Summary
Det här protokollet beskriver elektrofysiologiska utvärderingen av murina atria utnyttja en optisk kartsystem med en hög temporal och spatial upplösning, inklusive dubbla inspelningar av membran spänningen och Ca2 + övergående under programmerade stimulering genom en specialiserad elektrod kateter.
Abstract
Senaste genome-wide associationsstudier inriktning förmaksflimmer (AF) har visat ett starkt samband mellan genotyp och elektrofysiologiska fenotyp i förmaken. Som uppmuntrar oss att utnyttja en genetiskt modifierade musmodell för att belysa mekanismen av AF. Det är dock svårt att utvärdera elektrofysiologiska egenskaper i murina atria på grund av sin ringa storlek. Det här protokollet beskriver elektrofysiologiska utvärderingen av atria använder en optisk kartsystem med hög temporal och spatial upplösning i av perfusion murina hjärtan. Optiska kartsystem monteras med dubbla höghastighetståg kompletterande metalloxid semiconductor kameror och objektiv för hög förstoring, att upptäcka fluorescensen av spänningskänsliga färgämne och Ca2 + indikator. För att fokusera på bedömning av murina atria, utförs optisk kartläggning med en yta på 2 mm × 2 mm eller 10 mm x 10 mm, med 100 × 100 upplösning (20 µm/pixel eller 100 µm/pixel) och samplingsfrekvens upp till 10 kHz (0,1 ms) vid maximalt. En 1-franska storlek quadripolar elektrod pacing katetern placeras i höger förmak via den överlägsna vena cava undvika eventuella mekaniska skador till förmak, och pacing stimulering levereras genom katetern. En Elektrofysiologisk undersökning utförs med programmerade stimulering inklusive konstant pacing, brast pacing, och upp till tredubbla extrastimuli pacing. Under en spontan eller pacing rytm, registreras den optiska kartläggningen aktionspotentialens duration, aktivering kartan, överledning hastighet, och Ca2 + övergående individuellt i höger och vänster förmak. Dessutom bestämmer programmerad stimulering också inducibility av förmaksflimmer takyarytmier. Exakta aktivering kartläggning utförs för att identifiera förökningen av magnetiseringen i vinterträdgården under en inducerad förmaksflimmer takyarytmi. Optiska mappning med en specialiserad inställning gör en grundlig elektrofysiologiska utvärdering av atrium i murina patologiska modeller.
Introduction
Hjärtat består av 4 avdelningar hos däggdjur. De övre två kammarna är atria, och de nedre är ventriklarna. Kamrarna fungerar som en pump för att mata ut blodet till systemisk eller pulmonella cirkulationen. Atria får blodet återvänder från systemisk eller pulmonell venerna och hjälpa transporterar blod till kamrarna att erhålla en effektiv hjärtats pumpfunktion. Från en Elektrofysiologisk aspekt är atria viktig funktion att reglera hjärtrytmen. De elektriska signalerna härstammar från sinusknutan ligger i korsningen mellan den överlägsna vena cava (SVC) och höger förmak (RA), och sedan sprids till RA och vänster förmak (LA), och genomföra till ventrikeln via atrioventrikulärt nod och Hans-Purkinje retledningssystem.
Arytmier, som hjärtrytmrubbningar, indelas i förmaks- och beroende på deras ursprung. Förmaksflimmer (AF) är den vanligaste ihållande formen av en arytmi, kännetecknas av en slumpmässig och snabba excitation av förmaken. Senaste genetiska analyser och genome-wide associationsstudier (GWAS) har visat sambandet mellan AF och genetiska mutationer eller monopolymorphisms1,2,3,4. Dessa fynd Visa AF är åtminstone delvis kopplad till en genetisk orsak. Därför är det kritiskt att utvärdera genotyp-fenotyp interaktioner i förmaken använder en genetiskt modifierade djur modell. Det är allmänt accepterat att musen är det mest etablerade däggdjuret för genetisk modifiering.
Den optiska kartläggning tekniken har utvecklats för att utvärdera excitation av hjärtat. Observation av murina atrium av optiska mappning hämmas dock av sin relativt begränsade storlek. Vi försöker att uppnå en detaljerad bedömning av murina atrium med en hög temporal och spatial upplösning.
Protocol
Detta djur experiment godkändes och utförs enligt förordningen av institutionella djur vård och användning kommittén i Tokyo medicinsk och Dental University.
