registrazione ottica.
- Determinare il minimo output è in grado di depolarizzarsi l'atrio come la soglia di stimolazione di stimolazione.
- Impostare la stimolazione per i seguenti studi a due volte la soglia di stimolazione.
- Costante e stimolazione burst
- Consegnare la cadenza costante per 99 battiti, con un intervallo di stimolazione a partire da 150 ms, o l'intervallo più lungo che evita superando il ritmo intrinseco.
- Ridurre l'intervallo di stimolazione progressivamente con step di 5 ms, fino a 40 ms o fino a raggiungere l'intervallo che non riesce a ottenere 1:1 acquisizione dell'atrio.
- Singolo extrastimulus cadenza
- Impostare la lunghezza di ciclo di stimolazione dell'unità base (S1) su 120 ms, 100 ms e ms 80 a meno che il ritmo intrinseco supera l'unità di base o il pacing non riesce a ottenere eccitazione atriale 1:1.
- Impostare il numero di stimoli a 10 battiti per il treno di unità base di stimolazione.
- Impostare il primo extrastimulus (S2)-10 ms per tutta la durata del ciclo di base.
- Consegnare S2 dopo l'ultimo stimolo stimolazione dell'unità base.
- Accorciare l'intervallo di accoppiamento di S2 progressivamente con step di 5 ms, fino a quando la S2 non riesce a depolarizzarsi l'atrio.
- Determinare l'efficace periodo refrattario (ERP) come l'intervallo più lungo di S2 che non riesce a depolarizzarsi l'atrio.
- Valutare l'ERP con almeno 3 ciclo di base differenti lunghezze per valutare l'adattamento di tasso dell'ERP.
- Doppie e triple extrastimuli stimolazione per indurre tachyarrhythmias atriali
- Reimpostare l'intervallo S2 a un punto di 20 ms fuori ERP di S2 se aritmia non è osservati.
- Aggiungere un secondo extrastimulus (S3), a partire con lo stesso intervallo S2.
- Ridurre l'intervallo di accoppiamento tra S2 e S3 progressivamente con step di 5 ms fino a S3 non riesce a depolarizzarsi l'atrio.
- Reimpostare l'intervallo di S2 ad un punto 10 ms fuori l'ERP, quindi ripetere il punto 3.5.3.
- Reimpostare gli intervalli S2 e S3 punti 20 ms fuori ogni ERP.
- Aggiungere un terzo extrastimulus (S4), a partire con lo stesso intervallo S3.
- Ridurre l'intervallo di accoppiamento tra S3 e S4 progressivamente con step di 5 ms fino a S4 non riesce a depolarizzarsi l'atrio.
- Reimpostare l'intervallo di S3 a un punto di 10 ms fuori l'ERP, quindi ripetere il passaggio 3.5.7.
- Reimpostare gli intervalli S2 e S3 a punti 10 ms fuori l'ERP, quindi ripetere il passaggio 3.5.7.
- Definire il 270ms dei tachyarrhythmias atriali tramite l'induzione riproducibile utilizzando stimoli allo stesso modo programmati.
- Valutazione di 270ms dei tachyarrhythmias atriali
- Continuamente registrare l'ECG durante tutti i protocolli di stimolazione (passo 3.3-3.5.).
- Eseguire le registrazioni ottiche durante e dopo ogni stimolo, per registrare l'induzione di tachicardia atriale (AT) o risposta atriale ripetitivo (RAR).
- Confermare la riproducibilità applicando lo stesso protocollo di stimolazione quando AF o un RAR è indotta.
Representative Results
Gli esperimenti di mappatura ottico vengono eseguiti utilizzando i dispositivi come mostrato in Figura 1a. Lo schema del sistema ottico è illustrato in Figura 1b. Il sistema fornisce un'analisi ad alta risoluzione del potenziale di membrana e Ca2 + transitoria nell'atrio.
Come raffigurato in Figura 1 c e d, il cuore isolato è posizionato in una camera a temperatura controllata. Un catetere di elettrodo di misura 1-francese viene inserito nella RA attraverso un tubo di PE inserito nel SVC e un altro tubo PE indwelling è inserito nella cavità LV dall'apice LV per evitare una pressione eccessiva sulla camera di cuore. Per una registrazione simultanea di ECG, il catodo (lead ECG [-]) è collegato all'ago di inserimento di una canula e l'anodo (cavo ECG [+]) è collegato all'elettrodo pin inserito all'apice ventricolare. La caratteristica di questa Assemblea è per evitare danni meccanici agli atrii.
