Summary
Este protocolo describe las diferentes técnicas necesarias para microscopía electrónica de transmisión como tinción negativa, seccionamiento ultrafino para estructura detallada y etiquetado para determinar las posiciones de proteínas específicas en exosomas de inmuno-oro.
Abstract
Exosomas son tamaño nanométrico vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporales y son conocidos para representar las características de las células que segregan les. El contenido y la morfología de las vesículas de secreción reflejan comportamiento celular o estado fisiológico, por ejemplo el crecimiento celular, migración, escote y la muerte. Papel de los exosomas altamente puede depender de tamaño y el tamaño de exosomas varía de 30 a 300 nm. El método más ampliamente utilizado para la proyección de imagen de exosomas es Tinción negativa, mientras que otros resultados se basan en microscopía electrónica de crio-transmisión, microscopía electrónica y microscopía de fuerza atómica. Morfología de los exosomas típico evaluado mediante tinción negativa es una forma de Copa, pero más detalles no están claros. Un exosomas bien caracterizados a través del estudio estructural es particularmente necesario en campos médicos y farmacéuticos. Por lo tanto, morfología dependiente de la función debe ser verificada mediante técnicas de microscopía electrónica como una proteína específica en la estructura detallada de exosomas de etiquetado. Para la observación detallada de la estructura, se compararon imágenes seccionados ultrafinos y negativa teñida de exosomas. En este protocolo, sugerimos microscopía electrónica de transmisión para la proyección de imagen de exosomas como tinción negativa, todo Monte inmuno-tinción, preparación de bloque, sección delgada y etiquetado inmuno-oro.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EVs) son vesículas bicapa de lípidos secretadas por las células y su tamaño oscila entre 30 y 300 nm. EVs primero fueron divulgado en 1978, con la evidencia de las vesículas de los pacientes con enfermedad de Hodgkin1. Estas vesículas se informaron que 40 a 120 nanómetros de tamaño. En 1980, se informó que EVs están involucrado en el sistema de coagulación y trombosis, formación de un coágulo de sangre dentro de un vaso sanguíneo en los pacientes de cáncer2. Después de 30 años, EVs se han divulgado para ser un factor importante para promover la invasión del tumor, escape inmune y angiogénesis3. Además, las funciones de los vehículos eléctricos han sido estudiadas como reguladores de las interacciones celulares en las áreas de inflamación, desorden inmune, enfermedades neurológicas y cáncer4. Ya EVs contienen biomoléculas específicas como proteínas, mRNA y microRNA5, su potencial aplicación en el diagnóstico y la terapéutica ha sido analizado6,7. EVs es una categoría conformada por subgrupos incluyendo exosomas prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartículas, promininosomes, argosomes y vesículas de exosomas-como, según su origen celular y función biológica3. Además, basado en su biogénesis, estos EVs pueden dividirse en microvesículas (vertiente microvesículas, 100-1000 nm) y exosomas (30-300 nm)8,9. Entre estos, los exosomas se ha divulgado como un comunicador celular respuesta inmune10, cáncer11,12y13de enfermedades infecciosas.
Interés en los exosomas como un biomarcador para el diagnóstico precoz está aumentando rápidamente, y la purificación y caracterización de exosomas deben ir acompañados de las técnicas de imagen moleculares. Los diferentes tamaños y morfologías de exosomas, dependiendo de su origen y función14, pueden distinguirse por técnicas de microscopía de alta resolución, tales como microscopia electrónica. Mayoría de exosomas fueron visualizados por tinción negativa la microscopia electrónica de transmisión (TEM)15,16,17, y estos resultados fueron confirmados por inmunomarcación de una proteína específica en Monte toda vesícula 18. varios grupos de investigación han divulgado la estructura a través de microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica19,20y crio-TEM21,22. Sin embargo, aunque estas técnicas son útiles para estudiar la estructura de exosomas, que son insuficientes para observar la posición de las proteínas específicas ubicadas dentro de los exosomas. Por lo tanto, hemos introducido un protocolo de exosomas con una proteína específica etiquetado de la imagen. Aplicamos el bloque preparación, seccionamiento ultrafino y el immunostaining para determinar la ubicación detallada de la proteína en los exosomas. Esto se comparó con tinción negativa y todo immunostaining de Monte, que se utiliza tradicionalmente para la caracterización de los exosomas.
