Summary
Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.
Abstract
Genom çapında Derneği Atriyal fibrilasyon (AF) hedef çalışmalar genotip ve Elektrofizyolojik fenotip Kulakçık arasında güçlü bir ilişki belirttiler. Bu bize AF mekanizması aydınlatmak için bir genetik mühendisliğiyle fare modeli kullanmak için teşvik eder. Ancak, kendi küçük boyutu nedeniyle fare Kulakçık Elektrofizyolojik özellikleri değerlendirmek zordur. Bu iletişim kuralı bir yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü periosteum Langendorff fare kalplerine bir optik haritalama sistemi kullanarak Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar. Optik haritalama sistemi çift yüksek hızlı tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kameralar ve yüksek büyütme objektif floresan bir voltaj duyarlı boya ve Ca2 + göstergesi algılamak için mercekler ile monte edilir. Fare Kulakçık değerlendirilmesi üzerinde odaklanmak için bir alana sahip 2 mm × 2 mm veya 10 mm x 10 mm, 100 × 100 çözünürlük (20 µm/piksel ya da 100 µm/piksel) ve ilâ 10 kHz (0.1 ms) maksimum örnekleme oranı ile optik eşlemesi gerçekleştirilir. Kateter pacing 1-Fransızca boyut quadripolar elektrot atrium herhangi bir mekanik hasar önleme üstün vena kava yoluyla Sağ atrium içine yerleştirilir ve stimülasyon pacing kateter teslim edilir. Bir Elektrofizyolojik çalışma sürekli pacing dahil olmak üzere programlanmış stimülasyon ile gerçekleştirilir, pacing ve Üç Kişilik extrastimuli Volta kadar patlamış. Bir kendiliğinden ya da ritim pacing altında optik eşleme aksiyon potansiyeli süresini, harekete geçirmek harita, iletim hızı ve Ca2 + sağ ve sol Kulakçık ayrı ayrı geçici kaydedildi. Buna ek olarak, programlanmış stimülasyon de Atriyal tachyarrhythmias inducibility belirler. Tam harekete geçirmek eşleme Atrium'a da uyarma sırasında bir indüklenen Atriyal taşiaritmi yayılmasını tanımlamak için gerçekleştirilir. Özel bir ayar ile optik eşleme fare patolojik modelleri avluda ayrıntılı bir Elektrofizyolojik değerlendirme sağlar.
Introduction
Memelilerde 4 chambers, kalp oluşur. Üst iki odaları atria, ve ventrikül daha düşük olanlar vardır. Ventrikül kan sistemik veya pulmoner dolaşım için dışarı atmak için pompa olarak çalışıyorum. Kulakçık sistemik veya pulmoner damarlardan dönen kan almak ve ventrikül kan taşıyan bir verimli kalp pompası işlevi elde etmek için yardımcı olur. Elektrofizyolojik bir açıdan Kulakçık önemli fonksiyonu kalp ritmi düzenlemektir. Elektrik sinyallerini üstün vena kava (SVC) ve Sağ atrium (RA), arasında kavşağında bulunan sinüs düğümünden kaynaklanan sonra RA ve Sol atriyum (LA) için yaymak ve ventrikül Atriyoventriküler düğüm ve onun Purkinje için kuralları iletim sistemi.
Aritmiler, kalp ritim bozuklukları olan Atriyal ve Ventriküler kökenlerine göre sınıflandırılır. Atriyal fibrilasyon (AF) Kulakçık rasgele ve hızlı uyarma tarafından karakterize bir ritim bozukluğu en yaygın sürekli biçimidir. Son genetik analizler ve genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) AF ve Genetik mutasyonlar veya monopolymorphisms1,2,3,4arasındaki ilişkiyi göstermiştir. Bu bulgular AF en azından kısmen genetik bir neden ile ilişkili olduğunu gösteriyor. Bu nedenle, bir genetik mühendisliğiyle hayvan modeli kullanarak Kulakçık genotip fenotip etkileşimlerde değerlendirmek için önemlidir. Fare genetik değişiklik için en köklü memeli olduğu yaygın olarak kabul edilir.
Optik haritalama tekniği kalp doku uyarma değerlendirmek için geliştirilmiştir. Ancak, fare atrium optik eşleme tarafından gözlenmesi nispeten küçük boyutuna tarafından engel oluyor. Fare atrium yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte ayrıntılı bir değerlendirme ulaşmak deneyin.
