Summary
Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.
Abstract
Estudios recientes de la asociación a fibrilación auricular (FA) han indicado una fuerte asociación entre el genotipo y el fenotipo electrofisiológico en las aurículas. Nos anima a utilizar un modelo de ratones genéticamente modificados para aclarar el mecanismo de AF. Sin embargo, es difícil evaluar las propiedades electrofisiológicas de murinos aurículas debido a su pequeño tamaño. Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de aurículas usando un sistema de mapeo óptico con alta resolución temporal y espacial en corazones murino Langendorff inundada. El sistema de mapeo óptico está montado con cámaras de semiconductor de óxido metálico complementaria alta velocidad dual y alta magnificación lentes del objetivo, para detectar la fluorescencia de un tinte sensible a la tensión y un indicador de Ca2 + . Para centrarse en la evaluación de atria murino, mapeo óptico se realiza con un área de 2 x 2 mm o 10 mm x 10 mm, con un 100 × 100 de resolución (μm/píxeles 20 o 100 μm/píxeles) y velocidad de muestreo de hasta 10 kHz (0,1 ms) máximo. Se coloca un electrodo tetrapolar de tamaño 1-French catéter de marcapasos en la aurícula derecha a través de la vena cava superior, evitando cualquier daño mecánico a la aurícula, y estimulación estimulación se entrega a través del catéter. Se realiza un estudio electrofisiológico con estimulación programada, incluyendo la estimulación constante, la explosión estimulación y hasta tres extraestímulos estimulación. En una espontánea o ritmo de marcapasos, el mapeo óptico registró la duración del potencial de acción, mapa de activación, velocidad de conducción y Ca2 + transitoria individualmente en las aurículas derecha e izquierdas. Además, la estimulación programada determina también la inducibilidad de taquiarritmias auriculares. Asignación precisa de la activación se realiza para identificar la propagación de la excitación en el atrio durante una taquiarritmia atrial inducida. Mapeo óptico con un entorno especializado permite una completa evaluación electrofisiológica del atrio en modelos murinos de patológicos.
Introduction
El corazón consta de 4 cámaras en los mamíferos. Las dos cámaras superiores son atria, y los inferiores son los ventrículos. Ventrículos trabajan como una bomba para expulsar la sangre a la circulación sistémica o pulmonar. Aurículas reciben sangre de las venas sistémicas o pulmonares y ayudar en el transporte de sangre a los ventrículos para obtener una función eficiente de la bomba cardiaca. Desde un aspecto electrofisiológico, la importante función de las aurículas es regular el ritmo cardíaco. Las señales eléctricas se originan desde el nodo sinusal ubicado en el cruce de la vena cava superior (SVC) y la aurícula derecha (RA), entonces propagan a la RA y la aurícula izquierda (AI) y conducta al ventrículo a través del nodo auriculoventricular y His-Purkinje sistema de conducción.
Arritmias, que son trastornos del ritmo cardiaco, se clasifican en auricular y ventricular según su origen. Fibrilación auricular (FA) es la forma más común sostenida de una arritmia, caracterizada por una excitación rápida y al azar de las aurículas. Recientes análisis genéticos y estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) han demostrado la asociación entre AF y mutaciones genéticas o monopolymorphisms1,2,3,4. Estos resultados indican que AF es por lo menos en parte relacionado con una causa genética. Por lo tanto, es fundamental para evaluar las interacciones genotipo-fenotipo en las aurículas mediante un modelo de animales genéticamente modificados. Es ampliamente aceptado que el ratón es el mamífero más establecido para la modificación genética.
La técnica de mapeo óptico ha sido desarrollada para evaluar la excitación del tejido del corazón. Sin embargo, la observación del atrio murino por mapeo óptico se ve obstaculizada por su tamaño relativamente pequeño. Se pretende lograr una evaluación detallada del atrio murino con una alta resolución temporal y espacial.
Protocol
Este experimento animal fue aprobado y realizado bajo la regulación del cuidado de Animal institucional y Comité de uso de Tokyo Medical y Dental Universidad.
1. preparación
- Soluciones madre
- Disolver los colorantes sensibles a voltaje (di-4-ANEPPS y RH237) y Ca2 + indicador (Rhod-2 AM) con 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer soluciones con concentraciones de 6 mM, 10 mM y 10 mM, respectivamente.