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Protocol
1. bloque preparación, corte, coloración y proyección de imagen de los exosomas
- Los exosomas de sobrenadante de cultivo de células HCT116 de pellets por centrifugación a 100.000 x g durante 1,5 h23. Quite el sobrenadante del cultivo y cuidadosamente la pelotilla de exosomas purificada con 1 mL de glutaraldehído al 2.5% en solución de cacodilato de sodio de 0.1 M (pH 7.0) por 1 h a 4 ° C. De cacodilato de sodio de 0.1 M, disolver ácido cacodílico 4,28 g en 160 mL de agua destilada (DW). Ajustar el pH a 7,4 con 0.1 M HCl luego realizar hasta 200 mL con agua destilada.
- Retirar el fijador y lavar el pellet con 1 mL de buffer de cacodilato de sodio de 0,1 M a temperatura ambiente. Repetir tres veces con cada cambio dura 10 minutos.
- -Fijar las muestras con 1 mL de tetróxido de osmio 2% durante 1 h a 4 ° C.
- Retirar el fijador y el enjuague tres veces con cacodilato de sodio de 0.1 M tampón cada 10 minutos.
- Incubar por 10 min con una serie graduada de acetona (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectivamente) en el agitador.
- Eliminar la acetona e incubar la solución de mezcla empotrable de 3:1 acetona: baja viscosidad durante 30 minutos. El diábolo de exosomas está en el tubo.
- Quitarlo del medio y añadir 1:1 acetona: baja viscosidad empotrar mezcla media, luego incubar por 30 min.
- Quitarlo del medio y añadir 1:3 acetona: baja viscosidad empotrar mezcla media, luego incubar por 30 min.
- Quite el medio y añadir 100% baja viscosidad mezcla de incrustación e incubar durante una noche a temperatura ambiente.
- Embeber la muestra en pura baja viscosidad incrustación de mezcla con el molde y cocer al horno empotrar durante 24 h a 65 ° C.
- Prepare secciones con espesor de nm 60 a través de un ultra micrótomo.
- Doble tinción con acetato de uranilo 2% por 20 min y llevar citrato durante 10 minutos.
Para la solución de plomo de Reynolds, añadir 1,33 g de nitrato de plomo y 1,76 g de citrato de sodio a un total de 50 mL de agua destilada. - Observar la cuadrícula bajo microscopía electrónica de transmisión 80 kV.
- Haga clic en "Adquirir" y haga clic en "Archivo" y "Guardar como" en el sistema de cámara bajo el microscopio electrónico de 80 kV. Siguen ajustes automáticos para el tiempo de exposición.
2. inmuno-tinción de secciones y la proyección de imagen (figura 1)
- Cortar secciones ultradelgadas de 60 nm usando un micrótomo de ultra y recoger en la red de níquel.
- Incubar las rejillas en gotas de 50 μl de 0.02 M de glicina por 10 min calmar los grupos aldehído libres.
- Enjuague en 100 μL de DW tres veces cada uno durante 10 minutos incubar a temperatura ambiente durante 1 h en PBS con 1% de BSA.
- Incubar rejillas en 50-100 gotas de μl de anti KRS anticuerpo24 (1: 100 en PBS con un 0.1% de BSA) durante 1 h (si es necesario, que este paso debe llevarse a cabo a 4 ° C durante la noche.)
- Lave las rejillas con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS con un 0.1% de BSA durante 10 minutos.
- Rejillas de transferencia con gotas de 2nd anticuerpo para 1 h (anti-conejo IgG conjugada con partículas de oro nm 10 (1: 100) en PBS con un 0.1% de BSA).
- Lave las rejillas con cinco separan gotas (50 μL) de PBS con un 0.1% de BSA cada 10 minutos.
- Doble tinción con acetato de uranilo 2% durante 20 minutos bajo condiciones de oscuridad y citrato de plomo de Reynold durante 10 min, respectivamente.
- Haga clic en "Adquirir" y haga clic en "Archivo" y "Guardar como" en el sistema de cámara bajo un TEM a 80 kV. Tiempo de exposición había seguido de ajustes automáticos.