1. beredning
- Stamlösningar
- Lös upp de spänningskänsliga färgämnen (di-4-ANEPPS och RH237) och Ca2 + indikator (Rhod-2 AM) med 100% dimetyl sulfoxid (DMSO) att göra lager lösningar med koncentrationer av 6 mM, 10 mM och 10 mM, respektive.
- Lös den excitation-contraction (E-C) uncoupler, blebbistatin, med 90% DMSO att göra en 50 mM stamlösning.
- Alikvotens lager lösningarna i en 0,2 mL PCR röret i ett mörkt rum, och byta ut luften i beståndet röret med kvävgas för att undvika oxidation.
- Wrap lager rören i aluminiumfolie individuellt för skydd från ljus, och lagra dem vid-20 ˚C.
- Fungerande lösningar
- Förbereda 1 L fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) utan Ca2 + (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4och 1,5 mM KH2PO4, pH 7,40 justeras av NaOH)
- Laga 1 L Tyrodes lösning (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glukos och 5,0 mM HEPES, pH 7,40 justeras av NaOH).
- Filtrera Tyrodes lösning med 0,22 µm flaska övre filter och lufta det väl av bubbla luftning med en air sten ansluten till en O2 gascylinder.
2. optiska mappning i av-perfusion hjärtan
- Montera optiska kartsystem med två kompletterande metal oxide semiconductor (CMOS) kameror (figur 1a& b)
- Montera de CMOS-kamerorna, stråldelare, objektiv, lins revolver, ljuskälla, dikroiskt speglar, filter och andra delar i optiska kartsystem som visas i figur 1a& b.
- Välj förstoringen genom att ändra objektivet i ett torn, utrustade med olika förstoringar (1,6 X och 5 X).
Obs: CMOS-sensorn storlek är 10 mm × 10 mm, med 100 × 100 upplösning, vilket innebär, med 5 X objektiv, detta system ger en 20 µm rumslig upplösning. - Ange excitation ljuset med en lysdiod (LED) lampa med en center våglängd på 530 nm, passerade ett band-passera filter (520/35 nm), och återspeglas med dikroiskt spegel (560 nm).
- Rekord-utsläpp signalen som dividerat med en splitter (665 nm), i vilken inställning kamera 1 med lång passera filter (697/75 nm) upptäcker fluorescensen med en membran spänningskänsliga färgämne (di 4-ANEPPS eller RH237) och kamera 2 med ett band-passera filter (572/28 nm) upptäcker den signal om Ca2 + indikatorn (Rhod2-AM).
- Montera av perfusion kretsen
- Polyvinylklorid (PVC) rör bifogas en Peristaltisk pump.
- Insugssida PVC röret in Tyrodes lösning med tillsatt koldioxid med 100% O2 som nämns i steg 1.2.3.
- Anslut trycksidan av PVC röret till en handgjord luften fälla och ordna den 5 µm filter, tre-vägs Avstängningskranar, tryckgivare, värme glas spole och 21-gauge trubbiga nål (nål storleken är utbytbara i enlighet med storleken på aorta) sekventiellt , använda andra PVC-rör.
- Fyll perfusion kretsen med Tyrodes lösning för att undvika eventuella luftbubblor i kretsen och stoppa flödet tills hjärtat är ansluten till kretsen.
- Heparinization och anestesi
- Injicera ofraktionerat heparin (200 IE, oavsett kroppsvikt) intraperitonealt i en mus med en 25-gauge nål och 1 mL spruta.
- Söva musen genom en intraperitoneal injektion av pentobarbital (65mg/kg) 10 min efter injektion heparin.
- Kanylering och perfusion
- Placera musen i ryggläge. Bekräfta att djur är sövd av bristen på svar till tå nypa. Öppna den buk-väggen under xiphoid process med sax. Gör en tvärgående snitt i membranen, klippa båda sidorna av revbenen i mediala axillär linje utan skador till hjärtat och vända främre bröstväggen uppåt. Avancera böjd pincett bakom hjärtat och håll den fallande aorta, matstrupen och sämre vena cava. Sedan, punktskatt hjärtat med sax snabbt tillsammans med intilliggande fartyg och vävnad, såsom aorta, lungor, luftstrupe, matstrupe, fettvävnad, och bräss.