- Disolver el uncoupler de excitación-contracción (E-C), blebbistatin, con DMSO 90% para hacer una solución madre de 50 mM.
- Alícuota las soluciones en una PCR de 0,2 mL del tubo en una habitación oscura y reemplazar el aire en el tubo común con gas nitrógeno para evitar oxidación.
- Envuelva los tubos comunes en papel de aluminio individualmente para la protección de la luz y almacenar a-20 ° c.
- Soluciones de trabajo
- Preparar 1 L de tampón fosfato salino (PBS) sin Ca2 + (NaCl 137 mM, 2.7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4y 1,5 mM KH2PO4, pH 7,40 por NaOH)
- Preparar 1 L de solución de Tyrode (135 mM de NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM de MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosa y 5.0 mM HEPES, pH 7,40 por NaOH).
- Filtro solución de Tyrode con un filtro 0,22 μm botella y airear bien por aireación de burbuja con una piedra de aire conectado a una bombona de gas O2 .
2. óptica en corazones perfundidos Langendorff
- Montar el sistema de mapeo óptico utilizando dos cámaras de semiconductor (CMOS) de óxido de metal complementario (Figura 1ay b)
- Montar las cámaras CMOS, divisor de haz, lentes objetivas, revólver de lente, fuente de luz, espejos dicroicos, filtros y otras piezas en el sistema de mapeo óptico como se muestra en la Figura 1ay b.
- Seleccione la ampliación cambiando el objetivo en una torreta, equipado con diferentes aumentos (1.6 X y 5 X).
Nota: El tamaño del sensor CMOS es 10 mm × 10 mm, con una resolución de 100 × 100, que significa, con el objetivo de 5 X, este sistema proporciona una resolución espacial de 20 μm. - Coloque la luz de excitación utilizando una lámpara de diodo emisor de luz (LED) con una longitud de onda central de 530 nm, pasado a través de un filtro band-pass (520/35 nm) y reflejada con un espejo dicroico (560 nm).
- Grabar la señal de emisión dividida por un divisor (665 nm), en que cámara de ajuste 1 con un largo pase filtro (697/75 nm) detecta la fluorescencia usando un tinte sensible a la tensión de membrana (di 4-ANEPPS o RH237) y cámara 2 con un filtro band-pass (572/28 nm) detecta la señal de la Ca2 + indicador (Rhod2-AM).
- Montar el circuito de perfusión de Langendorff
- Conecte los tubos de cloruro de polivinilo (PVC) a una bomba peristáltica.
- Ponga el lado de succión del tubo de PVC en solución de Tyrode aireada con 100% O2 , como se mencionó en el paso 1.2.3.
- Conecte el lado de descarga del tubo de PVC a una trampa de aire hecho a mano, a continuación, organizar los 5 μm filtro, llaves de tres vías, transductor de presión, calefacción de bobina de vidrio y aguja blunted 21-calibre (el tamaño de la aguja es variable según el tamaño de la aorta) secuencialmente , otros tubos de PVC.
- Llenar el circuito de perfusión con solución de Tyrode evitando burbujas de aire en el circuito y detener el flujo hasta que el corazón está conectado al circuito.
- Heparinización y anestesia
- Inyectar heparina no fraccionada (200 UI, independientemente del peso corporal) por vía intraperitoneal en un ratón utilizando una jeringa de 1 mL y aguja de calibre 25.
- Anestesiar el ratón por una inyección intraperitoneal de pentobarbital (65mg/kg) 10 minutos después de la inyección de heparina.
- Canulación y perfusión
- Coloque el ratón en la posición supina. Confirmar animales es anestesiada por la falta de respuesta a los pies, pizca. Abrir la pared abdominal por debajo del nivel de proceso xifoides con unas tijeras. Hacer una incisión transversal en el diafragma, cortar ambos lados de las costillas en la línea axilar medial sin ningún daño al corazón y tirón hacia arriba de la pared de pecho anterior. Avanzar fórceps curvado detrás el corazón y mantenga presionado la aorta descendente, el esófago y la vena cava inferior. A continuación, suprimir el corazón con tijeras rápidamente junto con los vasos adyacentes y tejidos, como la aorta, pulmones, tráquea, esófago, tejidos adiposos y timo.
- Lavar el corazón con 10 mL de PBS helado en un plato de petri y retire el tejido adyacente.
- Introducir la punta de la aguja de calibre 21 blunted conectada al circuito de perfusión en la aorta ascendente y fijar con hilo bajo un estereomicroscopio.