Per la valutazione della tensione della membrana, fluorescenza usando di-4-ANEPPS è registrato con fino ad un tasso di campionamento di 10.000 fotogrammi/s (Figura 2). La mappa di attivazione è ottenuta durante la cadenza costante consegnato da RA. La mappatura fine consente l'analisi del modello dettagliato di conduzione in piccoli atri murini.
La figura 3 illustra rappresentante tracce delle tensioni di membrana e Ca2 + transitoria in LA utilizzando RH237 e Rhod2AM durante la cadenza costante da RA. Riduciamo la frequenza di campionamento di mapping da 1000 fotogrammi/s per ottenere un rapporto segnale/rumore sufficiente del segnale Rhod2AM con l'impostazione attuale. Tuttavia, il sistema fornisce una qualità sufficiente per analizzare il rapporto tra il potenziale d'azione e Ca2 + transitoria.
Quindi eseguiamo un'induzione di una tachiaritmia atriale con stimolazione programmate utilizzando topi sotto una condizione patologica. Figura 4 esibisce una registrazione ottica di un indotto AT in un atrio murino macchiato con di-4-ANEPPS. Il mouse subisce un procedimento di restringimento aortico trasversale per applicare un sovraccarico di pressione all'atrio di 10 giorni prima l'esperimento6. Abbiamo indurre AT extrastimuli tripla stimolazione (120/100/100/80) e osservare la propagazione del circuito rientrante.
Figura 1. Sistema ottico mapping. r. Assemblea generale del sistema di mappatura elettrofisiologia/ottico. b. schema della composizione del sistema ottico mappatura: la freccia blu indica la luce di eccitazione generata dalla sorgente luminosa. La lente dell'obiettivo possono essere scambiata con la torretta. La luce emessa dal cuore macchiato è diviso tra telecamera 1 e la telecamera 2. 1 la fotocamera rileva i segnali di lunghezza d'onda per la tensione di membrana, e fotocamera 2 registra le lunghezze d'onda con un filtro passa-banda di 580 ± 20 nm per il transitorio2 + Ca. Durante la procedura, l'ECG e l'aspersione pressione vengono registrati continuamente, e il segnale ECG è anche contemporaneamente importato nella mappa dell'ottica software di registrazione. c. preparazione dei cuori isolati: I cuori sono cannulati con un ago smussato tramite aorta ascendente per aspersione. Per registrazioni simultanee di ECG, il catodo è collegato all'ago di inserimento di una canula e l'anodo con l'elettrodo a perno viene inserito l'apice ventricolare. d. tubo di inserimento di una canula e gli elettrodi: il cuore è cannulato con un ago di calibro 21 smussato per aspersione (ago di inserimento di una canula). Una dimensione di 1-francese stimolando elettrodo (elettrodo) è collocata nell'atrio di destra attraverso un tubo di polietilene inserito nella vena cava superiore. La camera di vetro è riscaldata a 37 ˚ c da circolazione nella cavità della camera dell'acqua riscaldata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Mappa di attivazione nell'atrio. r. rappresentante attivazione mappe nella vista anteriore con obiettivo 5x e b. la vista posteriore con un 1,6 X lente obiettiva. (Pannello sinistro) Disegno schematico del cuore isolato e atrio. (Pannello di destra) Mappa di attivazione dell'atrio sinistro ottenuta con di-4-ANEPPS colorazione a 10.000 fotogrammi/s. La registrazione viene eseguita sotto stimolazione costante con l'elettrodo stimolante collocato nell'atrio di destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Doppia registrazione del potenziale d'azione e Ca2 + transitori in atrio sinistro. r. schematica del cuore isolato. b. immagine rappresentativa dell'intensità della fluorescenza nell'atrio di sinistra usando RH237 per la tensione di membrana (Vm) e Rhod2AM per i transienti del Ca2 + . La registrazione viene eseguita con un obiettivo di obiettivo X 5 a 1.000 fotogrammi/s. c. Registrazione simultanea del ECG (in alto), segnale di RH237 (al centro) e Rhod2AM segnale (in basso), durante la cadenza costante con l'elettrodo di stimolazione nell'atrio di destra. Le frecce nere indicano i picchi di stimolazione e frecce gialle l'eccitazione ventricolare. Un effetto di dispersione della luce dal ventricolo anche possa essere osservato (frecce gialle) sia nel segnale di RH237 e Rhod2AM segnale. d. una traccia unita RH237 e Rhod2AM. Il