Protocol
Bu hayvan deney onaylanmış ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Tokyo tıbbi ve diş Üniversitesi yönetmelik altında gerçekleştirilen.
1. hazırlık
- Hisse senedi çözümleri
- Voltaj duyarlı boyalar (di-4-ANEPPS ve RH237) ve Ca2 + göstergesi (AM Rhod-2) ile % 100 Dimetil sülfoksit (DMSO sırasıyla 6 mM, 10 mM ve 10 mM, konsantrasyonları ile hisse senedi çözümleri yapmak).
- Uyarma-kasılma (E-C) uncoupler, blebbistatin, yapmak a 50 mM hisse senedi eriyik için % 90 DMSO ile geçiyoruz.
- Aliquot 0.2 mL PCR hisse senedi çözümlerinde karanlık bir odada tüp ve oksidasyon önlemek için azot gazı kullanarak hisse senedi tüp havada değiştirin.
- Alüminyum folyo ışık koruma için tek tek hisse senedi tüpler şal ve -20 ˚C depolayabilirsiniz.
- Çalışma çözümleri
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan Ca2 + (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.0 mM Na2HPO4ve 1.5 mM KH2PO4, pH NaOH tarafından ayarlanmış 7,40) 1 L hazırlamak
- 1 L Tyrode'nın çözüm (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5.5 mM D-glukoz ve 5.0 mM HEPES, pH NaOH tarafından ayarlanmış 7,40) hazırlayın.
- Tyrode'nın çözüm 0,22 µm şişe ilk filtre ile filtre ve de bir O2 gaz silindir bağlı bir hava taşı kullanarak kabarcık havalandırma tarafından havalandırmak.
2. optik Langendorff periosteum kalbimizde eşleme
- İki tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni (CMOS) kamera (Şekil 1a& b) kullanarak optik haritalama sistemi montajı
- Şekil 1a& bgösterildiği gibi optik haritalama sistemi içine CMOS Kameralar, ışın bölücü, objektif lens, lens tabanca, ışık kaynağı, dikroik ayna, filtreleri ve diğer parçaları toplayın.
- Büyütme oranını farklı büyüklüklerde (1.6 X ve 5 X) ile donatılmış bir taret objektif lensi değiştirerek seçin.
Not: CMOS sensör boyutu 10 mm × 10 mm, demektir, 5 X objektif lens ile bu sistem 20 µm Uzaysal çözünürlük sağlar 100 × 100 çözünürlük olduğunu. - Işık yayan diyot (LED) lamba 530 bir merkezi dalga boyu ile kullanarak uyarma ışık ayarlaması bant geçiren filtreden geçirilen nm (520/35 nm) ve bir dikroik ayna ile yansıyan (560 nm).
- Kayıt emisyon sinyal bölünmüş bir ayırıcı tarafından (665 nm), hangi ayarı fotoğraf makinesi 1 ile uzun bir filtre geçirin (697/75 nm) bir membran voltaj duyarlı boya (di 4-ANEPPS veya RH237) ve kamera 2 olan bir bant geçiren Filtre kullanarak Floresans algılar (572/28 nm) algılar sinyal göstergesinin Ca2 + (Rhod2-AM).
- Langendorff perfüzyon devre montajı
- Polivinil klorür (PVC) tüpler Peristaltik pompa için ekleyin.
- PVC boru emme tarafında adım 1.2.3 belirtildiği gibi % 100 O2 ile gazlı Tyrode'nın çözüm içine koymak.
- Deşarj PVC boru el yapımı hava tuzak bağlamak, sonra düzenlemek 5 µm filtre, üç yönlü kesme muslukları, basınç detektörler, Isıtma cam bobin ve 21'lik körelmenin iğne (iğne boyutuna uygun olarak aort boyutu değiştirilebilir) sırayla , diğer PVC borular kullanarak.
- Perfüzyon devre devre herhangi bir hava kabarcıkları kaçınarak Tyrode'nın çözüm ile doldurun ve kalp devresine bağlı olduğu kadar akışını durdurmak.
- Heparinization ve anestezi
- Unfractionated heparin (vücut ağırlığı ne olursa olsun 200 IU) intraperitoneally 25'lik iğne ve 1 mL şırınga kullanarak fareye enjekte et.