- Tvätta hjärtat med 10 mL iskallt PBS i en petriskål och ta bort den intilliggande vävnaden.
- Introducera den 21-gauge trubbiga nålspetsen ansluten till perfusion kretsen i aorta ascendens och fixa det med tråd under ett stereomikroskop.
- Börja att BEGJUTA hjärtat för 10 min med Tyrodes lösning kolsyrat med 100% O2.
- Övervaka perfusionstrycket kontinuerligt med tryckgivaren ansluten till förstärkaren och brännare.
- Hålla perfusionstrycket mellan 80-100 mmHg (vanligtvis motsvarande 2-5 mL/min för flödet) under alla följande steg.
- Under den inledande perfusionen (steg 2.4.4.), in tunna polyeten (PE) röret (Ytterdiameter: 0.8 mm) till ständiga Veterinärkommittén, och fixa det med en tråd. Sedan placera hjärtat in i värmda glas kammaren (figur 1b& c).
- Punktera en inneboende 24-gauge nål (Ytterdiameter: 0,7 mm) i den vänstra ventrikulära (LV) håligheten genom den ventrikulära apexen att undvika skada till förmak, och inre nålen lämnar externa kanylen i LV.
- Införa en 1-franska storlek anpassade gjort elektrod kateter genom PE röret i ständiga Veterinärkommittén att utföra elektrisk stimulering i RA. Om det behövs, fram katetern in i höger kammare (RV) för ventrikulär pacing.
- Infoga en pin elektrod i ventrikulära apexen att kontinuerligt registrera de bipolära elektrokardiogram (EKG) mellan pin elektrod och kanylering nålen i aorta ascendens (figur 1 c).
- Fortsätta att övervaka EKG och perfusion trycket under hela studien.
- Stänga av ljuset, och utföra följande experimentet i ett mörkt rum.
- Gå till steg 2.5. för en enda inspelning av membran spänningen eller 2.6. en dubbel inspelning av membran spänning och Ca2 + övergående.
- Färgning för en enda inspelning av membran spänningen
- Bibehålla perfusion lösningen upphettas till 37 ° c under denna färgning protokoll för en enda inspelning av membran spänningen.
- Späd 8,3 µL di-4-ANEPPS stamlösning (6 mM) med 10 mL Tyrodes lösning (slutliga koncentration är 5 µM).
- Ingjuta den totala volymen (10 mL) av den utspädda lösningen di-4-ANEPPS in i hjärtat via perfusion rutten för 2-5 min, följt av en Wash-out med Tyrodes lösning för 5 min.
- Späd 5 µL av blebbistatin stamlösning (50 mM) med 1mL Tyrodes lösning (slutliga koncentration är 250 µM).
- Administrera den totala mängden utspädda blebbistatin lösningen via perfusion rutten.
- Hoppa över steg 2,6 och fortsätt till steg 2,7 för blekt.
- Färgning för en dubbel inspelning av membran spänningen och Ca2 + övergående
- Hålla den Tyrodes lösning vid rumstemperatur.
Obs: Denna inledande inställning av temperaturen skiljer sig från det i färgning för en enda inspelning av membran spänningen (steg 2.5.). - Administrera blebbistatin på samma sätt som i steg 2.5.4 och 2.5.5.
- Blanda 3 µL av Rhod2AM stamlösning (10 mM) och 30 µL av polyoxyetylen-polyoxipropen segmentsampolymerer F-127 (20% i DMSO), sedan späd blandningen med 10 mL Tyrodes lösning.
- Ladda den totala mängden Rhod2AM lösning (3 µM) över 2-5 min via samma rutt som blebbistatin.
- Späd 7 µL av RH237 stamlösning (10 mM) med 10 mL Tyrodes lösning.
- Administrera det totala beloppet för den utspädda RH237 lösningen (7 µM) över 2-5 min.
- Efter slutförandet av ovanstående procedur, börja värma den Tyrodes lösning vid 37 ˚C.
- Hålla den Tyrodes lösning vid rumstemperatur.
- Blekt
- Hålla temperaturen Tyrodes lösning vid 37 ˚C i det följande experimentet.
- BEGJUTA hjärtat med Tyrodes lösning för minst 5 min att tvätta ur de överdrivna färgämnena.