- Comienzan a inundar el corazón por 10 min con la solución de Tyrode aireada con 100% O2.
- Monitorizar continuamente la presión de perfusión con el transductor de presión conectado al amplificador y registrador.
- Mantenga la presión de perfusión entre 80-100 mmHg (generalmente correspondiente a 2-5 mL/min para el flujo) durante todos los pasos siguientes.
- Durante la perfusión inicial (paso 2.4.4.), inserte el tubo fino de polietileno (PE) (diámetro externo: 0,8 mm) en el SVC y fijarla con un hilo. Luego, coloque el corazón en la cámara de vidrio calentado (Figura 1by c).
- Pinchar una aguja residente calibre 24 (diámetro externo: 0,7 mm) en la cavidad (LV) ventricular izquierda a través del ápex ventricular para evitar cualquier daño en el atrio y retire la aguja interior dejando la cánula externa en VI.
- Introducir una sonda de electrodo 1-French tamaño personalizado hecho a través del tubo de PE en la CVC para realizar estimulación eléctrica en el RA Si es necesario, haga avanzar el catéter en el ventrículo derecho (RV) para la estimulación ventricular.
- Insertar un electrodo pin en el ápex ventricular para registrar continuamente los bipolares electrocardiogramas (ECG) entre la aguja electrodo y canulación del pin en la aorta ascendente (figura 1C).
- Continuar la vigilancia de la presión de perfusión y ECG durante todo el estudio.
- Apagar la luz y realizar el siguiente experimento en un cuarto oscuro.
- Vaya al paso 2.5. para una única grabación de la tensión de la membrana o 2.6. para una grabación doble de la tensión de la membrana y Ca2 + transitorio.
- Coloración para una única grabación de la tensión de la membrana
- Mantener la solución de perfusión calentada a 37 ° c durante este protocolo de tinción para una única grabación de la tensión de la membrana.
- Diluir 8,3 μl de la solución madre de di-4-ANEPPS (6 mM) con 10 mL de solución de Tyrode (la concentración final es de 5 μm).
- Infundir el volumen (10 mL) de la solución diluida de di-4-ANEPPS en el corazón vía perfusión de 2-5 min, seguido de un lavado con solución de Tyrode durante 5 minutos.
- Diluir 5 μl de la solución madre de blebbistatin (50 mM) con 1mL de solución de Tyrode (la concentración final es de 250 μm).
- Administrar la cantidad total de la solución diluida blebbistatin vía de perfusión.
- Omita paso 2.6 y proceder al paso 2.7 para el derrubio.
- Coloración para una grabación doble de la tensión de la membrana y Ca2 + transitorio
- Mantener la solución de Tyrode a temperatura ambiente.
Nota: Este ajuste inicial de la temperatura es diferente a la de la tinción para una única grabación de la tensión de la membrana (paso 2.5.). - Administrar el blebbistatin de la misma manera como en los pasos 2.5.4 y 2.5.5.
- Mezcla 3 μl de solución stock de Rhod2AM (10 mM) y 30 μl de polioxietileno-polioxipropileno bloquean de copolímero de F-127 (20% en DMSO), luego diluir la mezcla con 10 mL de solución de Tyrode.
- Cargar la cantidad total de solución de Rhod2AM (3 μm) más 2-5 min por la misma ruta de la blebbistatin.
- Diluir 7 μl de la solución madre de RH237 (10 mM) con 10 mL de solución de Tyrode.
- Administrar la cantidad total de la solución diluida de RH237 (7 μm) durante 2-5 minutos.
- Después de la terminación del procedimiento anterior, comenzar a calentar la solución de Tyrode a 37 ° c.
- Mantener la solución de Tyrode a temperatura ambiente.
- Lavado
- Mantener la temperatura de la solución de Tyrode a 37 ° c en el siguiente experimento.
- Inundar el corazón con solución de Tyrode para por lo menos 5 minutos lavar los tintes excesivos.
Nota: No es necesario aumentar la tasa de flujo durante este lavado paso (refiérase al paso 2.4.6). - Confirman la desaparición de cualquier artefacto de movimiento debido a las contracciones y la tinción homogénea en el corazón inundado.