- Fare Fentobarbital (65 mg/kg) mayi bir iğne ile 10 dk sonra heparin enjeksiyon anestezi.
- Cannulation ve perfüzyon
- Fare sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Hayvanlar çimdik tırnağa yanıt eksikliği nedeniyle anestezi onaylayın. Makas kullanarak xiphoid işlemi düzeyinin altındaki karın duvarı açın. Diyafram enine bir kesi yapmak, kalbe zarar vermeden orta aksiler doğrultusunda her iki kaburga kesme ve ön göğüs duvarı yukarı doğru çevirmek. Kalp arkasında kıvrımlı pensler ilerlemek ve azalan aort, yemek borusu ve inferior vena kava tutun. O zaman, kalbin hızla birlikte bitişik damarları ve doku, aort, akciğerler, nefes borusu, yemek borusu, yağ dokuları ve timus gibi makasla tüketim.
- Bir kabında buz gibi PBS 10 mL kalple yıkama ve bitişik doku kaldırın.
- Artan aort perfüzyon devresine bağlı 21'lik körelmenin iğne ucu tanıtmak ve iplik altında bir stereomicroscope ile düzeltin.
- %100 O2ile gazlı Tyrode'nın çözüm ile kalp 10 min için sıvı için başlatın.
- Perfüzyon basıncı sürekli amplifikatör ve kaydedici bağlı basınç detektörler ekran.
- Aşağıdaki adımları uyguladığınızda (genellikle 2-5 mL/dk akış hızı için karşılık gelen) 80-100 mmHg arasında perfüzyon bastır.
- İlk perfüzyon (Adım 2.4.4.) sırasında ince polietilen (PE) tüp takın (dış çap: 0.8 mm) SVC içine ve bir iş parçacığıyla düzeltebilirim. O zaman, kalp (Şekil 1b& c) ısıtılan cam odasına koyun.
- 24 lik kalıcı bir iğne ponksiyon (dış çap: 0.7 mm) LV. dış kanül aracılığıyla herhangi bir hasar vermemek için kartı atrium ve iç iğne kaldırmak için ventrikül tepe sol ventrikül (LV) boşluğu içine bırakarak
- 1-Fransızca boyutu özel yapılan elektrot kateter elektriksel stimülasyon ra içinde gerçekleştirmek için SVC PE tüp yoluyla tanıtmak Gerekirse, Ventriküler pacing için sağ ventrikül (RV) içine kateter ilerlemek.
- Bir PIN elektrot arasında artan aort (şekil 1 c) PIN elektrot ve cannulation iğnede sürekli olarak iki kutuplu Elektrokardiyogram (EKG) kaydetmek için ventrikül tepe yerleştirin.
- Tüm çalışma boyunca EKG ve perfüzyon basıncının izlenmesi devam edin.
- Işıkları kapat ve karanlık bir odada aşağıdaki deneme gerçekleştirin.
- 2.5 adım git. membran voltaj veya 2.6 tek bir kayıt için. membran gerilim ve Ca2 + geçici bir çift kayıt.
- Membran gerilim tek bir kayıt için boyama
- Boyama bu iletişim kuralı için membran gerilim tek bir kayıt sırasında 37 ˚C ısıtmalı perfüzyon çözüm korumak.
- Di-4-ANEPPS hisse senedi çözüm (6 mM) 8.3 µL ile (son konsantrasyonu 5 mikron) Tyrode'nın çözüm 10 mL seyreltik.
- Toplam hacim (10 mL) seyreltilmiş di-4-ANEPPS çözümü için 2-5 dk, 5 dk için Tyrode'nın çözüm ile Silinerek geçiş ve ardından perfüzyon yol üzerinden kalbine süzülür.
- Blebbistatin hisse senedi çözüm (50 mM) 5 µL (son konsantrasyonu 250 µM) Tyrode'nın çözüm ile 1 mL seyreltik.
- Seyreltilmiş blebbistatin eriyik yolu ile perfüzyon rota toplam miktarı yönetmek.
- Adımı 2.6 atlayıp adım 2.7 Silinerek geçiş için devam edin.
- Membran gerilim ve Ca2 + geçici bir çift kayıt için boyama
- Tyrode'nın çözüm oda sıcaklığında tutmak.
Not: Bu ilk sıcaklığı membran voltaj (Adım 2.5.) tek bir kayıt için boyama farklı ayardır. - Blebbistatin adım 2.5.4 ve 2.5.5 gibi aynı şekilde yönetmek.