Obs: Det finns ingen anledning att öka flödet under denna wash-out steg (se steg 2.4.6.) - Bekräfta någon motion artefakt på grund av sammandragningar och homogen färgningen perfunderade mitt försvinnande.
- Provtagning och dataanalys
- Lägg täckglaset (25 mm × 60 mm) på perfunderade hjärtat noggrant, för att platta till förmaksflimmer ytan utan alltför mycket mekanisk stress, och förhindra rörelse artefakt från vibrationer av lösningen. Bekräfta att atrium fäster vid skyddsglaset på lämpligt sätt.
- Spela in fluorescensen av CMOS-kameror med en provtagning Betygsätt upp till 0.1 ms för di 4-ANEPPS och 1 ms för RH237 och Rhod2AM färgning.
- Analysera erhållna inspelningar via programvaran analysera enligt tillverkarens anvisningar för själva driften av programvaran.
- Skapa en aktivering karta och film efter utdrager regionen av intresse, avdrift borttagning, temporal filtrering och 3 X 3 binning5.
3. Elektrofysiologisk undersökning
- Inställning av pacing elektroder och stimulator
- Bekräfta kontakten av spetsen av skräddarsydda pacing elektroden i RA till vävnad för stimulering (se steg 2.4.9.).
- Leverera alla pacing stimuli från pacing katetern ansluten till den programmerbara stimulatorn.
- Fastställandet av tröskeln pacing
- Uppsättning pacing intervallet mellan 100 och 150 ms (pulsbredd 0,4 MS), undvika eventuella inneboende rytm snabbare än andelen pacing.
- Leverera konstant pacing stimulering för minst 20 beats att erhålla en stabil förmaksflimmer pacing.
- Ange den pacing utgång på 5 mV, sedan gradvis minska den tills den levererade pacing inte depolariseras atrium.
- Bekräfta förmaksflimmer magnetiseringen av närvaron av P vågor i EKG eller ljussignal förmaksflimmer excitation av optiska inspelningen.
- Bestämma minsta pacing utdata som kan depolariseras atrium som pacing tröskelvärde.
- Ställ in pacing utdata för följande studier vid två gånger pacing tröskeln.
- Konstant och burst pacing
- Leverera konstant pacemakerbehandling för 99 beats, med en pacing intervall som börjar på 150 ms eller det längsta intervallet som undviker snabbare än den inneboende rytmen.
- Minska pacing intervallet successivt med 5 ms steg, ner till 40 ms eller tills nå intervallet som misslyckas att få 1:1 fånga atriet.
- Enda extrastimulus pacing
- Ange grundläggande enheten (S1) pacing Cykellängd 120 ms, 100 ms och 80 ms såvida den inneboende rytmen överträffar den grundläggande enheten eller den pacing misslyckas att få 1:1 förmaksflimmer excitation.
- Ange antalet pacing stimuli till 10 slag för grundläggande drivlinan.
- Ange den första extrastimulus (S2) till-10 ms för den grundläggande cykellängden.
- Leverera S2 efter den senaste pacing stimulansen för den grundläggande enheten.
- Förkorta intervallet koppling av S2 successivt med 5 ms steg, tills S2 misslyckas att depolariseras atrium.
- Fastställa den effektiva refraktärperiod (ERP) som det längsta S2-intervallet som misslyckas med att depolariseras atrium.
- Utvärdera ERP med minst 3 olika grundläggande cykellängder för att bedöma hastighet anpassning av ERP.
- Dubbla och tredubbla extrastimuli tempo för att framkalla förmaksflimmer takyarytmier
- Återställa intervallet S2 till en punkt 20 ms utanför ERP av S2 om inga arytmier observeras.
- Lägga till en andra extrastimulus (S3), som börjar med samma intervall som S2.
- Minska koppling intervallet mellan S2 och S3 successivt med 5 ms steg tills S3 misslyckas att depolariseras atrium.
- Återställa intervallet för S2 till en punkt 10 ms utanför ERP och sedan upprepa steg 3.5.3.
- Återställa S2 och S3 intervallen till punkterna 20 ms utanför varje ERP.
- Lägga till en tredje extrastimulus (S4), som börjar med samma intervall som S3.
- Minska koppling intervallet mellan S3 och S4 successivt med 5 ms steg tills S4 misslyckas att depolariseras atrium.
- Återställa S3 intervallet till en punkt 10 ms utanför ERP och sedan upprepa steg 3.5.7.