- Muestreo y análisis de datos
- Poner el vidrio de cubierta (25 x 60 mm) en el corazón perfundido con cuidado, para aplanar la superficie atrial sin demasiado estrés mecánico y evitar el artefacto de movimiento de vibración de la solución. Confirmar que el atrio se adhiere al cubierta de vidrio adecuadamente.
- Registrar la fluorescencia por las cámaras CMOS con un muestreo tasa de hasta 0,1 ms para 4 de di-ANEPPS y 1 ms para el RH237 y Rhod2AM de tinción.
- Analizar los registros obtenidos mediante el software de análisis, según las instrucciones del fabricante para el funcionamiento real del software.
- Crear un mapa de activación y la película después de extraer la región de interés, eliminación de la deriva, filtrado temporal y 3 X 3 binning5.
3. electrofisiológico
- Configuración de los electrodos electrodo de marcapaso y estimulador
- Confirmar el contacto de la punta del electrodo de estimulación por encargo en el RA en el tejido para la estimulación (consulte el paso 2.4.9.).
- Entregar estímulos toda estimulación la estimulación catéter conectado al estimulador programable.
- Determinación del umbral de estimulación
- Conjunto el estimulación intervalo entre 100 y 150 ms (anchura de pulso de 0,4 ms), evitando cualquier ritmo intrínseco superando la tasa de estimulación.
- Entregar estimulación estimulación constante para al menos 20 golpes obtener una estimulación atrial estable.
- Fije el ritmo salida en 5 mV, luego reducir gradualmente hasta la falla de estimulación entregada a despolarizar el atrio.
- La excitación auricular para confirmar la presencia de ondas P en el ECG, y en una señal de excitación auricular por la grabación óptica.
- Determinar la mínima estimulación de salida que es capaz de despolarizar el atrio como el umbral de estimulación.
- Configurar la salida de estimulación para los siguientes estudios en dos veces el umbral de estimulación.
- Constante y burst estimulación
- Entregar estimulación constante para 99 pulsaciones, con un intervalo de estimulación a partir de 150 ms y el intervalo más largo que evita superando el ritmo intrínseco.
- Reducir el intervalo de estimulación progresivamente con pasos 5 m, hasta 40 ms o hasta alcanzar el intervalo que es incapaz de obtener captura 1:1 del atrio.
- Único extraestímulo estimulación
- Establecer la longitud de ciclo de estimulación de la unidad básica (S1) a 120 ms, 100 ms y 80 ms a menos que el ritmo intrínseco supera con creces a la unidad básica o la no estimulación para obtener excitación auricular 1:1.
- Establecer el número de estímulos a 10 golpes del tren de unidad básico de la estimulación.
- Establecer el primer extraestímulo (S2) a-10 m para la longitud de ciclo básico.
- Entregar S2 después del último estímulo estimulación de la unidad básica.
- Acortar el intervalo de acoplamiento del S2 progresivamente con pasos de 5 ms, hasta que el S2 no logra despolarizar el atrio.
- Determinar el período refractario eficaz (ERP) como el más largo intervalo S2 que falla para despolarizar el atrio.
- Evaluar el ERP con al menos 3 longitudes diferentes de ciclo básico para evaluar la adaptación de la tarifa de la ERP.
- Extraestímulos doble y triple estimulación para inducir taquiarritmias atriales
- Reajuste el intervalo S2 al punto ms 20 fuera de la ERP de S2 no arritmias se observan.
- Añadir un segundo extraestímulo (S3), comenzando con el mismo intervalo como S2.
- Disminuir el intervalo de acoplamiento entre S2 y S3 progresivamente con los pasos de 5 ms hasta S3 no logra despolarizar el atrio.
- Restablecer el intervalo de S2 a un punto de 10 ms fuera el ERP, luego repita el paso 3.5.3.
- Resetear los intervalos de S2 y S3 puntos ms 20 fuera de cada ERP.
- Añadir un tercer extraestímulo (S4), comenzando con el mismo intervalo como S3.
- Disminuir el intervalo de acoplamiento entre S3 y S4 progresivamente con los pasos de 5 ms hasta S4 no logra despolarizar el atrio.
- Restablecer el intervalo de S3 a un punto de 10 ms fuera el ERP, luego repita el paso 3.5.7.
- Resetear los intervalos de S2 y S3 puntos ms 10 fuera el ERP, luego repita el paso 3.5.7.
- Definir la inducibilidad de taquiarritmias auriculares mediante la inducción reproducible mediante estímulos igualmente programados.