Figura 1: proceso de preparación de la muestra y el immunostaining. (A) doble fijo exosomas se deshidrata y se infiltraron con baja viscosidad, incrustación de resina de mezcla. (B) resina, incrustación. (C) sección ultra delgada con cuchilla de diamante. (D) instalación de etiquetado inmuno-oro. Las rejillas con las secciones ultrafinas se ponen en las gotitas líquidas en un parafilm, que se coloca con la toalla de papel húmeda. Cada sección es incubada con gotitas de anticuerpo de 50-100 μl, luego lavado con tampón. (E) doble tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo. La tapa se cubre con papel de aluminio para la tinción de metales pesados. (F) solución de tinción se elimina por el filtro de papel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Tinción negativa
- La película de formvar/carbón fino de descarga del resplandor cubrió 200 rejillas de malla de cobre EM durante 1 minuto por descargador de resplandor.
- Fijar exosomas purificada con 1 mL de 2% paraformaldehido (PFA) durante 5 minutos.
PRECAUCIÓN: Los vapores de paraformaldehido son tóxicos. Todo trabajo debe hacerse de una campana ventilada. - Solución de suspensión 5-7 μl exosomas en la parrilla de carga e incubar durante 1 minuto. Si la concentración de exosomas es demasiado alta, diluir la concentración a 1/2 - 1/5.
- Inmediatamente la mancha con el ~ 20 gotas de filtrado solución al 1% uranilo acetato (UA) en la superficie de la rejilla de EM por jeringa.
- Retire el exceso de solución UA en la parrilla poniéndose en contacto con el borde de la rejilla con papel de filtro.
- Enjuague rápidamente la rejilla con una gota de agua. Este paso eliminará el exceso de tinción solución.
- Coloque la rejilla sobre la mesa sujetando con las pinzas y cubrir la cuadrícula parcialmente con una placa de cultivo se seque durante 10 minutos en temperatura ambiente.
- Almacenar la red en una caja de rejilla de EM para futura observación por un TEM a 80 kV.
4. todo montaje para la inmunotinción
- La película de formvar/carbón fino de descarga del resplandor cubrió 200 rejillas de malla de cobre EM 30 s.
- Fijar exosomas purificada con 1 mL de 2% paraformaldehido (PFA) durante 5 minutos.
PRECAUCIÓN: Los vapores de paraformaldehido son tóxicos. Todo trabajo debe hacerse de una campana ventilada. - 5-7 μl solución de exosomas fijo en la parrilla de carga e incube durante 5 minutos enjuague con 100 μl de PBS tres veces cada uno durante 10 minutos.
- Tratamiento de rejillas con 50 μl de 0.05 M de glicina por 10 min calmar los grupos aldehído libres.
- Transferencia de rejillas a una gota de solución amortiguadora de bloqueo (PBS con 1% BSA) durante 30 minutos.
- Incubar rejillas con 50-100 μl anti anticuerpo PD-L1 (1: 100 en PBS con un 0.1% de BSA) durante 1 h (si es necesario, que este paso debe llevarse a cabo a 4 ° C durante la noche).
- Lavar la rejilla con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS con un 0.1% de BSA durante 10 minutos.
- Transferencia de red a una gota de anticuerpo dend 2 durante 1 hora.
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Representative Results
En la actualidad, exosomas se clasifican en categorías de tamaño y forma por microscopía electrónica de transmisión. La figura 2 muestra negativa teñida de exosomas y etiquetada inmune exosomas en el Monte todo Estado. La figura 3 muestra los exosomas seccionado y el inmuno-etiquetado exosomas después de secciones delgadas. Tinción de inmuno-oro utilizando anticuerpos de proteínas específicas se usa positivamente un exosomas de identificar y clasificar los tipos de proteínas en los exosomas. El protocolo en este artículo utiliza todo immunostaining de Monte y el immunostaining con plástico seccionado exosomas.