- Återställa S2 och S3 intervallen till punkter 10 ms utanför ERP och sedan upprepa steg 3.5.7.
- Definiera inducibility av förmaksflimmer takyarytmier av reproducerbara induktion med likaså programmerade stimuli.
- Utvärdering av inducibility av förmaksflimmer takyarytmier
- Kontinuerligt registrera EKG under alla pacing protokoll (steg 3,3-3,5.).
- Utföra optisk inspelningar under och efter varje stimulering, spela in induktion av någon atrial takykardi (AT) eller repetitiva förmaksflimmer svar (RAR).
- Bekräfta reproducerbarheten genom att tillämpa samma pacing protokoll när AF eller en RAR induceras.
Representative Results
De optiska mappning experiment utförs med hjälp av enheter som visas i figur 1a. Schemat för det optiska systemet illustreras i figur 1b. Systemet ger en högupplöst analys av membranpotential och Ca2 + övergående i atriet.
Som avbildas i figur 1 c och d, är isolerade hjärtat placerad i en temperatur-kontrollerad kammare. En 1-franska storlek elektrod katetern placeras i RA genom ett PE rör infogas i ständiga Veterinärkommittén, och en annan inneboende PE röret sätts in i LV kaviteten från LV spetsen att undvika överdrivet tryck på hjärtat kammaren. För en samtidig EKG, katoden (ECG bly [-]) är ansluten till kanylering nålen och anoden (ECG bly [+]) är anslutna till pin elektroden infogas i den ventrikulära apexen. Funktionen i denna församling är att undvika mekanisk skada på atria.
För utvärdering av membran spänningen registreras fluorescens med di-4-ANEPPS med upp till en 10.000 bildrutor/s samplingshastighet (figur 2). Aktivering kartan erhålls under konstant tempo levereras från RA. Den fina kartläggningen gör analysen av detaljerade överledning mönstret i små murina atria.
Figur 3 illustrerar representativa spår av membran spänningar och Ca2 + övergående i LA använda RH237 och Rhod2AM under konstant tempo från RA. Vi minskar samplingsfrekvensen för på mappningen till 1000 ramar/s att få en tillräcklig signal/brusförhållande på Rhod2AM signalen med den nuvarande inställningen. Systemet ger dock en tillräcklig kvalitet för att analysera förhållandet mellan potentiell handling och Ca2 + övergående.
Vi utför sedan en induktion av ett förmaksflimmer takyarytmi med programmerade stimulering med möss under ett patologiskt tillstånd. Figur 4 uppvisar en optisk inspelning av en inducerad AT i en murin atrium färgas med di-4-ANEPPS. Musen genomgår en tvärgående aorta sammandragning procedur för att tillämpa en trycket överbelastning på atrium 10 dagar innan de experiment6. Vi förmå AT av tredubbla extrastimuli pacing (120/100/100/80), och observera förökningen av reentrant kretsen.
Figur 1. Optiska kartsystem. a. generalförsamling elektrofysiologi optiska kartsystem. b. Schematisk bild av sammansättningen av optiska kartsystem: den blå pilen visar magnetiseringen ljus genereras av ljuskällan. Objektivet kan växlas med torn. Det utsända ljuset från färgade hjärtat delas mellan kamera 1 och kamera 2. Kamera 1 upptäcker lång våglängd signaler för membran spänningen och kamera 2 registrerar våglängderna med ett bandpassfilter 580 ± 20 Nm för Ca2 + övergående. Under förfarandet, EKG och perfusion trycket registreras kontinuerligt och EKG-signalen är också samtidigt importeras till optiska karta inspelning programvara. c. beredning av isolerade hjärtan: hjärtan är kanylerade med trubbiga nål via aorta ascendens för perfusion. För samtidig ECG recordings, katoden är ansluten till kanylering nålen och anoden med PIN-elektroden är insatt den ventrikulära apexen. d. kanylering tube och elektroderna: hjärtat är kanylerade med en 21-gauge trubbiga nål för perfusion (kanylering nål). En 1-franska storlek stimulerande elektrod (elektroden) är placerad i höger förmak genom ett polyeten rör infogas i den överlägsna vena cava. Glas kammaren värms vid 37 ˚C av uppvärmt vatten cirkulerar i håligheten i kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Aktivering karta i atrium. a. representativa aktivering kartor i vyn främre med en 5 X objektiv, och b. i den bakre vy med en 1,6 X objektiv. (Vänster panel) Schematisk bild av isolerade hjärtat och atrium. (Höger panel) Aktivering karta över vänster förmak erhålls med di-4-ANEPPS färgning på 10.000 bildrutor/s. Inspelningen sker under konstant tempo med stimulerande elektroden placeras i höger förmak. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dubbla inspelning av aktionspotential och Ca2 + övergående i vänster förmak. a. Schematisk av isolerade hjärtat. b. representativ bild av intensiteten av fluorescensen i vänster förmak med RH237 för membran spänning (Vm) och Rhod2AM för Ca2 + övergående. Inspelningen sker med en 5 X objektiv vid 1 000 bilder/s. c. Samtidig inspelning av ECG (överst), RH237 signal (mitten) och Rhod2AM signal (botten), under konstant tempo med stimulering elektrod i höger förmak. De svarta pilarna anger stimulering spikar och gula pilar ventrikulär excitation. En ljusspridning effekt från ventrikeln kan också observeras (gula pilspetsar) både i RH237 signal och Rhod2AM signal. d. sammanslagna RH237 och Rhod2AM spår. De potentiella åtgärder och övergående Ca2 + förändringar registreras samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Aktivering kartläggning under atrial takykardi. (Vänster panel) Schematisk bild av isolerade hjärtat. (Mitten panel) Aktivering karta under en atrial takykardi (AT). AT var induceras av tredubbla extrastimuli pacing levereras från höger förmak. (Höger panel) Aktivering karta under sinusrytm i samma mus hjärtat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande movie 1. Representativa film av membranet potential i atriet med färgning med di-4-ANEPPS. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande filmen 2. Representativa filmer av aktiveringen kartläggning under atrial takykardi och sinus rytm. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Optiska mappning är en väletablerad manöver för att studera hjärtats elektrofysiologi7, och är ett ganska användbart verktyg för att bedöma inte bara ventrikulära arytmier8,9, men även förmaksflimmer de10,11 . Samtidiga kartläggning av transmembrana potential och Ca2 + transienter är användbara för att förstå de underliggande mekanismerna för arytmier i samband med hjärtsvikt och andra hjärtsjukdomar12,13. När man jämför de andra elektrofysiologiska metoderna för riskbedömning, till exempel med en enstaka cell eller cellagret, en av de absoluta superiorities av optisk kartläggning i perfunderade hjärtat är bedömningen av överledning mönstret i intakt atrium och ventrikeln, inducerad inte bara under sinusrytm utan också under arytmier14. Ett försök att utnyttja murina hjärtan, särskilt atrium, som ett surrogat av människor har stött på svårigheter huvudsakligen på grund av sin ringa storlek, men musen är en attraktiv experimentell modell när det gäller bedömningen i ett genetiskt modifierade djur modell, och detta problem måste övervinnas. Vår metod ger en riktning för att lösa problemet.
Även om vår optiska mappning apparater var i grunden liknar det konventionella systemet för hela murina hjärtan15, har vår metod fördelen av att bedöma murina atrium genom att göra några ändringar i den. Först, vi eftersträvade för att erhålla en hög rumsliga och temporal upplösning på upp till 0,1 ms/ram och 20 µm/pixel, och denna högupplösta kartläggning som bidragit till en mer exakt mätning av överledning hastighet och förökning mönstret i murina atrium. För det andra, för att undvika onödig mekanisk skada eller sträcka av vinterträdgården, som kunde förändra den elektrofysiologiska egenskaper 16,17, en inneboende nålen sätts direkt i LV att minska intra-kammare trycket, i stället för att infoga det genom LA som utförs i den tidigare studien15. Dessutom den pacing stimulansen levereras genom en anpassad gjorde 1-franska storlek elektrod katetern placeras i RA, men inte genom en nål elektrod, som kan skada atrium. Alla stift undviks i fastställande av förmak bihang, som användes i tidigare studie15. Tredje, när det gäller bedömningen av den underliggande mekanismen vid arytmier, en programmerad stimulering protokollet att framkalla förmaksflimmer takyarytmier är avgörande18,19. Vi utför programmerade stimulering identisk i kliniska elektrofysiologiska studier, inklusive burst pacing och upp till tredubbla extrastimuli pacing, med en modifiering av pacing intervallet för mus hjärtat. Således, förutom de baslinje mätparametrar, protokollet kunde bedöma inducibility av AT. När det behövs, bedöms inducibility av AT med administrering av isoproterenol eller andra droger. Vår erfarenhet visar vildtyp mössen knappast någon ATs även efter en fullständig stimulering protokoll. Inducibility at bör således vara viktig information för att utvärdera bidraget av flera sjukdomstillstånd såsom genetiska mutationer, kirurgiska ingrepp och administrering av läkemedel11. Dessa ändringar kan optimera den exakt elektrofysiologiska bedömningen i intakt murina atrium.