- Evaluación de la inducibilidad de taquiarritmias auriculares
- Registrar continuamente el ECG durante todos los protocolos de estimulación (paso 3.3-3.5.).
- Realizar grabaciones ópticas durante y después de cada estímulo, para la inducción de taquicardia atrial (en) o respuesta atrial repetitiva (RAR).
- Aplicando el mismo protocolo de estimulación cuando AF o un RAR es inducida para confirmar la reproducibilidad.
Representative Results
Los experimentos de mapeo óptico se realizan utilizando los aparatos como se muestra en la Figura 1a. El esquema del sistema óptico se ilustra en la Figura 1b. El sistema proporciona un análisis de alta resolución del potencial de membrana y Ca2 + transitoria en el atrio.
Como se muestra en la figura 1 c y d, el corazón aislado se coloca en una cámara de temperatura controlada. Se coloca un catéter de electrodo 1-French tamaño de RA a través de un tubo de PE en el SVC, y otro residente tubo de PE se inserta en la cavidad del LV desde el ápice del LV para evitar excesiva presión en la cámara del corazón. Para un registro simultáneo del ECG, el cátodo (cable de ECG [-]) está conectado a la aguja de la canulación y el ánodo (plomo de ECG [+]) está conectado al electrodo de perno insertado en el ápice ventricular. La característica de esta Asamblea es evitar daños mecánicos a las aurículas.
Para la evaluación de la tensión de la membrana, utilizando di-4-ANEPPS de la fluorescencia se graba con hasta una 10.000 fotogramas/s de muestreo (figura 2). El mapa de activación se obtiene durante la estimulación constante de la RA El mapeo fino permite el análisis del patrón de conducción detallada en pequeñas aurículas murinos.
La figura 3 ilustra rastros representativos de las tensiones de membrana y Ca2 + transitoria en LA uso de RH237 y Rhod2AM durante la estimulación constante de la RA Reducir la tasa de muestreo de la asignación a 1000 fotogramas/s para obtener una suficiente relación de señal/ruido de la señal de Rhod2AM con el ajuste actual. Sin embargo, el sistema proporciona una calidad suficiente para el análisis de la relación entre el potencial de acción y Ca2 + transitoria.
Luego realizamos una inducción de una taquiarritmia auricular con estimulación programada utilizando ratones bajo una condición patológica. Figura 4 exhibe una grabación óptica de un inducido en un atrio murino teñidas con di-4-ANEPPS. El ratón somete a un procedimiento de constricción aórtica transversal para aplicar una sobrecarga de presión en la aurícula 10 días antes del experimento6. Inducir a por extraestímulos triple estimulación (120/100/100/80) y observar la propagación del circuito reentrante.
Figura 1. Sistema de mapeo óptico. a. Asamblea General del sistema de mapeo electrofisiológico/óptico. b. esquema de la composición del sistema de mapeo óptico: la flecha azul indica la luz de la excitación generada por la fuente de luz. El objetivo puede cambiarse con la torreta. La luz emitida desde el corazón manchado se divide entre cámara 1 y cámara 2. Cámara 1 detecta las señales de onda larga para el voltaje de la membrana, y cámara 2 registra las longitudes de onda con un filtro bandpass de 580 ± 20 nm para el transeúnte de Ca2 + . Durante el procedimiento, la presión de perfusión y del ECG se graban continuamente, y la señal de ECG es también al mismo tiempo importa en el mapa óptico, software de grabación. c. preparación de los corazones aislados: los corazones son canulados con una aguja blunted a través de la aorta ascendente para perfusión. Para grabaciones simultáneas de ECG, el cátodo está conectado a la aguja de la canulación y el ánodo con el electrodo de perno se inserta en el ápice ventricular. d. tubo de canalización y los electrodos: el corazón es canulado con una aguja blunted 21-calibre para perfusión (aguja de canulación). Un tamaño de 1-French estimulante electrodo (electrodo) se coloca en la aurícula derecha a través de un tubo de polietileno que se inserta en la vena cava superior. La cámara de vidrio se calienta a 37 ° c por agua caliente que circula en la cavidad de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Mapa de activación en el atrio. mapas de activación representante de a. en la vista anterior con un objetivo de 5 X y b. en la vista posterior con una lente de objetivo X 1,6. (Panel izquierdo) Esquema del corazón aislado y atrio. (Panel derecho) Mapa de activación de la aurícula izquierda obtenidos con la coloración a 10.000 frames/s di-4-ANEPPS. La grabación se realiza con estimulación constante con el electrodo estimulante en la aurícula derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Grabación dual del potencial de acción y Ca2 + transitorio en la aurícula izquierda. a. esquemático del corazón aislado. b. imagen representativa de la intensidad de la fluorescencia en la aurícula izquierda con RH237 para