- Mix 3 µL Rhod2AM hisse senedi çözüm (10 mM) ve polyoxyethylene-polyoxypropylene 30 µL blok kopolimer F-127 (DMSO % 20), sonra karışımı ile Tyrode'nın çözüm 10 mL seyreltik.
- Rhod2AM çözüm (3 µM) toplam miktarı yük üzerinde 2-5 dk blebbistatin olarak aynı rota üzerinden.
- RH237 hisse senedi çözüm (10 mM) 7 µL Tyrode'nın çözüm ile 10 mL seyreltik.
- Seyreltilmiş RH237 çözüm (7 µM) toplam miktarı yönetmek 2-5 dak.
- 37 ˚C Tyrode'nın çözüm ısıtmak yukarıdaki yordamı tamamlandıktan sonra başlayın.
- Tyrode'nın çözüm oda sıcaklığında tutmak.
- Silinerek geçiş
- Tyrode'nın çözüm sıcaklığı 37 ˚C aşağıdaki deneyinde tutun.
- Kalp için aşırı boya yıkamak en az 5 dk Tyrode'nın çözüm ile sıvı.
Not: Adım dışarı bu yıkama sırasında akış hızı artırmak için gerek yoktur (2.4.6 adıma bakın.) - Herhangi bir hareket artefaktı kasılmalar ve homojen perfused kalbinde boyama nedeniyle kaybolması onaylayın.
- Örnekleme ve veri analizi
- Cam (25 mm × 60 mm) perfused kalp üzerinde dikkatle, çok fazla mekanik stres olmadan Atriyal yüzey düzleştirmek için koymak ve titreşim çözüm yapıdan hareket önlemek. Atrium uygun şekilde kapak cam yuvalandırır onaylayın.
- Kayıt tarafından CMOS Kameralar bir örnekleme floresan oranı di 4-ANEPPS ve 1 0.1 ms ms RH237 ve Rhod2AM için boyama.
- Yazılım gerçek çalışması için üreticinin yönergelerine göre analiz yazılımı kullanarak elde edilen kayıtları analiz.
- Bir etkinleştirme harita ve film faiz, drift kaldırma, zamansal filtreleme ve 3 X 35binning bölgesi ayıkladıktan sonra oluşturun.
3. Elektrofizyolojik çalışma
- Pacing elektrotlar ve uyarıcı ayarlama
- Ra doku uyarılması için özel yapım pacing elektrot ucunu kişiyi onaylamak (2.4.9 adıma bakın).
- Tüm hız ayarlama uyaranlara için programlanabilir uyarıcı bağlı pacing kateter sunmak.
- Pacing eşik tayini
- Set 100 ve 150 ms (darbe genişliği 0.4 MS), hız ayarlama aralığını pacing oranı geride bıraktı herhangi bir içsel ritim kaçınarak.
- İstikrarlı bir Atriyal pacing elde etmek en az 20 vuruş için sürekli pacing stimülasyon sağlar.
- Pacing 5'te çıkış ayarla mV, daha sonra yavaş yavaş atrium depolarize teslim edilen hız ayarlama başarısız olmasına kadar azaltır.
- Atriyal uyarma P dalgaları EKG'nin ve/veya Atriyal uyarma sinyal varlığı ile optik kayıt ile onaylayın.
- Atrium pacing eşik olarak depolarize yapabiliyor çıkış pacing en az belirlemek.
- Pacing çıktı aşağıdaki çalışmalar için iki kez hız ayarlama eşik ayarlayın.
- Sabit ve patlama pacing
- 99 tempolar için sürekli pacing teslim 150 ms başlayan bir hız ayarlama aralığı veya içsel ritim geride bıraktı önler en uzun aralığı ile.
- Kademeli adımlarla 5 ms, 40 ms aşağı veya aralığı ulaşan atrium yakalanması 1:1 elde etmek başarısız kadar hız ayarlama aralığı azaltın.
- Tek extrastimulus Volta
- Temel sürücü veya 1:1 Atriyal uyarma elde etmek için hız ayarlama başarısız içsel ritim outpaces sürece temel sürücü (S1) hız ayarlama döngüsü uzunluğu 120 ms, 100 ms ve 80 ms için ayarlayın.
- 10 tempolar için temel sürücü tren uyaranlara Volta sayısını ayarlayın.