Figura 2: negativo Monte inmuno-tinción tinción y todo. (A) morfología de exosomas se observa por la coloración negativa. Exosomas muestran su morfología en forma de copa. (B, C) Todo Monte inmuno-oro tinción muestra la ubicación de una proteína específica (anti humano CD274; PD-L1) en exosomas. Las flechas blancas indican la localización del oro. Las flechas negras indican la ubicación de la señal de fondo. (D) control de resultado de immunostaining negativo. Control de isotipo fue utilizado por el anticuerpo primario en este proceso de inmunotinción. Barra de escala = 100 nm.
Figura 3: micrografía electrónica de exosomas seccionadas. Morfología de forma redonda de exosomas (A) . (B) caja exosomas utilizando la herramienta "boxer" en programa de EMAN. (C, D) Inmuno-oro etiquetada exosomas con la coloración de metales pesados. Flechas negras indican las partículas de oro (A – D) escala de la barra = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo presenta un protocolo para observar la estructura de los exosomas detallada y etiquetado de sus proteínas específicas. Tinción negativa ha sido considerado como el mejor método de exosomas imagen17. Esta técnica convencional ha mostrado estructura en forma de Copa de exosomas. Sin embargo, esta forma de la taza es la forma del artefacto que puede ocurrir debido al proceso de secado. Crio-TEM resultados han mostrado que los exosomas tienen una estructura perfectamente esférica en solución acuosa25,26. La técnica de crio-TEM es un método muy de gran alcance para examinar la estructura natural, pero es difícil aplicar el método de inmuno-oro. Raso y sus colaboradores, señalados secado en el método convencional (todo Monte-negativas tinción) dio lugar a una morfología en forma de copa. En este estudio, el método estándar para la preparación de la célula (rutina EM; fijación, deshidratación, incrustación y seccionamiento) se aplicó para reducir los exosomas efecto de secado. La rutina de EM con incrustación de plástico puede evitar o reducir objetos (cambios en volumen y forma) causados por la desnaturalización. Para la fijación química, glutaraldehído (GA) fue utilizado para el cross-linking (interacciones covalentes entre grupos amino). Generalmente, el tetróxido de osmio (OsO4) se utiliza para la fijación de lípidos así como contraste mejorado.
En este estudio, Tinción negativa ayudó a confirmar la morfología típica de exosomas que ha sido reportado en anteriores documentos21,27,28,29. Además de tinción negativa, bloque de seccionamiento es también un buen método para la observación de exosomas (figura 2). Mientras que imágenes seccionadas demostraron la estructura interna de exosomas, en contraste negativo TEM manchado demostró principalmente la superficie de los exosomas. En imágenes seccionadas (figura 3), las vesículas mostraron la estructura de luz que se conoce como una característica estructural de exosomas30. En este protocolo, se utilizaron bloque de seccionamiento, inmuno-tinción y proyección de imagen de TEM. Especialmente, el bloque de seccionamiento es útil para el análisis en un momento posterior cuando las imágenes pueden ser en diferentes aumentos para la técnica de microscopía diferentes y para otros análisis como el etiquetado de inmuno-oro. Después de seccionar, secciones de la red pueden guardarse en la caja de la rejilla, que puede utilizarse para la inmuno-tinción para clasificación de exosomas. Por ejemplo, detectamos los exosomas conocidos marcadores14 en los exosomas aislados para el estudio de las funciones de exosomas.
Métodos de etiquetado de immunogold tienen algunas dificultades técnicas, no incluyendo ningún etiquetado o etiquetado de fondo alto. Cuando no experimentamos etiquetado, recomendamos comprobar la concentración de anticuerpo primario y tiempos de incubación primario. En el caso de baja concentración de anticuerpos primarios, titulación de anticuerpos puede ser útil para encontrar el immunoreactivity optimizado. También puede ser útil aumentar los tiempos de incubación a 4 ° C durante la noche. Por el contrario, si la concentración del anticuerpo primario es demasiado alta o el tiempo de incubación es muy largo en la temperatura alta, la señal de fondo aumentará.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Bio & programa de desarrollo de tecnología médica de la Fundación Nacional de investigación (NRF) & financiado por el gobierno de Corea (MSIP & MOHW) (Nº 2016M3A9B6904244). También agradecemos a los miembros del centro de investigación de Bioconvergence de plantas medicinales para la purificación de exosomas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