potenziale d'azione e Ca2 + cambiamenti transitori sono registrati simultaneamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Mappatura di attivazione durante la tachicardia atriale. (Pannello sinistro) Disegno schematico del cuore isolato. (Pannello centrale) Mappa di attivazione durante una tachicardia atriale (AT). AT è stata indotta da stimolazione tripla extrastimuli consegnato dall'atrio di destra. (Pannello di destra) Mappa di attivazione durante ritmo sinusale nel cuore stesso del mouse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film supplementare 1. Film rappresentativi della membrana potenziale nell'atrio usando la macchiatura con di-4-ANEPPS. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Film supplementare 2. Film rappresentativo del mapping dell'attivazione durante il ritmo del seno e della tachicardia atriale. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Mappatura ottico è una manovra ben consolidata per studiare l' elettrofisiologia cardiaca7ed è uno strumento molto utile per valutare non solo le aritmia ventricolari8,9, ma anche quelli atriale10,11 . Simultanea mappatura del potenziale transmembrana e transitori di Ca2 + è utile per comprendere i meccanismi alla base delle aritmie in relazione di infarto e altre malattie di cuore12,13. Quando si confrontano gli altri metodi di valutazione elettrofisiologica, come quelli che usano una singola cella o strato di cellule, uno della superiorità assoluta della mappatura ottico nel cuore irrorato è la valutazione del modello di conduzione nell'atrio intatta e ventricolo, non solo durante il ritmo sinusale, ma anche durante aritmie indotte14. Un tentativo di utilizzare cuori murini, soprattutto l'atrio, come un surrogato degli esseri umani ha incontrato difficoltà principalmente a causa del loro di piccola dimensione, tuttavia, il mouse è un modello sperimentale interessante in termini di valutazione in un animale geneticamente modello e questo problema deve essere superata. Il nostro approccio fornisce una direzione per risolverlo.
Anche se il nostro apparato ottico mappatura era sostanzialmente simile al sistema convenzionale per intero murino cuori15, il nostro metodo ha il vantaggio di valutare l'atrio murino apportando alcune modifiche ad esso. In primo luogo, abbiamo perseguito per ottenere un'elevata risoluzione spaziale e temporale di fino a 0.1 ms/telaio e 20 µm/pixel e questa mappatura ad alta risoluzione ha contribuito a una misura più precisa del modello di velocità e propagazione di conduzione nell'atrio murino. In secondo luogo, per evitare inutili danni meccanici o tratto dell'atrio, che poteva alterare le proprietà elettrofisiologiche 16,17, un interiore dell'ago viene inserito direttamente nel LV per ridurre la pressione intra-alloggiamento, invece di inserirlo attraverso la LA interpretato nel precedente studio15. Inoltre, lo stimolo di stimolazione viene recapitato attraverso un custom made 1-francese dimensioni elettrodo catetere disposto nella RA, ma non da un elettrodo ad ago, che potrebbero ferire l'atrio. I pin sono evitati nel fissare l'annesso atriale, che sono stati usati nel passato Studio15. In terzo luogo, in termini di valutazione del meccanismo sottostante delle aritmie, un protocollo di stimolazione programmate per indurre tachyarrhythmias atriali è cruciale18,19. Eseguiamo identico a quello stimolo programmato negli studi clinici elettrofisiologici, tra cui burst pacing e fino a extrastimuli tripla stimolazione, con una modifica dell'intervallo di stimolazione per il cuore del mouse. Così, oltre ai parametri di misurazione della linea di base, il protocollo potrebbe valutare la 270ms della AT. Quando necessario, 270ms della AT è valutato con l'amministrazione di isoproterenolo o altri farmaci. Nella nostra esperienza, i topi wild-type appena mostrano qualsiasi ATs anche dopo un protocollo di stimolazione completo. Così, il 270ms di AT dovrebbero essere informazioni importanti per valutare il contributo di diverse condizioni patologiche quali mutazioni genetiche, le procedure chirurgiche e la somministrazione di farmaci11. Tali modifiche potrebbero ottimizzare la valutazione elettrofisiologica precisa nell'atrio murino intatto.