Denna metod har också vissa begränsningar. Först, med en maximal rumslig upplösning med en 5 X objektiv, synfältet (FOV) är begränsad till en del av atrium (dvs. endast den vänstra förmak bihang som visas i figur 2a). För att erhålla större FOV av atrium, är en 1,6 X objektiv ibland att föredra (figur 2b). För det andra, utan att åtgärda atrium med stift, ibland är det svårt att mäta förmaksflimmer överledning egenskaper korrekt, eftersom förmaksflimmer ytan är krökt. Så, vi placerade skyddsglaset på dess yta att platta det istället för fastskruvning av pins. Denna metod är också fördelaktigt för att förhindra rörelse artefakt från vibrationer av lösningen. För det tredje, med vår metod, det är ganska svårt att få hela FOV av det, så att använda vyn främre och bakre ordentligt är viktigare i vår inställning än i den andra metoden som visas i figur 2. Fördelen med den främre se skulle vara tydlig observation av återinträde när det gäller sjukdomstillstånd, särskilt i bihang (figur 4). Däremot, den bakre uppfattningen har en fördel av att få en bra bild av förmaksflimmer bakre väggen, och kan vara en detaljerad inspelning av utlösande aktivitet från hjärtinfarkt hylsan. När det är svårt att få en passande vy och platta till dess böjda yta med vår metod, kan atrium vara fast med minimal spänning av pins.
Med vår metod finns det 3 möjliga problem, fel på färgning, pacing och arytmi induktion. För om färgning, om ingen eller svag fluorescens observeras, bör du kontrollera huruvida optiska mappning apparaten monteras korrekt och om reagensen lagras på lämpligt sätt och används. Villkora av perfusion lösningen är också avgörande, som också kan påverka hjärtat själv, så, villkora av lösning inklusive pH, temperatur, elektrofysiologiska egenskaper och huruvida det fanns nog luftning måste övervakas strängt. Det är också viktigt att undvika eventuella luftemboli i hjärtat. För pacing misslyckande, om de pacing stimuli inte kan excitera atrium, bör forskare kontrollera om ledningarna är korrekt med hjälp av en krets testare. När de pacing stimuli är korrekt ut, är problemet kontakten mellan elektroden med vävnaden. Ompositionering av elektroderna kan lösa problemet, och vår metod med pacing katetern gör det enkelt. För svårigheter i arytmi induktion, kan RV pacing användas för induktion av en AT i vissa begränsade fall. Använder en quadripolar elektrod kateter som den distala två elektroder och proximala elektroder kan placeras i RV och RA, respektive, är det lätt att ändra webbplatsen pacing från RA till RV. Denna kateter är också användbart för skiftande ventrikulär excitation när en samtidig ventrikulära aktiveringen signal masker förmaksflimmer excitation signalen.
Denna metod kommer att bidra till att bedöma den genotyp-fenotypen interaktioner i AF relaterade gener nyfunna av de nydanande studierna såsom GWAS, särskilt för de gener som utredningen inte visat dem genom andra metoder. Med utvecklingen av enheter och tekniker, kan pulmonell ven hylsan, vilket är en viktig källa till AF20, elektrofysiologiska egenskaper bedömas i intakt hjärtat med detta tillvägagångssätt.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av programmet för förbättring av forskningsmiljö för unga forskare från särskilda samordning medel för att främja vetenskap och teknik (SCF) (till T.S.), Grants-in-Aid för vetenskaplig forskning (nr 16K 09494, att T.S., nr 26293052, att T.F.) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) av Japan. Vi uppskattar Brainvision och Mr. Kenji Tsubokura för tekniskt bistånd, och vi uppskattar också Mr John Martin för hans språkligt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
