Overview
FM-Farbstoffe sind eine Klasse von fluoreszierende Moleküle, die wichtige Verwendung gefunden hat, bei der Untersuchung der Vesicle recycling-Prozess. Durch eine chemische Struktur können sich diese Moleküle in der äußeren Broschüre Phospholipid Bilayer Membranen einfügen. Nach Membran einsetzen werden sie in die Zelle über Endocytosed Vesikel verinnerlicht und freigegeben, wenn diese Bläschen zurück, die Membran recyceln. Da diese Farbstoffe fluoreszieren stark in die hydrophobe Umgebung innerhalb von Membranen und schwach in der extrazellulären Kompartiment, FM-Fluoreszenz-Ebenen können verwendet werden, um vesikuläre Aktivitäten während des recycling-Prozesses zu verfolgen.
Dieses Video bietet eine Einführung in die Verwendung von FM Farbstoffen in Experimenten Vesicle recycling untersuchen soll. Wir überprüfen zunächst die Biochemie des FM Farbstoffe und wie deren Eigenschaften erlauben ihre Verwendung in diesen Experimenten. Wir gehen dann durch ein allgemeines Protokoll für die Verwendung von FM-Farbstoffe in solchen Studien, und schließlich diskutieren einige neuere Forschungen, dass diese einzigartige Moleküle verwendet.
Procedure
FM-Farbstoffe sind Membran-Farbstoffe, die zum Bild Vesicle recycling weit verbreitet sind. Dies ist der Prozess, durch den eine Zelle Bläschen aus eigener Membran Zellengröße zu bewahren bildet, teure Proteine wiederverwenden und nacheinander transportieren Moleküle in den extrazellulären Raum. Dieser Prozess wird am häufigsten bei neuronalen Synapsen untersucht wo es die Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt ist. Neben der Prüfung Vesicle recycling, sind FM Farbstoffe verwendet, um mehrere andere Phänomene, wie z. B. Sekretion in chromaffin Zellen und Zellmembranen Reparatur nach Verletzung zu studieren.
Dieses Video konzentriert sich auf die Verwendung von FM-Farbstoffe in einem Experiment studiert Vesicle recycling. Wir gehen über eine Schritt für Schritt-Protokoll, die FM Farbstoffe verwendet, um den recycling-Prozess in stimulierte Nervenzellen zu quantifizieren. Zu guter Letzt werden wir einige Beispiel-Experimente, überprüfen die dieses einzigartige Molekül auf unterschiedliche Weise nutzen.
Vor dem Sprung in das Verfahren, betrachten wir zunächst die biochemischen Eigenschaften des FM-Farbstoffe, die uns ihre Funktion im Vesicle recycling Experimente zu verstehen helfen wird.
Strukturell, FM Farbstoffe sind Styryl-Moleküle, die ihren Namen von der Wissenschaftler abgeleitet, die sie synthetisiert — Fei Mao. Diese Farbstoffe haben drei wesentliche Strukturmerkmale: Kopf, Schweif und Brücke. Die Brücke besteht aus zwei aromatischen Ringen mit einer Variablen Doppelbindung Region zwischen ihnen. Dieser gesamte Abschnitt schafft das Fluorophor.
Es ist die Natur von jedem Fluorophor, dass wenn durch ankommende Licht bei einer bestimmten Wellenlänge der Erregung geschlagen, seine Atome die Energie absorbieren und seine Elektronen in einen angeregten Zustand erhöhen. Diese Elektronen zurück in den Grundzustand durch emittierende Energie schwingungsmäßig, und schließlich als Licht einer Emissionswellenlänge. Das hydrophobe Ende ermöglicht das FM-Molekül auf Partition in Lipid Bilayer der Zellmembran, und den hydrophilen Kopf hat eine Ladung, die seine Lokalisierung in der äußeren Membran Broschüre einschränkt.
Daher ist die einzige Möglichkeit, es in die Zelle gehen über Endozytose. FM-Farbstoffe sind akut empfindlich und zeigen schwache Fluoreszenz in polaren Lösungsmitteln, aber starke Fluoreszenz in hydrophobe Umgebung wie Membranen. So entstehen kontrastreiche Beschriftung Membran, die visualisiert werden können und quantifizierte mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Diese Eigenschaften machen FM Farbstoffe speziell geeignet, um Vesicle recycling an Synapsen zu beurteilen. Kurz, umfasst der Inkubation der Kulturen mit FM-Farbstoff. Einige der FM Moleküle erhalten Sie zu den Membranen, die ihre Fluoreszenz-Intensitäten erhöht angebracht. Als nächstes startet ein Reiz Internalisierung Membranverfahren. Daher einige FM-Moleküle in der Membran Vesikel gefangen sind, und der Rest der äußeren lokalisierte Farbstoffmoleküle werden weggespült.
Zweite Stimulation verinnerlichten gefärbten Vesikel verschmelzen mit der Zellmembran, deren Inhalte zu veröffentlichen, und der Farbstoff schnell departitions, was zu einem raschen Rückgang der Fluoreszenzintensität. Diese entfärben kann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops quantifiziert werden.