- -10 MS temel döngüsü uzunluğu için ilk extrastimulus (S2) ayarlayın.
- S2 temel sürücü son hız ayarlama uyarıcı sonra teslim.
- S2 atrium depolarize başarısız kadar S2 kaplin aralığı 5 ms adımlarla giderek kısaltın.
- Ürün ateşe dayanıklı ömrü (ERP) atrium depolarize için başarısız en uzun S2 aralığı belirlemek.
- ERP oranı uyarlaması değerlendirmek için ERP en az 3 farklı temel döngüsü uzunlukları ile değerlendirin.
- Atriyal tachyarrhythmias ikna etmek için pacing çift ve Üç Kişilik extrastimuli
- S2 aralığı bir noktaya S2 ERP dışında 20 ms yeniden yok aritmiler gözlenir.
- S2 olarak aynı aralığı ile başlayan ikinci extrastimulus (S3) ekleyin.
- Atrium depolarize S3 başarısız kadar aşamalı olarak 5 ms adımlarla S2 ve S3 kaplin aralığını azaltın.
- Bir noktaya ERP dışında 10 ms S2 aralığını sıfırlamak sonra adımları yineleyin 3.5.3.
- Puan her ERP dışında 20 ms için S2 ve S3 aralıkları sıfırlayın.
- S3 olarak aynı aralığı ile başlayan üçüncü extrastimulus (S4) ekleyin.
- S4 atrium depolarize başarısız kadar aşamalı olarak 5 ms adımlarla S3 ve S4 kaplin aralığını azaltın.
- Bir noktaya ERP dışında 10 ms S3 aralığı sıfırlamak sonra 3.5.7 arasındaki adımları yineleyin.
- Puan ERP dışında 10 ms için S2 ve S3 aralıkları sıfırlama sonra 3.5.7 arasındaki adımları yineleyin.
- Atriyal tachyarrhythmias inducibility benzer şekilde programlanmış bir çekim gücü kullanarak tekrarlanabilir indüksiyon tarafından tanımlayın.
- Atriyal tachyarrhythmias inducibility değerlendirilmesi
- Sürekli olarak EKG'nin tüm hız ayarlama protokolleri (Adım 3.3-3.5.) sırasında kayıt.
- Optik kayıtları sırasında ve sonrasında herhangi bir Atriyal taşikardi (AT) veya tekrarlayan Atriyal yanıt (RAR) indüksiyon kaydetmek için her stimülasyon gerçekleştirin.
- Tekrarlanabilirlik AF veya bir RAR indüklenen zaman aynı hız ayarlama iletişim kuralını uygulayarak doğrulayın.
Representative Results
Optik eşleme deneyler belgili tanımlık aygıt Şekil 1a' gösterildiği gibi kullanarak gerçekleştirilir. Optik sistem şeması Şekil 1badımında gösterilmektedir. Sistem membran potansiyeli ve Ca2 + avluda geçici yüksek çözünürlüklü bir analizini sunuyor.
Şekil 1 c ve dtasvir izole kalp ısı kontrollü bir odasında konumlandırılır. 1-Fransızca boyutu elektrot kateter SVC eklenen bir PE tüpünden RA yerleştirilir ve başka bir kalıcı PE tüp kalp odası üzerinde aşırı baskı önlemek için LV apex LV boşluğundan eklenir. Eşzamanlı ECG kaydı, katot (ECG kurşun [-]) cannulation iğneye bağlı ve anot (ECG kurşun [+]) Ventriküler apex eklenen PIN elektrot bağlı. Bu derleme herhangi bir mekanik hasar vermemek için kartı Kulakçık özelliğidir.
Membran gerilim değerlendirilmesi için Floresans di-4-ANEPPS kullanarak bir 10.000 kare/s örnekleme hızına (Şekil 2) ile kaydedilir. Harekete geçirmek harita sürekli pacing sırasında ra teslim alınır İyi eşleme küçük fare Kulakçık detaylı ve tel desende çözümleme sağlar.
Şekil 3 membran gerilimleri ve Ca2 + La ra sürekli pacing sırasında RH237 ve Rhod2AM kullanarak geçici temsilcisi izleri gösterir Biz 1000 kare/s ile mevcut ayarı Rhod2AM sinyal yeterli bir sinyal/noise oranı elde etmek için eşlemenin örnekleme hızını azaltın. Ancak, sistem aksiyon potansiyeli ve Ca2 + geçici arasındaki ilişkiyi analiz etmek için yeterli bir kalite sağlar.