el voltaje de membrana (Vm) y la Rhod2AM para el transeúnte de Ca2 + . La grabación se realiza con un objetivo X 5 a 1.000 fotogramas/s. c. Grabación simultánea de la ECG (arriba), señal de RH237 (centro) y Rhod2AM (abajo), durante la estimulación constante con el electrodo de estimulación de la aurícula derecha. Las flechas negras indican el estímulo espigas y flechas amarillas la excitación ventricular. Un efecto de dispersión de la luz del ventrículo también puede observarse (flecha amarilla) tanto en la RH237 señal y la señal de Rhod2AM. d. un combinado RH237 y Rhod2AM rastro. El potencial de acción y Ca2 + cambios transitorios se registran simultáneamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cartografía de activación durante la taquicardia atrial. (Panel izquierdo) Esquema del corazón aislado. (Panel del medio) Mapa de activación durante una taquicardia atrial (en). AT fue inducida por extraestímulos triple estimulación de la aurícula derecha. (Panel derecho) Mapa de activación durante el ritmo sinusal en el mismo corazón de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementario 1. Película representativa de la membrana potencial en el atrio con tinción con di-4-ANEPPS. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película complementario 2. Películas representativas de la cartografía de activación durante el ritmo atrial taquicardia y del seno. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Mapeo óptico es una maniobra bien establecida para el estudio de la electrofisiología cardiaca7y es una herramienta muy útil para evaluar no solo las arritmias ventriculares8,9, sino también la10,11 . Asignación simultánea del potencial transmembrana y transitorios de Ca2 + es útil para la comprensión de los mecanismos subyacentes de arritmias en relación con la insuficiencia cardíaca y otras enfermedades del corazón12,13. Cuando se comparan los otros métodos de evaluación electrofisiológica, como aquellos que utilizan una sola celda o capa celular, una de las superioridades absolutas del mapeo óptico en el corazón inundado de es la evaluación del patrón de conducción en la aurícula intacto y ventrículo, durante ritmo sinusal, pero también durante las arritmias inducidas14. Un intento de utilizar corazones murino, especialmente el atrio, como sustituto de los seres humanos ha encontrado dificultades debido principalmente a su pequeño tamaño, sin embargo, el ratón es un modelo experimental atractivo en términos de la evaluación en un animal genéticamente modificados modelo y este problema deben ser superada. Nuestro enfoque proporciona una dirección para resolverlo.
Aunque nuestro aparato óptico asignación era básicamente similar al sistema convencional de corazones todo murino15, nuestro método tiene la ventaja de evaluar el atrio murino haciendo algunas modificaciones a la misma. En primer lugar, nos persiguió para obtener una alta resolución espacial y temporal de hasta 0,1 ms/marco y 20 μm/píxeles y esta alta resolución asignación contribuido a una medición más precisa del patrón de propagación y velocidad de conducción en el atrio murino. En segundo lugar, para evitar cualquier daño mecánico innecesario o estiramiento de la aurícula, que podría alterar las propiedades electrofisiológicas 16,17, se inserta una aguja residente directamente en el LV para reducir la presión intra-cámara, en lugar de insertar a través de LA ya realizada en el anterior estudio15. Además, el estímulo estimulación se entrega a través de un catéter electrodo tamaño por encargo 1-francés en la RA, pero no por un electrodo de aguja, que puede lesionar el atrio. Las patas son evitadas en la fijación de la orejuela, que fueron utilizadas en el pasado estudio15. En tercer lugar, en cuanto a la evaluación del mecanismo subyacente de las arritmias, un protocolo de estimulación programada para inducir taquiarritmias atriales es crucial18,19. Realizamos idéntica a la del estímulo programado en estudios electrofisiológicos clínicos, incluyendo explosión estimulación y hasta tres extraestímulos estimulación, con una modificación del intervalo de estimulación para el corazón de ratón. Así, además de los parámetros de medición de línea de base, el protocolo podría evaluar la inducibilidad de la AT. Cuando sea necesario, la inducibilidad de la AT se evalúa con la administración de isoproterenol u otras drogas. En nuestra experiencia, los ratones de tipo salvaje apenas mostrar cualquier ATs incluso después de un protocolo de estimulación completo. Así, la inducibilidad de AT debe ser información importante para evaluar la contribución de varias condiciones patológicas tales como las mutaciones genéticas, procedimientos quirúrgicos y la administración de medicamentos11. Estas modificaciones podrían optimizar la precisa evaluación electrofisiológica en el atrio murino intacto.