Questo metodo ha anche alcune limitazioni. In primo luogo, con una massima risoluzione spaziale con una lente di obiettivo X 5, il campo visivo (FOV) è limitato ad una parte dell'atrio (cioè. solo l'auricola sinistra come mostrato in Figura 2a). Per ottenere il FOV più grande dell'atrio, un obiettivo X 1,6 è a volte preferibile (Figura 2b). In secondo luogo, senza l'atrio di fissaggio con perni, a volte è difficile misurare le proprietà di conduzione atriale correttamente, perché la superficie atriale è curvo. Così, abbiamo messo il vetro di copertura sulla sua superficie per appiattirla invece di risolverlo tramite perni. Questo metodo è anche utile per prevenire artefatto movimento dalle vibrazioni della soluzione. In terzo luogo, con il nostro metodo, è abbastanza difficile ottenere il FOV intero di esso, quindi, di utilizzare correttamente la vista anteriore e posteriore è più importante nel nostro approccio rispetto all'altro approccio, come mostrato nella Figura 2. Il vantaggio della vista anteriore sarebbe la chiara osservazione di rientro in caso di condizioni patologiche, soprattutto nell'annesso (Figura 4). D'altra parte, la vista posteriore ha un vantaggio di ottenere una buona vista della parete atriale posteriore e potrebbe essere una registrazione dettagliata di innescare attività dal manicotto del miocardio. Quando è difficile ottenere una visualizzazione appropriata e per appiattire la sua superficie curva con il nostro metodo, l'atrio può essere fissato con tensione minima di perni.
Con il nostro metodo, ci sono 3 possibili problemi, errore di colorazione, la cadenza e induzione di aritmia. Per errore di colorazione, se nessuna o lieve fluorescenza si osserva, si dovrebbe verificare se l'apparecchiatura di mappatura ottica è montata correttamente, e se il reagente è adeguatamente memorizzato e utilizzato. La condizione della soluzione perfusione è anche cruciale, che può colpire anche le proprietà elettrofisiologiche del cuore stesso, così, la condizione di soluzione incluso il pH, temperatura, e se c'era sufficiente aerazione deve essere strettamente monitorati. È inoltre importante evitare qualsiasi aria gli emboli nel cuore. Per stimolazione fallimento, se gli stimoli pacing non possono eccitare l'atrio, i ricercatori dovrebbero verificare se il cablaggio è corretto con un tester di circuito. Quando gli stimoli pacing outputted correttamente, il problema è il contatto dell'elettrodo con il tessuto. Riposizionamento degli elettrodi in grado di risolvere il problema, e il nostro approccio utilizzando il catetere stimolazione lo rende facile. Per difficoltà nell'induzione di aritmia, RV stimolazione può essere utilizzato per l'induzione di un AT in alcuni casi limitati. Utilizzando un catetere elettrodo quadripolar di cui l'elettrodi prossimali e distali due elettrodi possono trovarsi nel RV e RA, rispettivamente, è facile cambiare il sito di stimolazione da RA per il camper. Questo catetere è inoltre utile per l'eccitazione ventricolare di spostamento quando un segnale di attivazione ventricolare simultanea maschera il segnale di eccitazione atriale.
Questo metodo contribuirà alla valutazione il genotipo-fenotipo interazioni in AF relativi geni trovati di recente dagli studi romanzo come GWAS, soprattutto per i geni con cui l'indagine non è riuscito a mostrare loro di altri approcci. Con il progresso dei dispositivi e delle tecniche, le proprietà elettrofisiologiche del manicotto della vena polmonare, che è la fonte importante di AF20, possono essere valutate nel cuore intatto con questo approccio.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal programma per il miglioramento dell'ambiente di ricerca per giovani ricercatori provenienti da fondi speciali di coordinamento per promuovere la scienza e tecnologia (SCF) (per T.S.), localizzativi per la ricerca scientifica (n. 16K 09494, a T.S., n. 26293052, a T.F.) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone. Apprezziamo Brainvision e Mr. Kenji Tsubokura per l'assistenza tecnica, e apprezziamo anche Mr. John Martin per la sua assistenza linguistica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