O zaman patolojik bir koşul altında fare kullanarak programlanmış stimülasyon ile bir Atriyal taşiaritmi bir indüksiyon gerçekleştirmek. Şekil 4 sergileyen bir indüklenen optik bir kaydı bir fare atrium AT lekeli di-4-ANEPPS ile. Fareyi bir basınç aşırı atrium için 10 gün önce deney6uygulamak için bir transvers aort daralma yordam uğrar. Biz AT (120/100/100/80) pacing üçlü extrastimuli tarafından teşvik ve desteklemeyeceğini devre yayılmasını gözlemlemek.
Şekil 1. Optik haritalama sistemi. a. genel kurul Elektrofizyoloji/optik haritalama sistemi. b. şematik optik haritalama sistemi kompozisyon: mavi ok uyarma ışık ışık kaynağı tarafından oluşturulan gösterir. Objektif lens taret ile değiştirilebilir. Lekeli kalp verilmiş ışıktan kamera 1 ve kamera 2 arasında ikiye bölünmüş durumda. Kamera 1 membran gerilim için uzun dalga boyu sinyallerini algılar ve kamera 2 dalga boylarında 580 ± 20 nm bir bant filtre ile Ca2 + geçici için kaydeder. Yordamı sırasında EKG ve perfüzyon basıncı sürekli olarak kaydedilir ve ECG sinyali de aynı anda kayıt yazılımı optik eşlemeye içe aktarılır. c. hazırlık izole Kupa: kalpleri ile perfüzyon için artan aort yoluyla iğne körelmenin cannulated. Eşzamanlı ECG kayıtları için katot cannulation iğneye bağlı ve PIN elektrot ile anot ventrikül apex eklenir. ö. Cannulation tüp ve elektrotlar: kalp perfüzyon (cannulation iğne) için 21 lik körelmenin bir iğne ile cannulated. Elektrot (elektrot) uyarıcı bir 1-Fransızca boyutu üstün vena cava eklenen bir polietilen boru aracılığıyla Sağ atrium yerleştirilir. Cam Oda 37 ˚C odası boşluğunda dolaşan sıcak su tarafından ısıttı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Atrium'a da harekete geçirmek harita. a. temsilcisi aktivasyon haritalar ön görünümünde, bir 5 X objektif lens ve b. 1.6 X objektif lens ile arka görünümünde. (Sol paneli) Şematik izole kalp ve atrium. (Doğru kapı aynası) Di-4-ANEPPS 10.000 kare/s boyama ile Sol atriyum harekete geçirmek Haritası elde. Kayıt altında sürekli pacing Sağ atrium yerleştirilen uyarıcı elektrot ile gerçekleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Aksiyon potansiyeli ve Ca2 + geçici Sol atriyum içinde çift kayıt. a. izole kalp şematik. b. RH237 membran gerilim (Vm) ve Rhod2AM için Ca2 + geçici için kullanarak Sol atriyum floresan yoğunluğu temsilcisi görüntüsü. Kayıt 1000 kare/s. c. , 5 X objektif lens ile gerçekleştirilir Sağ atrium stimülasyon elektrot ile sürekli pacing sırasında aynı anda kayıt EKG (üst), RH237 sinyal (orta) ve Rhod2AM sinyal (altta). Siyah oklar stimülasyon sivri ve sarı ok ventrikül uyarma gösterir. Ventrikül bir ışık saçılım etkisi RH237 sinyal ve Rhod2AM sinyal hem de (sarı ok uçları) da görülebilir. ö. birleştirilmiş RH237 ve Rhod2AM iz yok. Aksiyon potansiyeli ve geçici Ca2 + değişiklikleri aynı anda kaydedilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Harekete geçirmek eşleme sırasında Atriyal taşikardi. (Sol paneli) Şematik izole kalp. (Orta paneli) Harekete geçirmek harita bir Atriyal taşikardi (AT) sırasında. AT üçlü extrastimuli Volta tarafından Sağ atrium teslim akımıdır. (Doğru kapı aynası) Sinüs ritmi aynı fare kalbinde sırasında harekete geçirmek harita. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Takıma giren filmi 1. Temsilcisi film di-4-ANEPPS ile boyama kullanarak Atrium'a da potansiyel membran. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Takıma giren film 2. Atriyal taşikardi ve sinüs ritim sırasında harekete geçirmek eşlemenin temsilcisi filmler. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Optik eşleme türleri çalışmak için kardiyak Elektrofizyoloji7köklü bir manevra ve Ventriküler Aritmiler8,9, hem de Atriyal olanlar değerlendirmek için oldukça yararlı bir araç10,11 . Aynı anda eşleme transmembran potansiyeli ve Ca2 + geçişler aritmiler kalp yetmezliği ya da diğer kalp hastalıkları12,13temel mekanizmaları anlamak için yararlıdır. Ne zaman diğer Elektrofizyolojik değerlendirme yöntemleri, bu bir tek hücre veya hücre yaprak kullanarak gibi karşılaştırma perfused kalbinde optik eşlemenin mutlak üstünlükleri sağlam atrium ve tel şeklinde değerlendirilmesi biridir ve ventrikül, sadece sırasında sinüs ritmi aynı zamanda bağlı aritmiler14sırasında. Fare Kalpler, özellikle atrium, insanlar bir vekil olarak kullanmak için bir girişim zorluk ana toprak dolay iden onların küçük büyüklük karşılaştı, ancak, genetik mühendisliğiyle hayvan değerlendirme açısından çekici bir deneysel model fare model ve bu sorunu aşmak gerekir. Yaklaşımımız bir yönde çözmek için sağlar.
Optik eşleme cihazlarımızı bütün fare kalpler15konvansiyonel sistem temelde benzer olsa da, bizim yöntem fare atrium bazı değişiklikler yaparak değerlendiren avantajına sahiptir. İlk olarak, yüksek kayma ve temporal çözünürlüğe kadar 0,1 ms/çerçeve ve 20 µm/piksel ve fare atrium iletim hızı ve yayılma desende daha hassas bir ölçüm katkıda bu yüksek çözünürlüklü eşleştirme elde etmek için takip etti. İkinci olarak, herhangi bir gereksiz mekanik hasarı veya olan Elektrofizyolojik özellikleri 16,17değiştirmek, atrium, streç önlemek için kalıcı bir iğne doğrudan LV Intra-odası basıncı azaltmak eklenir, o LA önceki gibi eklemek yerine15çalışma. Ayrıca, pacing uyarıcı işletim sistemindeki RA yerleştirilen özel yapılmış 1-Fransızca boyut elektrot kateter aracılığıyla teslim ama bir iğne elektrot tarafından hangi atrium zarar değil. Herhangi bir iğne Atriyal apendiks sabitleme hangi geçmiş çalışma15' te kullanıldığı kaçınılmalıdır. Üçüncü olarak, aritmiler temel mekanizması değerlendirme açısından, Atriyal tachyarrhythmias ikna etmek için programlanmış stimülasyon Protokolü çok önemli18,19yaşında. Veri bloğu pacing dahil olmak üzere klinik Elektrofizyolojik çalışmalar ve pacing, fare kalp için hız ayarlama aralığı bir değişiklik ile üçlü extrastimuli kadar programlanmış uyarılması için aynı gerçekleştiriyoruz. Böylece, temel ölçüm parametrelerin yanında protokol AT inducibility değerlendirmek olabilir. Gerektiğinde, AT inducibility isoproterenol veya diğer ilaçlar yönetimi ile değerlendirilir. Deneyim, vahşi tipi fareler çok az bile tam stimülasyon Protokolü sonra herhangi bir ATs göster. Böylece, AT inducibility Genetik mutasyonlar, cerrahi işlemler ve uyuşturucu11yönetimi gibi birçok patolojik durumlardan katkı değerlendirmek için önemli bilgiler olmalıdır. Bu değişiklikleri olduğu gibi fare atrium kesin Elektrofizyolojik değerlendirme optimize.