Este método también tiene algunas limitaciones. En primer lugar, con una resolución espacial máxima de un objetivo de 5 X, el campo de visión (FOV) está limitada a una parte del atrio (es decir. solamente la orejuela auricular izquierda como se muestra en la Figura 2a). Para obtener el mayor FOV del atrio, un 1.6 X objetivo es a veces preferible (figura 2b). En segundo lugar, sin con los pernos de fijación el atrio, a veces resulta difícil medir las propiedades de conducción auricular correctamente, porque se curva la superficie auricular. Por lo tanto, colocamos el cristal en su superficie a aplanar en el lugar de fijación por pernos. Este método también es beneficioso para la prevención de artefactos de movimiento de las vibraciones de la solución. En tercer lugar, con nuestro método, es muy difícil de obtener el campo visual entero, por lo tanto usar correctamente la vista anterior y posterior es más importante para nuestro enfoque que en el otro enfoque como se muestra en la figura 2. La ventaja de la vista anterior sería la clara observación de reingreso en el caso de condiciones patológicas, especialmente en el apéndice (figura 4). Por otra parte, la vista posterior tiene la ventaja de obtener una buena vista de la pared posterior auricular y puede ser una grabación detallada de desencadenar la actividad de la manga miocardio. Cuando es difícil obtener una visión adecuada y para aplanar su superficie curvada con nuestro método, el atrio se puede fijar con tensión mínima de pernos.
Con nuestro método, existen 3 posibles problemas, la falta de coloración, estimulación e inducción de arritmia. Para la falta de coloración, si no hay o leve fluorescencia es observada, se debe comprobar si el aparato de mapeo óptico esté montado correctamente, y si se almacena y utiliza apropiadamente el reactivo. La condición de la solución de perfusión también es crucial, que también pueden afectar las propiedades electrofisiológicas del corazón sí mismo, por lo tanto, la condición de solución incluyendo el pH, temperatura, y si hay suficiente aireación tiene que ser estrictamente monitoreados. También es importante evitar cualquier aire émbolos en el corazón. Por falta de estimulación, si los estimulación estímulos no pueden excitar el atrio, los investigadores deben comprobar si el cableado es correcto usando un probador de circuito. Cuando los estímulos estimulación se generan correctamente, el problema es el contacto del electrodo con el tejido. Reposicionamiento de los electrodos puede resolver el problema, y nuestro enfoque mediante el catéter de estimulación hace que sea fácil. Por dificultad en la inducción de la arritmia, RV estimulación puede utilizarse para la inducción de un AT en algunos casos limitadas. Utilizando una sonda de electrodo tetrapolar que el distales dos electrodos y electrodos proximal se encuentra en la RV y la RA, respectivamente, es fácil cambiar el sitio de estimulación de la RA a la RV Este catéter también es útil para cambiar la excitación ventricular cuando una señal de activación ventricular simultánea enmascara la señal de excitación auricular.
Este método contribuirá a evaluar el genotipo-fenotipo las interacciones en la AF relacionada con genes encontrados recientemente por los estudios novedosos como GWAS, especialmente para los genes con que la investigación no pudo demostrar por otros métodos. Con el progreso de técnicas y dispositivos, las propiedades electrofisiológicas de la manga de la vena pulmonar, que es la fuente importante de AF20, pueden ser evaluadas en el corazón intacto con este enfoque.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el programa para la mejora del entorno de investigación para jóvenes investigadores de fondos especiales de la coordinación para promoción de ciencia y tecnología (SCF) (a T.S.), subvenciones para la investigación científica (no. 16K 09494, T.S., Nº 26293052, a T.F.) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT) de Japón. Agradecemos Brainvision y Sr. Kenji Tsubokura de la asistencia técnica, y también apreciamos el Sr. John Martin por su ayuda lingüística.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
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