Nun, da Sie vertraut mit den biochemischen Prinzipien der FM Farbstoffe sind, betrachten wir ein Verfahren zum Durchführen eines Experiments Prüfung synaptischen Vesikel recycling mit diesen Farbstoffen.
Saubere, gesunde Proben von neuronalen Kulturen auf Deckgläsern sind im Voraus vorbereitet. Diese Zellen werden in einer Farbstofflösung FM, wodurch die Membranen zu etikettierenden verschoben. Die Probe-Deckglas wird dann auf der bildgebenden Kammer des Mikroskops montiert.
Um flüssige Manipulationen wie Waschungen, Fluid-Eingang und Ausgang zu ermöglichen sind Linien angebracht, um eine versiegelte Perfusion Kammer bilden. Montieren Sie die Kammer auf die Bühne ein Fluoreszenzmikroskop. Die Kammer beimessen Sie Drähte und verbinden Sie sie mit dem elektrischen Stimulator. Einmal befestigt, werden die Anregung und Emission Filter entsprechend der FM-Farbstoff verwendet festgelegt.
Farbstoff in den Vesikeln über Endozytose laden wird mit Hilfe einer elektrischen Stimulation induziert. Nach der Stimulation dürfen Nervenausgänge zu erholen. Dann wird die extrazelluläre Farbstoff mit Puffer abgewaschen; Dies minimiert auch die Hintergrundfluoreszenz. Es ist wichtig, die Intensität der Erregung minimum zu beschränken, weil FM Farbstoffe sind anfällig für Immunofluoreszenz, die Fluoreszenz-Intensität aufgrund längerer Erregung schwächer wird. Nach der kurzen Inkubation werden Anfangsbilder gewonnen. Als nächstes wird mit einem zweiten elektrischen Signal Exozytose induziert.
Nach der Messung der Fluoreszenz zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation, am Ende, können Nervenausgänge erschöpfend stimuliert werden, alle lösbaren Farbstoff zu entladen. Die danach verbleibende Fluoreszenz gilt als der Hintergrund Fluoreszenzintensität. Dann wird intrinsische Fluoreszenz eines jeden Bildes gemessen mit dem Tool "Region of Interest" in einer nicht-synaptischen Bereich des Bildes. Die Hintergrundfluoreszenz und die intrinsische Fluoreszenz ist dann zum Abtragen von der Fluoreszenzintensität jeden Zeitpunkt normalisierte Fluoreszenzintensität zu erhalten, die dann über der Zeit aufgetragen wird. Der Rückgang der Intensität im Laufe der Zeit stellt Entfärben, das ist eine indirekte Messung von Vesicle recycling.
Nun, da wir die Methodik überprüft haben, schauen Sie wie FM Farbstoffe in bestimmten Experimenten verwendet werden.
Wir diskutierten das Protokoll mit FM Farbstoffe in stimulierte Nervenzellen. Hier interessierten Wissenschaftler studieren, spontane Vesicle recycling. Sie taten dies mit dem etablierten Protokoll in Kombination mit ein bildgebendes System empfindlich genug, um kleine Änderungen in der Fluoreszenzintensität erkennen. Die Ergebnisse stellen einen Rückgang der Fluoreszenzintensität, die direkt durch spontane synaptischen Freisetzung ist.
Innerhalb des präsynaptischen Neurons Vesikel gliedern sich in zwei Pools: einen Reserve-Pool oder RP, und einen leicht lösbaren Pool RRP. Hier verwendeten die Wissenschaftler FM Farbstoffe, um den Anteil der einzelnen Arten in der Vesikel-Bevölkerung zu analysieren. Diese Wissenschaftler konnten durch sequentielle Anwendung von elektrischen Reizen der zunehmenden Intensität die relativen Anteile der einzelnen Arten von Vesikel Pool zu quantifizieren.
Zu guter Letzt Zellbiologe auch FM Farbstoffe um Faktoren bei der Exocytic-Reparatur von Verwundeten Plasmamembranen zu sezieren. In diesem Experiment konzentrierten sich die Forscher besonders über die Rolle der Sphingomyelinase, ein Lipid-modifizierende Enzym, das in der Membran resealing Prozess. Zuerst erzeugt sie Zellen einen Mangel an Enzyms Sphingomyelinase mit Hilfe der RNA-Behandlung zum Schweigen zu bringen. Als nächstes behandelt sie diese Zellen und einer Kontrollgruppe mit exogenen FM Farbstoff und ein Toxin, die schafft der Plasmamembran Läsionen. Schließlich sahen sie alle Proben, die mit einem konfokalen Mikroskop. Die Ergebnisse zeigten, dass Sphingomyelinase mangelhaft Zellen robuste Anhäufung von intrazellulären FM Moleküle zeigten. Auf der anderen Seite zeigte Kontrollzellen minimal FM Zustrom, was eine Rolle Sphingomyelinase in der Plasmamembran Reparatur.
Sie haben nur Jupiters Video auf FM Farbstoffe im Vesicle recycling angesehen. Das Video beschrieben die Biochemie des FM-Farbstoffe, detaillierte ein Protokoll zum Färben und synaptischen Vesikel recycling zu quantifizieren und schließlich skizziert aktuelle Experimente unter Verwendung dieser Farbstoffe in unterschiedlicher Weise. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
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