Bu yöntem aynı zamanda bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, en yüksek Uzaysal çözünürlük 5 X objektif lens ile kullanarak, görüş alanı (FOV) bir parçası atrium sınırlıdır (i.e. sadece sol atriyal apendiks olarak gösterildiği şekil 2a). Atrium büyük FOV elde etmek için bir 1.6 X objektif lens bazen tercih edilir (şekil 2b) olduğunu. Atriyal yüzeyi kavisli çünkü İkincisi, iğne ile atrium düzeltmeden, bazen doğru Atriyal iletim özelliklerini ölçmek zordur. Yani, biz pimleri tarafından tamir yerine düzleştirmek için yüzeyinde cam yerleştirilir. Bu yöntem ayrıca titreşimleri çözüm yapıdan hareket önlemek için yararlıdır. Üçüncü olarak, bizim yöntemi ile tüm FOV elde etmek oldukça zor, anterior ve posteiror görünümü düzgün kullanmak için daha Şekil 2' de gösterildiği gibi diğer yaklaşımı bizim yaklaşım-daha önemlidir. Ön görünüm avantaj dayanabilecek patolojik koşullarında, özellikle ek parça (şekil 4) söz konusu olduğunda açık gözlem olacaktır. Öte yandan, arka görünümü Atriyal posterior duvar iyi bir görünüm elde etme bir avantaja sahiptir ve miyokardiyal kol aktivitesinden tetikleme detaylı bir kayıt olabilir. Ne zaman zor uygun bir görünüm elde etmek için ve kavisli yüzeyi bizim yöntemiyle düzleştirmek için atrium pins tarafından en az gerilim ile sabit olabilir.
Bizim yöntemi ile 3 olası sorunlar, Boyama, pacing ve aritmi indüksiyon var. Başarısızlık, boyama yüklenmemişse veya hafif Floresans gözlenen, optik eşleme aparatı doğru şekilde monte edilir ve olup reaktif uygun şekilde saklanan ve kullanılan kontrol etmelisiniz. Perfüzyon çözüm durumunu da çok önemli, hangi da Elektrofizyolojik özellikleri kalp kendisi, yani, pH, sıcaklık, dahil olmak üzere çözüm durumunu etkileyebilir ve olup olmadığını kesinlikle izlenecek yeterli havalandırma vardır. Herhangi bir hava embolisi kalbinde önlemek önemlidir. Pacing uyaranlara atrium, heyecanlandırmak değil başarısızlık pacing için araştırmacılar kablolama devre test cihazı kullanarak doğru olup olmadığını kontrol etmelisiniz. Pacing uyaranlara doğru yüzdelik oluşturulduğu elektrot doku ile iletişim sorunudur. Elektrotlar yeniden konumlandırma sorunu çözebilirsiniz ve hız ayarlama kateter kullanarak bizim yaklaşım kolaylaştırır. Aritmi indüksiyon zorluk için RV Volta AT sınırlı bazı durumlarda indüksiyon için kullanılabilir. Hangi iki elektrot distal ve proksimal elektrotları RV ve RA, sırasıyla bulunabilir quadripolar elektrot kateter kullanarak, bu hız ayarlama site RA için karavana değiştirmek kolaydır Bu kateter eşzamanlı ventrikül etkinleştirme sinyal Atriyal uyarma sinyal maskeleri zaman ventrikül uyarma değişen için de yararlıdır.
Bu yöntem katkıda bulunacak genotip fenotip değerlendirmek için AF etkileşimlerde yeni özellikle hangi ile soruşturma başarısız tarafından diğer yaklaşımlar gösterileceğini genler için GWAS gibi çalışmalar roman tarafından bulunan genler ile ilgili. Aygıtlar ve teknikleri ilerleme ile AF20önemli kaynağıdır, pulmoner ven kol Elektrofizyolojik özellikleri Bu yaklaşımla sağlam kalbinde tespit edilebilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Program tarafından için ortam araştırma geliştirme için özel koordinasyon fonlar genç araştırmacıları teşvik bilim ve Teknoloji (SCF) (için T.S.), Grants-in-Aid için bilimsel araştırmalar (No. 16 K 09494, T.S., No. 26293052, desteklenir T.F. için) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT) Japonya'nın. Brainvision ve Bay Kenji Tsubokura teknik yardım için teşekkür ederiz ve biz de Bay John Martin onun dilsel yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
| Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
| Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
| Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
| Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
| Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
| Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
| Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
| BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
| LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
| Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
| 1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
| Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
| Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
| 24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
| 21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
| 25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
| 1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
| PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
| Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
| Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
| Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
| Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
| Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
| Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
| Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
| MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
| BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
| THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
| LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
| Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
| Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
| Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
| Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
| Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
| Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
| Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
| Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
| PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
| PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
| Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
| Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
| Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
| Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
| 0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
| aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |
References
- Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
- Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
- Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
- Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
- Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
- Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
- Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
- Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
- Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
- Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
- Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
- Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
- Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
